绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
导航
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 34
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 675 条结果
[硕士论文] 汪沛
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  牙周炎是影响口腔健康导致失牙的主要原因,传统的治疗方案仅能改善牙周环境难以修复牙周炎引起的牙槽骨缺损。牙周组织工程通过构建细胞和多种材料的复合体并移植于牙槽骨缺损处,起到重建牙周组织、治疗疾病的作用。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周膜中具有自我增殖与多向分化潜能的干细胞,运用于牙周组织工程可显著增强牙周组织的形成和修复能力。骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins-9,BMP9)是优秀的成骨生长因子,已证实其具有较好的促干细胞成骨分化的能力,但对其作用机制尚不明确。有学者提出BMP9的作用机制包含Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins,Smads)传递信号为主的BMPs-Smad经典通路,以及通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)传递信号的BMPs-MAPK非经典途径,其中BMPs-Smad经典通路已获得学术界普遍认可,但对于BMPs-MAPK途径尚处于探索和初级研究阶段。MAPK通路下游底物与骨生长发育并没有直接关系,但有研究报道部分MAPK家族成员参与BMPs促成骨分化,因此猜测MAPK是通过串话其他通路参与BMPs诱导成骨的过程。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)作为MAPK家族重要成员,尚没有在BMP9促进成骨分化的作用和机制中有研究报道。此前有学者证实JNK与Smad2/3蛋白可以发生相互作用,这为两条通路的串话提供了前提,但是目前为止,尚未有JNK通路和Smad2/3通路在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中是否发生串话以及如何发生串话的文献报道。为了明确JNK通路是否在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用,以及JNK通路是否串话Smad信号通路,如何进行串话等问题,本项课题将深入研究讨论。
  研究方法:
  1.从牙周膜组织中通过改良组织块贴壁法获取离体细胞,通过CD146免疫磁珠分选获取PDLSCs,之后进行细胞表面标志物鉴定、组织来源鉴定、成骨分化和成脂分化能力鉴定。
  2.构建过表达Ad-BMP9载体,检测其对PDLSCs合适的感染剂量(multiplicities of infection,MOI)后诱导PDLSCs成骨分化,检测BMP9、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙蛋白(osteoclain,OCN)等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性等指标,分析BMP9促进PDLSCs成骨分化的能力。
  3.通过SP600125和AdR-si-JNK抑制或干扰JNK通路,验证干扰效果后,检测Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标,判断JNK通路是否参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化。通过抑制或干扰JNK通路,检测Smad2/3和p-Samd2/3的蛋白表达,判断JNK通路是否与Smad通路有密切关系,最后通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测p-JNK是否与Smad2/3发生反应。综合分析后,判断JNK通路是否串话Smad通路并在BMP9诱导PDLSCs成骨分化过程中发挥作用。
  4.向裸鼠肌肉内移植过表达BMP9的PDLSCs,使用腺病毒干扰JNK通路,通过影像学和HE染色对比未干扰JNK通路裸鼠异位成骨状态,鉴定分析JNK通路对BMP9诱导PDLSCs体内成骨的影响。
  研究结果和结论:
  1.经磁珠分选所得的细胞同时表达CD146阳性和STRO-1阳性比例约占27.9%;免疫荧光染色显示角蛋白阴性、波形蛋白阳性,表示细胞为中胚层来源的间充质细胞,且无外胚层来源细胞的污染;茜素红S染色和油红O检测表明分选后细胞具有成骨和成脂的多向分化潜能。
  2.荧光表达显示Ad-BMP9感染PDLSCs的MOI值为30-60,感染之后BMP9基因蛋白明显增高,表明构建的腺病毒有效;此外Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白和ALP活性均较对照组明显增高,结果具有统计学意义,证明BMP9具有诱导PDLSCs成骨分化的作用。
  3.分别抑制或干扰JNK通路后,p-JNK蛋白表达下降,证实JNK通路受到影响;干扰之后Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表达情况和ALP活性、钙盐结节沉积量等指标均有不同程度下降,结果具有统计学意义,表明JNK通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化;此外p-Smad的蛋白也随着JNK通路被干扰而表达下降,证实JNK通路与Smad通路关系密切,最后通过Co-IP检测证实p-JNK和Smad2/3存在相互作用,结果表明JNK通路是通过串话Smad通路参与BMP9诱导PDLSCs成骨分化的过程。
  4.影像学结果显示,添加干扰JNK通路的BMP9诱导PDLSCs体内成骨模型,所形成的异位骨或骨样组织的体积和骨密度均小于未经干扰的裸鼠;HE染色显示干扰组成骨进程处于早期,并落后于未经干扰的组,结果与体外结论类似,这表明JNK通路是BMP9诱导PDLSCs体内成骨分化的重要途径,但不是唯一途径。
[博士论文] 应王贵
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  颞下颌关节紊乱病(TMD)是一类临床症状表现为颞下颌关节区疼痛、异常关节音或伴有下颌运动功能障碍的一组疾病的总称,正常人群中发病率为20%-40%,是口腔科常见病、多发病之一。其发病与生理、社会、心理因素相关,但其病因及发病机制仍未阐明。颞下颌关节骨关节炎(TMJ OA)是TMD的一个重要类型,发病率约为25%,是一类主要累及颞下颌关节髁突软骨、滑膜及软骨下骨的以关节软骨和软骨下骨质改变为主要特征的器质性病变疾病。TMJ OA的发生与IL-1β、TNF-α、IL-6等细胞因子及Notch等信号通路有着密切的关系。
  其中,IL-1可能是在众多炎性细胞因子中的一个核心因子。IL-1是一种重要的促炎细胞因子,由IL-1α与IL-1β两种蛋白质组成,可与IL-1受体结合,从而激活下游炎性通路。其作为炎症的始动因子,在软骨细胞炎症反应和细胞凋亡过程中起到关键作用。IL-1β可能通过刺激TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎性细胞因子的分泌和抑制胶原蛋白、TIMPS等的合成来干扰关节软骨细胞代谢,促进细胞分解代谢,显著抑制软骨细胞合成基质,使软骨细胞变性及细胞外基质降解,引发关节炎症和破坏,是造成颞下颌关节器质性损害的一种重要炎性介质。
  Notch信号通路由受体、配体、细胞内效应分子、其他的效应物和Notch的调节分子等组成,在多种组织细胞的生长、分化、增殖、凋亡中起着重要作用。Notch信号通路对软骨形成、软骨细胞的存活、骨重建、维持关节软骨细胞表型及调节软骨基质代谢中起关键作用,其调节异常可导致骨性关节炎。Notch信号分子在健康成熟的关节软骨中几乎消失,但是在受损的软骨中却可检测到高水平的Notch信号分子表达,但是,目前仍未明确Notch信号通路在软骨病变中的作用机制。
  本次研究通过建立Spraguee Dawley大鼠(SD大鼠)颞下颌关节软骨细胞的体外模型,使用IL-1β对软骨细胞进行诱导刺激,采用Notch1抑制剂(Notch1siRNA)抑制Notch1信号通路的表达。通过实时定量RT-PCR、蛋白质印迹分析(WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)对软骨细胞Notch1蛋白及mRNA、ICAM-1蛋白及mRNA、iNOS蛋白及mRNA、NICD、MMP-1、MMP-9、TIMP-1、磷酸化NF-кB p65及细胞核、细胞质中NF-кB p65蛋白的表达和软骨细胞TNF-α、IL-6的分泌水平进行检测。讨论分析Notch1信号通路在IL-1β诱导的颞下颌关节软骨细胞的炎症反应中的作用,为TMD/TMJ OA的临床治疗提供新的研究思路。
  方法:
  本实验采用从SD大鼠颞下颌关节分离提取的髁突软骨细胞,进行细胞培养、传代,并根据施加不同干扰因子及检测指标将实验分成5部分:
  1.实验一实验细胞分为空白对照组、PBS组(阴性对照组)、1L-1β刺激组,通过实时定量RT-PCR、WB分别检测软骨细胞Notch1mRNA、Notch1蛋白、NICD蛋白的表达;
  2.实验二实验细胞分为空白对照组、Notch1siRNA组、Notch1Si-NC组(阴性对照组),通过实时定量RT-PCR、WB分别检测软骨细胞Notch1mRNA、Notch1蛋白的表达;
  3.实验三实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1siRNA+IL-1β组、Notch1Si-NC+IL-1β组(阴性对照组),通过ELISA检测软骨细胞分泌的TNF-α和IL-6,通过实时定量RT-PCR检测、WB分别检测软骨细胞ICAM-1mRNA、iNOS mRNA和ICAM-1蛋白、iNOS蛋白的表达;
  4.实验四实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1siRNA+IL-1β组,通过WB检测软骨细胞MMP-1、MMP-9、TIMP-1;
  5.实验五实验细胞分为空白对照组、IL-1β刺激组、Notch1siRNA+IL-1β组,通过WB检测软骨细胞磷酸化NF-кB p65及细胞核、细胞质中NF-кB p65蛋白的表达。
  结果:
  1.IL-1β上调了软骨细胞Notch1与NICD的表达;
  2.Notch1siRNA可降低软骨细胞Notch1的mRNA及蛋白表达;
  3.抑制Notch1信号通路可降低IL-1β诱导的软骨细胞TNF-α,IL-6的分泌水平和ICAM-1、iNOS的mRNA及蛋白表达水平;4.抑制Notch1信号通路可减轻IL-1β诱导的软骨细胞MMPs与TIMP-1的表达失衡;
  5.抑制Notch1信号通路可抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-кB p65核易位及磷酸化。
  结论:
  IL-1β可诱导SD大鼠颞下颌关节软骨细胞Notch1、NF-кB信号通路的激活表达,引起软骨细胞的炎症反应及细胞外基质降解。Notch1siRNA可抑制软骨细胞Notch1信号通路的激活表达,部分抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-кB信号通路的激活表达。抑制Notch1信号通路可减轻IL-1β诱导的大鼠颞下颌关节软骨细胞的炎症反应程度,为临床治疗TMJ OA提供一定的理论依据。
[硕士论文] 焦洛莹
化学工程 广东工业大学 2017(学位年度)
摘要:慢性根尖周炎是一种以厌氧菌感染为主的混合感染性疾病,其主要感染菌为具核梭杆菌和Solobaccterium moorei等。慢性根尖周炎破坏根尖周的牙槽骨或形成肉芽肿,具有容易复发、难以根治的特点,给人们的生活和工作带来诸多不便和麻烦。
  目前,治疗慢性根尖周炎主要通过常规根管治疗的方法,但该法操作繁琐、价格昂贵且治疗不彻底。因此寻找一种更为安全、有效的方法变得非常重要。近年来人们发现,利用IgY技术产生的抗特定病菌的抗体,能够治疗由致病菌感染引起的疾病,并且具有安全无残留、价格便宜等优点,具有很大的开发前景。
  本研究以灭活的具核梭杆菌、Solobaccterium moorei和两种菌的混合菌分别作为免疫原,免疫产蛋母鸡,共免疫五次。先用两步PEG6000沉淀法提取得到IgY粗品,再用硫酸铵盐析法纯化制得IgY纯品。然后用考马斯亮蓝染色法检测蛋白含量,用SDS-PAGE凝胶电泳法检测抗体分子量及纯度,用间接酶联免疫吸附法检测抗体效价和交叉反应,用免疫印迹法和间接荧光免疫分析法检测抗原抗体的特异性结合,并对IgY的热稳定性、酸碱稳定性、反复冻融稳定性以及对消化酶的稳定性进行了研究,最后研究了特异性IgY的抑菌活性以及交叉抑菌活性。
  实验结果显示抗具核梭杆菌IgY、抗Solobaccterium moorei IgY和抗混合菌的复合IgY的纯度分别可达到98.0%、97.8%、97.1%,它们的效价分别可达到1:32000、1:32000、1:16000,均能维持三周左右。免疫印迹分析和间接荧光免疫分析表明,特异性IgY能分别与抗具核梭杆菌和Solobaccterium moorei特异性结合。用酶联免疫吸附法检测发现特异性IgY的交叉反应较弱。稳定性的结果分析表明,IgY在温度低于75℃、pH值在4-9范围内能保持较好的的稳定性。在模拟胃液环境中,IgY对胃蛋白酶十分敏感,而在模拟肠道环境中IgY对胰蛋白酶有较好的的抵抗力。抑菌实验表明,抗具核梭杆菌IgY能够显著抑制(P<0.05)具核梭杆菌的生长,抗Solobaccterium moorei的IgY能够显著抑制(P<0.05)Solobaccterium moorei的生长,抗两种混合菌的复合IgY对具核梭杆菌和Solobaccterium moorei均有抑制作用(P<0.05)。
  在本实验中,制备了抗具核梭杆菌IgY、抗Solobaccterium moorei的IgY以及抗具核梭杆菌和Solobaccterium moorei混合菌的复合IgY。其特异性强、纯度高。此外,特异性IgY能在体外与对应病原菌发生特异性结合,并对其有较好的抑制作用。本研究为特异性IgY在慢性根尖炎的防治应用奠定了基础。
[硕士论文] 惠婷
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分神经肽P物质对ST2细胞增殖分化的影响
  目的:
  初步探讨神经肽P物质(Neuropeptide substance,SP)对ST2细胞成骨分化过程中增殖和分化的影响,并筛选出合适的促增殖分化的SP作用浓度和时间。
  方法:
  将第三代(P3) ST2以5×103/孔铺板于96孔板,用含有不同浓度SP(10-10Mol/L、10-8Mol/L、10-6Mol/L、10-5Mol/L)的成骨条件培养基(Osteoblast Medium,OBM)进行刺激,以仅含2%胎牛血清(FBS)的OBM作为对照组(control),每组设5个复孔和1个调零孔。分别以SP刺激ST2细胞24、48、72h,CCK-8检测细胞增殖活性,筛选出合适的药物浓度。然后取第三代(P3)的ST2按8×104/孔密度铺板于6孔板,加入含有10-6Mol/L浓度SP的OBM,培养1,3,5,7天,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immune sorbentassay,ELISA)检测细胞培养上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(ColIaⅠ)和骨钙素(osteocalcinv,OCN)的表达,实验重复3次。并采用免疫荧光染色检测细胞ALP的活性。
  结果:
  (1)神经肽P物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠BMSCs(ST2细胞)的增殖活性,且与SP的浓度和作用时间有一定的相关关系,当SP浓度为10-6Mol/L时,细胞增殖效应最明显。
  (2)神经肽P物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠BMSCs(ST2细胞)的成骨分化,早期成骨分化标记物ALP的表达在第5天时达峰值,中晚期标志物ColIaⅠ、OCN的表达在第7天时最高。SP可增强ST2细胞ALP的活性。
  结论:
  神经肽P物质(Neuropeptide substance,SP)可促进小鼠BMSCs(ST2细胞)的增殖和成骨分化,该效应具有剂量依赖性和时间依赖性。
  第二部分 BMP信号通路对SP促ST2细胞成骨分化过程的调控作用研究
  目的:
  探讨BMP信号通路在SP促ST2细胞成骨分化过程的作用。
  方法:
  取P3的ST2以8×104/孔的密度铺板于6孔板,设3个复孔。实验分组为SP组:10-6Mol/L SP; SP+BMP通路抑制剂(Noggin)组:10-6Mol/L SP和100ng/mlNoggin;抑制剂组:100ng/ml Noggin;对照组:等体积2%FBS,培养5天或7天后采用ELISA法检测细胞上清液中ALP,ColIaⅠ和OCN的表达量,并采用免疫荧光染色检测细胞的ALP活性。
  结果:
  (1) SP可明显促进ST2细胞成骨分化标记物ALP、ColIaⅠ和OCN的表达,加入BMP信号通路抑制剂Noggin后,标记物的表达显著减少,且仅加入Noggin也可抑制ALP、ColIaⅠ和OCN的表达。
  (2)免疫荧光染色结果显示SP可促进ST2细胞ALP的表达活性,加入BMP信号通路抑制剂Noggin后,ALP活性受到抑制,单纯加入Noggin也可抑制细胞ALP的活性表达。
  结论:
  SP可促进ST2的成骨分化和ALP活性表达,而BMP信号通路抑制剂Noggin可抑制其效应的发挥,表明BMP信号通路可能在SP促ST2细胞成骨分化中产生了一定的调节作用。
[硕士论文] 唐雪娇
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:实验一 P物质对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
  目的:研究不同浓度及不同时间P物质对小鼠骨髓间充质干细胞ST2细胞增殖的影响,探究P物质对ST2成骨分化标记物表达的影响,探讨P物质与ST2增殖及成骨分化可能存在的浓度和时间的相关性。
  方法:将小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)细胞株(吉满生物科技)接种于培养皿(中皿)中传代培养,培养基为高糖DMEM培养基(含10%FBS),放置于5%CO2细胞培养箱中37℃孵育72h传代,传代至3-4代时使用。加入不同浓度(浓度为1×10-10,1×10-8,1×10-6,1×10-5mol/L)的P物质与不加P物质的对照组一起,培养3天,分别在24h,48h,72h收获细胞,进行CCK-8检测,比较ST2细胞的增殖活性。成骨诱导培养ST2细胞,分为加入1×10-6mol/L浓度的P物质的实验组和未加P物质的对照组,在1,3,5,7天分别收获细胞进行ALP免疫荧光检测,和ALP,ColⅠ的ELISA检测,分析ST2细胞成骨分化过程中的蛋白表达情况。
  结果:CCK-8检测显示在24h时除1×10^-6mol/L及1×10^-8mol/L浓度组外,其他组与对照组之间对ST2细胞增殖作用无统计学差异,48h及72h时不同浓度P物质对ST2细胞增殖活性均有促进作用且有统计学差异(P<0.05),1×10^-6mol/L及1×10^-8mol/L浓度的促进作用与对照组相比有显著差异(P<0.01),其中1×10^-6mol/L的作用效果最强;随时间变化,增殖作用增强,且各时间组间具有统计学差异(P<0.05)。ELISA检测分析结果发现ALP和ColI蛋白表达水平随时间递增,且实验组大于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色结果发现实验组ALP荧光数目较对照组多。
  结论:P物质能够促进ST2细胞的增殖,其中1×10^-6及1×10^-8mol/L促进细胞增殖活性的作用最显著,并且P物质能够在一定的条件下促进ST2的成骨分化的标记物表达上调,且具有一定的浓度和时间的相关性。
  实验二 P物质受体NK1在ST2细胞中的表达及与成骨分化的关系探讨
  目的:观察P物质受体NK1在小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)中的表达,及其与成骨分化各标记物的关系探讨。
  方法:小鼠骨髓间充质干细胞(ST2)细胞株(吉满生物科技)接种于培养皿(中皿)中传代培养,培养基为高糖DMEM培养基(含10%FBS),放置于5% CO2细胞培养箱中37℃孵育72h传代,传代至3-4代时使用。加入成骨诱导培养液培养7天,分别在第1,3,5,7天收获细胞进行NK1受体的免疫细胞化学染色,测量其光密度值。同一批细胞在1,3,5,7天收获细胞培养液进行ALP、OCN(骨钙素)的ELISA检测,分析其表达量的变化。
  结果:细胞免疫化学显示在第1天时NK1受体即开始表达,第3,5天表达上升,一周时NK1受体明显表达,其存在于细胞膜和细胞质,主要存在于细胞质中,成骨分化标记物中成骨分化早期标记物ALP随着时间推移ELISA结果显示表达量逐渐增加,成骨分化晚期标记物OCN在1,3,5天表达量很少,第7天开始有明显增加表达。
  结论:NK1受体在ST2细胞成骨分化的早期即开始出现,并且与促进ST2成骨分化成熟密切相关。
[博士论文] 黄馨
外科学(整形外科学) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  慢性炎症是一系列慢性疾病,如肥胖、糖尿病等的共同病理机制。肥胖机体以长期的低度慢性系统性炎症及免疫反应异常、胰岛素抵抗为重要特征,使其易感于重大代谢疾病包括糖尿病等。肥胖是糖尿病的重要病因,二者呈“孪生”流行趋势,且均可促进牙周炎的发展。而关于NLRP3信号通路在其中所起的关键作用的研究匮乏。本研究目的为探讨肥胖及Ⅱ型糖尿病导致的系统性炎症状态对牙周组织炎症的影响及NLRP3信号通路在其中所起的关键作用。
  方法:
  (1)饮食诱导16周牙周结扎10天建立肥胖小鼠牙周炎模型,记为正常饮食组、正常饮食结扎组、高脂饮食组、高脂饮食结扎组。
  (2)体内通过RT-PCR和IHC的方法检测小鼠牙龈组织内NLRP3信号通路(NLRP3,capase1,IL-1β,NFκb)及巨噬细胞表面标记物F4/80、巨噬细胞趋化因子MCP1的表达情况。
  (3)体外分离培养不同饮食背景的小鼠BMDMs并对其进行LPS刺激,通过RT-PCR及ICC检测巨噬细胞内NLRP3信号通路的表达。
  (4)收集人类健康组、慢性牙周炎组及慢性牙周炎伴Ⅱ型糖尿病组患者牙龈组织,体内通过RT-PCR及IHC检测牙龈组织内NLRP3信号通路的表达。体外分离培养人牙龈上皮细胞并对其进行高糖及LPS刺激实验,通过RT-PCR及ICC检测上皮细胞内NLRP3信号通路的表达。
  结果:
  (1)高脂饲料诱导16w小鼠的体重及血糖明显高于正常饲料组。小鼠牙槽骨吸收:牙周炎组显著高于非牙周炎组,高脂饮食组显著高于正常饮食组。血清胰岛素及炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10表达水平:高脂饮食组显著高于正常饮食组。
  (2)小鼠牙龈组织中NLRP3,Caspase1,IL-1β及NFκb的mRNA及蛋白质表达水平:牙周炎组显著高于非牙周炎组。
  (3)小鼠牙龈组织中F4/80及MCP1的mRNA及蛋白质表达水平:牙周炎组显著高于非牙周炎组,高脂饮食组显著低于正常饮食组。BMDMs中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平:LPS刺激组显著高于非刺激组,高脂饮食组显著低于正常饮食组。
  (4)人牙龈组织中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平:在伴有炎症及Ⅱ型糖尿病的牙龈组织中表达显著性升高。HGECs中NLRP3信号通路因子的mRNA及蛋白质表达水平在高糖刺激后显著升高。
  结论:
  发现,肥胖、Ⅱ型糖尿病的机体处于慢性炎症状态均加重了牙周炎的发生发展。肥胖导致感染的牙周组织内巨噬细胞数量减少及活性降低,引起牙周国有免疫的异常,最终加重了牙周炎的局部炎症状况。而Ⅱ型糖尿病患者的高糖状态可能通过牙龈上皮细胞NLRP3信号通路的高表达而加重慢性牙周炎的发生发展。
[硕士论文] 王轶雄
口腔临床医学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:动物研究发现,B-1a细胞能在感染性炎症或慢性炎症疾病的固有免疫机制中起到保护作用,它能在病毒或细菌入侵的早期快速清除感染源。牙周炎与肥胖,可分别引起局部感染性炎症与全身慢性炎症状态,二者相关联的流行病学报道很多,但是它们之间的免疫机制还尚不明了。本研究建立肥胖复合牙周炎小鼠模型,基于B-1a细胞存在牙周病损局部和肥胖与牙周炎相关联的理论基础,对B-1a细胞在肥胖和牙周炎两种炎症状态中发挥的病理机制进行探索。
  第一章 肥胖状态下牙周感染对小鼠牙周组织中B-1a细胞的影响
  目的:
  本章主要探讨肥胖状态下牙周感染对小鼠牙周组织中B-1a细胞的表达水平及功能的影响,分析肥胖伴牙周感染小鼠牙周组织中B-1a细胞膜表面特异性蛋白CD5,及B-1a细胞分泌的白细胞介素-10(IL-10)炎症因子和抗Ⅰ胶原抗体(抗COLⅠ抗体)的蛋白和mRNA表达变化。
  方法:
  动物模型分组:将24只小鼠随机分成两组,每组各12只。其中一组喂以高脂饲料,为肥胖组(high fat diet,HF),另一组喂以低脂饲料,为正常体重组(low fat diet,LF)。饲料诱导30周后,分别从肥胖组和正常体重组中随机抽取6只做牙周真性结扎处理(periodontitis,P),每组剩余的6只做假性结扎处理(control,C),结扎处理5天,随即产生牙周炎组(LFP组)、正常体重对照组(LFC组)、肥胖组(HFC组)、肥胖复合牙周炎组(HFP组)。
  免疫组化染色定量分析和实时定量PCR基因水平检测:通过实时定量PCR和免疫组化染色方法对牙周组织中CD5、抗COLⅠ抗体、IL-10的蛋白和mRNA表达水平进行定量检测。
  牙周组织中CD5、抗COLⅠ抗体、IL-10的表达水平分别与体重和牙周组织浸润的炎症细胞数之间的相关性分析:小鼠称重;牙周组织HE染色后对浸润的炎症细胞定量计数;将体重、炎症细胞数与三种蛋白之间进行Pearson相关性分析。
  结果:
  牙周组织中B-1a细胞的mRNA及蛋白的表达水平:B-1a细胞相关三种蛋白的牙周炎主效应均有显著性,牙周炎组中的IL-10、CD5、抗COLⅠ抗体的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.001)。
  肥胖和牙周炎对牙周组织中B-1a细胞功能的影响:CD5、IL-10、抗COLⅠ抗体的蛋白表达水平与炎症细胞数之间均呈显著正相关性(r>0,P<0.001);但三者与体重之间的相关性均不显著(P>0.05)。
  结论:
  B-1a细胞在牙周炎症早期表达上调,所分泌的抗COLⅠ抗体可以抵御细菌初期对牙周组织的破坏。但肥胖并未对炎性牙周组织中B-1a细胞的表达水平及功能产生显著性影响。
  第二章 肥胖状态下牙周感染对小鼠脾脏组织中B-1a细胞的影响.
  目的:
  本章主要探讨肥胖状态下牙周感染对小鼠脾脏组织中B-1a细胞表达水平及功能的影响,分析肥胖伴牙周感染小鼠脾脏组织中B-1a细胞膜表面特异性蛋白CD5,及B-1a细胞分泌的抗COLⅠ抗体和IL-10炎症因子的蛋白表达变化。
  方法:
  蛋白质印迹定量分析:用蛋白质印迹方法对脾脏组织中CD5、IL-10、抗COLⅠ抗体的蛋白表达水平进行定量检测。
  将脾脏组织中CD5、IL-10、抗COLⅠ抗体的表达水平分别与体重和牙周组织浸润的炎症细胞数之间进行Pearson相关性分析。
  结果:
  脾脏组织中B-1a细胞的表达水平:B-1a细胞相关三种蛋白的肥胖主效应均有显著性,肥胖组中的CD5、IL-10、抗COLⅠ抗体的蛋白表达水平均显著高于正常体重组(P<0.001)。
  肥胖和牙周炎对脾脏组织中B-1a细胞功能的影响:CD5、IL-10、抗COLⅠ抗体的蛋白表达水平与体重之间均呈显著正相关性(r>0,P<0.001),但三者与牙龈炎症细胞数之间的相关性均不显著(P>0.05)。
  结论:
  B-1a细胞在肥胖机体内表达上调,但其发挥的功能尚不明确。牙周感染并未对肥胖机体脾脏组织中B-1a细胞的表达产生显著性影响。
[硕士论文] 闫松鹤
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  人牙根尖乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs),是一种来源于正在发育的牙根尖乳头组织的间充质干细胞,在年轻恒牙的牙根发育中发挥重要作用。间充质干细胞具有免疫调控功能,那么SCAPs是否对免疫细胞有一定的调控作用,目前尚不清楚。单核巨噬细胞在免疫反应中发挥重要作用,被微生物及各种趋化因子活化可产生IL-6、TNF-α等炎性因子,从而导致炎症的发生、发展。根据巨噬细胞分泌的细胞因子和表型可将其分为两种极化类型,即促进炎症发生的M1型巨噬细胞和促进组织修复的M2型巨噬细胞。有研究发现,间充质干细胞能够抑制单核巨噬细胞的活化并促进其向M2型极化从而达到免疫抑制的作用,本实验初步探讨SCAPs对单核巨噬细胞活化和极化的免疫调控作用。
  实验方法和结果
  1.细胞培养:
  (1)SCAPs的培养:收集因正畸治疗需要而拔除的未发育完全的健康第三磨牙,无菌分离根尖乳头组织,采用酶消化法分离培养SCAPs。
  (2)单核细胞系THP-1、U937传代培养。
  (3)人单核细胞源性巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages,MDM):淋巴细胞分离管分离健康人的外周血获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),将PBMC细胞悬液置培养皿中过夜,其中的单核细胞可贴壁成巨噬细胞。
  2.SCAPs促进单核细胞THP-1向M2样巨噬细胞极化 SCAPs与THP-1通过Transwell小室进行共培养,实验组为SCAPs+THP-1;对照组为THP-1。qPCR结果显示实验组THP-1中与M1型巨噬细胞相关的TNF-α和IL-12在共培养1d时升高,其余时间点均呈下降趋势(p<0.5),与M2型巨噬细胞相关的IL-10、TGF-β1、CD163、CD206均升高(p<0.5),仅CD206在共培养3d时有下降趋势;流式细胞术检测共培养3d THP-1中TNF-α的表达情况,发现实验组的TNF-α表达显著下降(<0.5),与qPCR结果一致;WesternBlotting检测共培养后THP-1中stat3/P-stat3、smad3/P-smad3的表达情况,发现实验组P-stat3/stat3蛋白相对表达水平较对照组呈上升趋势(p<0.5)而P-smad3/smad3蛋白相对表达水平则未见明显变化(p>0.5),表明SCAPs促进THP-1向M2样巨噬细胞极化,可能与stat3通路的激活有关。
  3.SCAPs抑制PMA诱导的巨噬细胞中TNF-α的表达
  单核细胞系THP-1、U937通过佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导成巨噬细胞后与SCAPs共培养,实验组为巨噬细胞+SCAPs;对照组为巨噬细胞。qPCR检测共培养后巨噬细胞样THP-1中炎性因子和表面标志物的表达情况,发现实验组TNF-α的表达显著下降(p<0.5),而与极化相关的其他分子则无明显变化,仅IL-10、CD163在共培养的初期较对照组升高(p<0.5),实验组巨噬细胞样U937中TNF-α的表达也显著下降(p<0.5)。通过ELISA检测共培养上清中的TNF-α的表达量,发现实验组上清中TNF-α的表达下降(p<0.5),进一步证实与SCAPs共培养后,巨噬细胞样THP-1和巨噬细胞样U937分泌的TNF-α降低,表明SCAPs对PMA诱导的巨噬细胞极化作用不明显,却对TNF-α抑制作用明显增强。
  4.SCAPs上清抑制人单核细胞源性巨噬细胞的活化
  PBMC中的单核细胞贴壁成巨噬细胞后弃上清,加适量的SCAPs条件培养液培养4d,实验组为SCAPs条件培养液+MDM;对照组为α-MEM培养液+MDM。通过qPCR检测MDM炎性因子表达情况,实验组TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β的表达均较对照组降低(p<0.5),而实验组IL-10、TGF-β1的表达无明显变化(p>0.5),说明SCAPs上清可以抑制MDM的活化。
  结论:
  通过共培养,SCAPs可以促进单核细胞THP-1向M2样巨噬细胞极化,且stat3通路的激活可能参与其中;SCAPs对PMA诱导的巨噬细胞样THP-1的极化作用不明显,却可以显著抑制巨噬细胞样THP-1、U937中TNF-α的表达;SCAPs上清能够抑制人单核细胞源性巨噬细胞的活化。
[硕士论文] 高玮
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  检测NF-κB(P65)在下牙槽神经损伤后的激活情况,检测不同恢复时期神经恢复的情况,分析各组药物对NF-kappa的影响,及其对神经恢复的作用。
  材料与方法:采用健康成年的wistar大鼠30只,随机分为地塞米松组、PDTC组、生理盐水组,建立大鼠下牙槽神经挤压伤模型,术后1d、2d、3d术区局部注射地塞米松(1mg/kg),PDTC(1mg/kg)以及生理盐水,在动物存活的不同时间(3d,7d,14d),采用免疫组织荧光、Western bolt的方法检测NF-κB(P65)的激活情况及神经生长相关蛋白Gap-43的表达变化,HE染色方法观察神经组织恢复情况。
  结果:
  (1)免疫荧光显示大鼠下牙槽神经挤压后7天,细胞核大且圆,且NF-κB(P65)在细胞核内高表达,无论在术后7天还是14天,地塞米松组NF-κB(P65)细胞核内激活强度都弱于其他两组。
  (2) Western结果显示生理盐水组内NF-κB(P65)在术后3、7、14天呈上升趋势,且表达量比Dex、PDTC组高。三组中,Dex组NF-κB(P65)表达最低。
  (3)、地塞米松及PDTC组在3d、7d、14d的Gap-43表达均有上升,且地塞米松效果更佳。
  (4)7d、14d地塞米松及PDTC组神经纤维组织空泡、纤维排列及纤维结构恢复均优于生理盐水组,地塞米松组恢复效果更佳。
  结论:
  地塞米松在大鼠下牙槽神经损伤后,抑制了NF-κ3(P65)的激活,且促进了神经组织再生。
[硕士论文] 艾丽琼
口腔医学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  P.gingivalis作为慢性牙周炎最主要的致病菌,除了导致口腔局部炎症外,还可能影响心血管系统健康。大量研究表明P.gingivalis及其毒力因子与内皮功能障碍有直接的关系。有研究表明内皮细胞与平滑肌细胞间的信息交流在As发生发展过程中起重要作用,而外泌体作为细胞旁分泌的重要介质,广泛参与了各类信息物质的分泌和摄取过程,介导着细胞间信号转导过程。本研究通过分析IIfimA型P.gingivalis的主要毒力因子菌毛蛋白对平滑肌细胞源外泌体作用下内皮细胞相关功能的影响,进一步探讨P.gingivalis在As发生和发展过程中的可能作用。
  方法:
  (1)采用酶消化法体外培养HUVECs,组织块贴壁法体外培养HUASMCs,免疫荧光鉴定所培养的细胞;用PEG法提取平滑肌细胞源外泌体(HUASMCs-Exo),并行Western blot鉴定其表面标记蛋白CD63、CD9的表达情况,以电镜鉴定其大小和形态,以DiI染色外泌体,并将之与HUVECs共培养24h,观察HUVECs对 HUASMCs-Exo的内化摄取情况。(2)用不同浓度(0.1、1、5、10μg/ml)的IIfimA型P.gingivalis-rFimA处理HUVECs不同时间(2、8、24、48h),采用CCK-8检测细胞的增殖活性,并确定P.gingivalis-rFimA处理HUVECs的最适浓度和时间;后续实验分为4组:①正常组(Normal组):HUVECs不予任何处理;②HUASMCs-Exo组:HUASMCs-Exo与HUVECs共培养;③rFimA组:rFimA处理HUVECs;④HUASMCs-Exo+rFimA组:HUASMCs-Exo与HUVECs共培养后,加入rFimA处理;FACS检测各组细胞总体凋亡率、存活率及坏死率,RT-PCR检测各组细胞内IL-18及Caspase-3 mRNA的表达情况,Western blot检测各组细胞内Cleaved caspase-3蛋白表达情况,ELISA检测各组细胞上清液中IL-18的表达情况。
  结果:
  (1)原代培养的HUVECs和HUASMCs两种细胞生长状态良好,并均经形态学和免疫荧光鉴定确认;采用PEG法成功提取、鉴定了HUASMCs-Exo,并可被HUVECs内化摄取,可用于后续实验。
  (2)CCK-8结果示10μg/ml浓度的rFimA处理HUVECs48h时,细胞增殖活性最低,所以用10μg/ml浓度的rFimA处理HUVECs48h行后续实验。FACS结果示:与Normal组相比, HUASMCs-Exo组细胞总体凋亡率无明显差异(P>0.05),而rFimA组和HUASMCs-Exo+rFimA组均可导致HUVECs总体凋亡率升高(P<0.05);与rFimA组相比,HUASMCs-Exo+rFimA组可下调rFimA作用下HUVECs的总体凋亡率。RT-PCR、Western blot和 ELISA结果示:Normal组与HUASMCs-Exo组细胞IL-18mRNA和Caspase-3 mRNA、凋亡主要效应蛋白Cleaved caspase-3及细胞上清液中IL-18水平均无明显差异(P>0.05);与Normal组相比,rFimA组和HUASMCs-Exo+rFimA组细胞IL-18mRNA和Caspase-3 mRNA、Cleaved caspase-3及细胞上清液中IL-18水平均增加(P<0.05),而HUASMCs-Exo+rFimA组可下调rFimA作用下各检测指标的表达量(P<0.05)。
  结论:
  IIfimA型P.gingivalis-rFimA可诱导HUVECs凋亡和炎症因子IL-18的表达,而HUASMCs-Exo虽然可在一定程度上调控P.gingivalis-rFimA诱导的HUVECs凋亡和炎症反应,仍无法改变HUVECs功能异常的结果。因此,P.gingivalis的主要毒力因子菌毛蛋白可能在促进As发生、发展中发挥一定的作用。
[硕士论文] 张金山
口腔临床医学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过调查广州市白云区城乡结合部小学二年级7-8岁儿童的乳磨牙龋病及恒牙萌出情况,测量身高体重筛查消瘦、超重和肥胖率,探讨乳磨牙龋病、恒牙萌出与生长发育的相关性;通过对儿童的问卷调查,研究乳磨牙龋病和超重/肥胖的关联因素。
  材料与方法:
  1.研究对象
  采用整群随机抽样的方法,共抽取广州市白云区城乡结合部19所小学,选取二年级小学生进行样本筛选。根据基本信息和调查结果去除无效样本量,共选取7-8岁年龄段儿童2032名(其中男生1136名,女生896名)进行分析。
  2.问卷调查
  依据本研究目的自制本研究所用的问卷表,主要参照了第三次、第四次全国口腔健康流行病学调查问卷表设计完成,包括与儿童龋病和生长发育的可能相关因素。分为五个部分:①基本信息:姓名、性别、出生日期、年龄、班级等;②刷牙行为习惯:刷牙次数、方法、时间等;③饮食情况和习惯:课间吃零食频率,进食糖类、饮料等的次数,进食早餐和睡前甜点的情况等;④运动行为状况:有氧运动和剧烈运动的次数,是否喜欢体育课等;⑤其他项目:零花钱的金额,对自我体型的评价,牙齿摔伤史,旷课情况等。
  3.口腔检查
  乳磨牙龋病检查以国际龋病检测和评估系统Ⅱ(International CariesDetection and Assessment SystemⅡ,ICDAS-Ⅱ)为标准,在照明光源下,以视诊结合探诊检查,检查结果按不同切割点进行比较分析:D1(0级为健康,1-6级为龋病诊断);D3(0-2级为健康,3-6级为龋病诊断);D4(0-3级为健康,4-6级为龋病诊断);D5(5-6级严重龋病情况)。恒牙萌出以破龈萌出记为萌出。
  4.身高体重测量
  使用立式身高计和杠杆式体重秤进行身高体重测量,以两次测量取平均值记录,身高精确到0.1cm,体重精确到0.1kg,计算体质量指数(Body mass index,BMI)值,以国际肥胖工作组(International Obesity Task,IOTF)的2-18儿童消瘦及超重肥胖诊断标准为依据,分为消瘦、正常、超重和肥胖四组。
  结果:
  2032名7-8岁儿童乳磨牙患龋情况:D1患龋率为88.6%,龋均4.42; D3患龋率为79.6%,龋均3.46; D4患龋率为71.0%,龋均为2.78; D5患龋率为63.0%,龋均为2.36。男女间差异无统计学意义(P>0.05)。恒牙萌出率为66.81%,均数为10.72。按IOTF标准分组,消瘦、超重和肥胖率分别为14.4%、12.1%和5.1%。随着BMI指数升高,乳磨牙龋齿数量降低,恒牙萌出数增高。经Logistic回归分析,是否超重/肥胖与乳磨牙患龋计数、恒牙萌出数均具有相关性(P<0.05),乳磨牙是否患龋与恒牙萌出数无相关性(P>0.05)。经对儿童的问卷调查得知,乳磨牙龋病与刷牙时间、因牙齿问题影响进食和食欲情况相关联;超重/肥胖组儿童每周进食早餐次数、食欲和运动次数均高于其他组儿童。
  结论:
  广州市白云区城乡结合部7-8岁儿童患龋率高于全国和广州市平均水平,需制定更多更有效的防龋措施。超重/肥胖率呈增长趋势,稍低于全国其他发达城市,消瘦率呈下降趋势,需持续关注。乳磨牙龋病和恒牙萌出与生长发育关系密切。龋病的发生影响了儿童的进食和食欲,超重和肥胖儿童具有更好的运动行为习惯。
[硕士论文] 李多多
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  高脂血症是动脉粥样硬化、骨质疏松、高血压、冠心病、脑卒中等疾病发生、发展的重要危险因素,是目前影响人民群众身体健康的高发疾病之一。研究表明高脂血症对骨愈合、骨矿化、骨密度等诸多骨代谢过程有不良影响,高脂血症是引起骨质疏松的危险因素之一。在骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalstemcells,BMSCs)向成骨细胞定向分化中Wnt信号通路起关键性作用。而最近几年大量的研究表明,成骨的分化过程中微小RNA(microRNAs,miRNAs)发挥了重要的生物学功能,例如维持骨代谢的平衡。
  本课题组前期实验证实高脂饲料喂养的大鼠种植体周围骨质疏松,骨小梁稀疏,排列紊乱;高脂饲料喂养的大鼠种植体周围Ca/P原子个数百分比低于普通饲料喂养的大鼠;荧光定量PCR和Westernblot结果显示Dvl2基因、Dvl2蛋白的表达受到抑制,表明高脂血症在一定程度上干扰高脂血症大鼠种植体的早期骨结合。Wnt/β-catenin信号通路中的Dvl2在高脂血症患者中具体如何发挥作用值得探讨。Wnt信号通路与miRNAs存在大量的交叉信号分子,其作用靶点与具体作用机制都值得深入探讨研究。
  实验目的:
  (1)观察高脂环境下大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中Runx2、ALP、SP7、PPAR-γ、Dvl2及靶向调控Dvl2相关microRNAs的mRNA表达。
  (2)利用靶基因预测软件、双荧光素酶报告基因筛选及鉴定出靶向调节Dvl2的microRNAs。
  (3)探讨microRNAs靶向调节Dvl2对BMSCs成骨分化的影响。
  实验方法:
  (1)大鼠骨髓间充质干细胞获取传代培养,培养第三代时行流式细胞检测,分别成骨成脂诱导28天后茜素红和油红O染色,观察成骨成脂分化能力,鉴定BMSCs,以便用于后续实验。用高脂培养基和普通培养基成骨诱导BMSCs诱导28天时分别行茜素红和油红O染色观察成骨分化情况,诱导3、5、7、14、21天,利用RT-PCR检测细胞内成骨相关基因Runx2、ALP、SP7,成脂相关基因PPAR-γ,Wnt信号通路中Dvl2,与靶向调控Dvl2相关的miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5pmRNA的表达。
  (2)靶向调控Dvl2相关的microRNAs采用靶基因预测软件TargetScan、MicroRNA.org、miRDB、MicrocosmTargets等四种miRNA数据库在线分析软件进行生物信息学预测,以及文献查询,得到可能与Dvl2基因3'UTR区作用的miRNAs为:miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p。通过体外转染不同浓度(10nm、30nm、50nm、100nm)梯度的FAM-siRNA,6h后镜下观察转染效率和CCK8检测其细胞增殖筛选合适的转染浓度。利用筛选浓度体外转染miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p的模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),48h后利用RT-PCR检测转染效率,实现Dvl2的过表达和低表达,Westernblot检测BMSCs中Dvl2的表达差异,找出引起Dvl2变化最明显的miRNA。构建双荧光素酶报告基因质粒载体,分别用miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p的模拟物与质粒载体共转293t细胞,利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性,验证miRNAs与Dvl2的靶向调控作用。
  (3)高脂环境下体外转染miR-29c-3pmimics和inhibitor后成骨诱导BMSCs3、7天,利用Westernbolt检测成骨相关基因Runx2、ALP的表达情况。
  实验结果:
  (1)流式细胞仪检测结果显示:第三代BMSCsCD44阳性细胞比率是96.7%,CD45阳性细胞比率是2.8%,CD90阳性细胞比率是95.9%。间充质干细胞表面标志抗原表达阳性,验证此细胞为BMSCs,纯度较高。成骨诱导28天茜素红染色、油红O染色结果显示BMSCs具有向成骨成脂方向分化能力。培养28天茜素红染色见高脂组较对照组钙化结节少,油红O染色串珠样脂滴高脂组多于对照组,RT-PCR结果显示成骨指标Runx2、SP7、ALPmRNA表达高脂组较对照组低,成脂指标PPAR-γmRNA表达高脂组较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-21-5p、miR-29c-3p高脂组较对照组均降低,在3、5、7、14天时miR-138-5pmRNA表达量对照组与高脂组无明显差异,在21天时miR-138-5pmRNA表达量对照组明显高于高脂组,差异有显著意义(P<0.05)。在3、5、7天时miR-351-5pmRNA表达量对照组与高脂组无明显差异,在14、21天时miR-351-5pmRNA表达量对照组低于高脂组,差异有显著意义。
  (2)荧光显微镜观察浓度越高转染效率越高,CCK8浓度越高细胞增殖越受到抑制,Real-timePCR结果显示,转染miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p的mimics后,与对照组相比其表达量分别升高5-6倍、4倍、1000倍和800倍左右。而转染相应的inhibitor后,与对照组相比其表达量分别降低约3倍、10倍、10倍和5倍。转染miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p的mimics和inhibitor及NC48h后,RT-PCR结果显示,转染miR-21-5p和miR-29c-3pmimics后,与mimicsnc组相比Dvl2的表达降低,转染miR-138-5p和miR-351-5pmimics后,与mimicsnc组相比Dvl2的表达升高。转染miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5pinhibitor后与inhibitornc组相比Dvl2的表达都有不同程度的升高。Westernblot结果显示,miR-29c-3pmimics/inhibitor转染细胞后,Dvl2表达差异最明显。
  (3)Westernblot结果显示转染miR-29c-3pmimics后Runx2和ALP的蛋白表达水平均明显比mimicsNC组增高,转染inhibitor后Runx2和ALP的蛋白表达水平均明显比inhibitorNC组降低。
  结论:
  (1)高脂环境下BMSCs向成骨细胞分化减少,miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p参与调控高脂环境下骨代谢和成骨细胞的生物学活性。
  (2)经双荧光素酶报告基因筛选及鉴定出靶向调节Dvl2的miRNA是miR-29c-3p,而miR-21-5p、miR-138-5p、miR-351-5p对Dvl2的负性调节作用弱。
  (3)miR-29c-3p通过靶向调节Dvl2间接促进BMSCs向成骨分化、矿化能力。
[硕士论文] 练轶
口腔医学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过使用常规咬合纸、数字化咬合仪进行以建立延迟咬合为目的的调牙合,比较两者调牙合的结果及6个月内的变化,为种植体上部咬合设计提供临床参考。
  方法:对15例种植单冠修复体咬合面使用30μm咬合纸进行以建立延迟咬合为目的的调牙合,运用数字化咬合仪对于另15例种植单冠修复体进行以建立延迟咬合为目的的调牙合。两组调牙合结束后用数字化咬合仪记录并测评其咬合数据。将两组调牙合结束后的咬合数据进行对比,选出两者中建立延迟咬合效果最适宜的调牙合方法;在两组种植修复体完成调牙合后的第1、3、6个月时间节点进行咬合数据的采集、分析,并对于各组种植体进行RVG片拍摄记录,分析种植体近远中骨吸收量,对比两组咬合数据及种植体骨吸收值的差异。使用两种方法对粘接固位的两联冠种植修复体进行调牙合,并在修复体完成调牙合后的第1、3、6个月时间节点,测量分析RVG片中各组种植体近远中骨吸收量的差异。
  结果:
  1.使用咬合仪进行建立延迟咬合的调牙合结果优于单纯使用咬合纸组;将使用咬合纸进行以延迟咬合为目的调牙合后的咬合情况与运用数字化咬合仪进行相同目的调牙合后的咬合情况相对比:种植修复体咬合接触面积,占全口牙合力的百分比,与对侧同名天然牙牙合力的比值,以及修复侧牙弓与健侧牙弓牙合力占全口牙合力的比值,均具有统计学意义(P<0.05)。
  2.使用咬合仪建立延迟咬合的种植修复体在调牙合完成后的第1、3个月时间节点时的各项咬合数据,与咬合纸调牙合组存在显著差异(P<0.05)。咬合仪调牙合组种植修复体在修复后1、3、6个月咬合力逐渐增加形成渐进性咬合,修复侧与健侧牙弓受力逐步达到平衡。两种方法调牙合后的种植单冠修复体,在修复完成后的第1、3、6个月时间节点拍摄 RVG片并测量植体近远中骨吸收量。通过自身对比得出种植体近远中骨吸收量无显著统计学差异(P>0.05);对比咬合仪组与常规咬合纸调牙合组在修复后的三个时间节点的种植体近中与远中的骨吸收量,差异均具有统计学意义(P<0.05)。
  3.使用两种方法调牙合后的两联冠种植修复体,在修复完成后的第1、3、6个月时间节点,分别对每一种植体的近远中骨吸收量进行自身对比,差异无统计学意义(P>0.05);同组内缺隙侧近中端种植体与缺隙侧远端种植体近远中骨吸收也无显著差异(P>0.05);咬合仪组与常规咬合纸调牙合组在修复后第1个月时缺隙侧近中端种植体的近中骨吸收量差异具有统计学意义(P<0.05);其他时间节点,两组中各植体近远中骨吸收量差异无明显统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1.单纯使用咬合纸调牙合的结果受多种主观因素干扰,而数字化咬合仪建立延迟咬合的结果更为客观、准确。
  2.咬合仪调牙合组的种植修复体在修复后6个月内咬合力逐渐增加,形成渐进性咬合,修复侧与健侧牙弓受力逐步达到平衡。与常规咬合相比,延迟咬合对单冠种植修复体而言具有减小其修复半年内的植体近中与远中骨吸收量的作用。
  3.对于粘接固位的两联冠种植修复体而言,延迟咬合减少其周围骨吸收量的作用不明显。
[硕士论文] 李娜
口腔医学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过系统评价,评估富血小板纤维蛋白(Platelet-rich fibrin,PRF)促进牙周组织再生方面的疗效,以期对慢性牙周病的治疗寻觅更科学的方法、挖掘富血小板纤维蛋白更多的医疗潜力。
  方法:利用计算机全面的检索以下数据库:The Cochrane Library、EMBASE、MEDLINE/PubMed(数据库建立-2016年12月)。中国期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(Chinese Biomedical Literature Database,CBM)、万方医药数据库、维普医药数据库(2000年-2016年12月)并且通过 Google学术搜索引擎查找遗漏文献,此外辅以手工检索,检索相关灰色文献,总之,尽可能全面地收集关于富血小板纤维蛋白(PRF)联合翻瓣清创术(open flap debridement,OFD)与单独使用翻瓣清创术治疗慢性牙周病的随机对照试验(RCT)。搜索文献纳入标准如下:1均为慢性牙周病患者;2随机对照试验(RCT);3牙周骨缺损Intra-Bony-Defects(IBD)≥3mm;4探诊深度(PD)≥5mm;5临床附着丧失水平(CAL)≥5mm;6实验组(PRF+OFD)、对照组(OFD);7无血液及免疫性疾病;8通过临床测量和影像学方法对软组织和骨组织进行定量分析的研究。搜索文献排除标准:1病例报告;2回顾性研究;3综述;4动物实验;5细胞组织学研究;6怀孕及哺乳期妇女;7吸烟者;8不愿意签署知情同意书者;9无法维持口腔卫生者。采用 RevMan5.3软件进行统计学分析,视情况选取固定效应模型或者随机效应模型进行合并效应量,每一个效应量均采用95﹪的可信区间(confidence interval,CI)进行表示。若多个相同的研究间存在较大的异质性,则采用随机效应模型、亚组分析以及敏感性分析的方法来降低其异质性以及寻找异质性来源。
  本研究分析指标均为数值变量,所以选择均数差或者加权均数差(mean difference,MD or weighted mean difference,WMD)或者标准化均数差(standardized mean difference,SMD)为合并统计量。
  结果:对相关研究进行初步检索得到279篇文献,排除重复文献后获得126篇,由2名研究员独立对剩余文献的题目和摘要进行初步筛选获得36篇文献,严格按照纳入标准和排除标准仔细阅读全文最终获得文献8篇,患者总共319例,实验组161例,对照组158例。其中获得高质量文献3篇,中等质量的文献2篇,低质量文献3篇,将搜集的8篇文献按照一定的方法进行Meta分析,最终分析结果:
  (1)将纳入的5篇关于牙周骨成骨性的研究进行Meta分析,森林图结果显示为SMD=2.56,95%CI为(-0.42,5.55),合并效应量检验Z=1.68,P=0.09,说明 PRF+OFD组与OFD组的牙周成骨性之间不存在统计学意义。
  (2)将纳入其中的5篇关于研究牙周探诊深度的文献进行Meta分析,森林图结果显示为SMD=0.80,95%CI为(0.52,1.07),合并效应量检验Z=5.71,P﹤0.00001,说明PRF+OFD组在改善探诊深度方面优于OFD组。
  (3)将3篇采用分口设计比较牙周探诊深度(PD)的文献进行Meta分析,森林图结果显示为SMD=2.01,95%CI为(1.20,2.83),合并效应检验Z=4.83,P﹤0.00001,说明PRF+OFD组在改善探针深度方面优于OFD组。
  (4)将纳入其中的5篇关于研究牙周组织的临床附着丧失水平恢复情况进行Meta分析,森林图结果显示为SMD=0.57,95%CI为(0.30,0.84),合并效应检验Z=4.11,P﹤0.0001,结果表明在临床附着丧失水平的恢复情况PRF+OFD组优于OFD组。
  (5)将3篇采用分口设计比较临床附着丧失水平恢复情况的文献进行Meta分析,森林图结果显示为SMD=2.15,95%CI为(0.98,3.33),合并效应检验Z=3.59,P=0.0003,结果表明在PRF+OFD组的临床附着丧失水平的恢复明显优于OFD组。
  结论:
  (1)根据有限的证据证实,富血小板纤维蛋白在促进牙周骨成骨性方面目前无足够的证据给予证明。
  (2)根据明确的证据证明,富血小板纤维蛋白可以明显改善牙周探诊深度这一牙周指数,有利于获得更好的牙周健康状况。
  (3)根据明确的证据证明,富血小板纤维蛋白能够明显改善牙周附着丧失这一牙周指数,有利于获得更好的牙周健康状况。
[硕士论文] 韩秀春
口腔基础医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  创伤、拔牙、感染等原因造成的骨缺损是临床亟待解决的难题之一。临床上骨缺损的修复方法主要包括骨搬运术、骨移植等手术治疗以及物理疗法。众所周知,骨搬运术的手术复杂、易伴发感染;自体骨移植的骨源受限,对供体造成新的骨缺损;异体骨移植易诱发排异反应。因此,寻找一种并发症少、利于成骨、操作简单的修复方法可能会为临床骨缺损的治疗提供新的方向。课题组先前的研究发现,运用化学疗法治疗骨缺损方法较为安全、简单、有效。
  1α,25-dihydroxyvitaminD3(1,25(OH)2D3)是维生素D的一种活性形式,明显抑制绝经后骨质疏松。骨质疏松是以骨量减少和骨微结构破坏为特征的一组全身性骨骼疾病,而骨量的减少主要是由于骨吸收所致。科研人员发现活性维生素D能够明显降低骨质疏松患者骨折的风险。近年来,众多的活性维生素D类似物在原有的药物基础上进行了药学性能的优化。本课题中所使用的艾地骨化醇(Eldecalcitol,ELD)是一种新型活性维生素D类似物,其与维生素D受体(VitaminDreceptor,VDR)的亲和力较低,而与维生素D结合蛋白(VitaminDbindingprotein,DBP)的亲和力较高。因此,艾地骨化醇具有作用持久和利用率高的特性。研究发现艾地骨化醇明显地抑制骨吸收以及增加骨密度,此外,艾地骨化醇可以诱导“迷你型塑造”骨形成,而不依赖破骨细胞的骨吸收过程。因此在2011年艾地骨化醇被批准为治疗骨质疏松症的药物。艾地骨化醇具有抑制骨吸收增加骨量的特性,因此艾地骨化醇在治疗骨质疏松症方面一直备受关注,但是其在骨缺损修复方面的研究甚少。骨缺损愈合是一个多细胞参与,多种信号在时间和空间上精密调控的复杂的生物学过程。与骨质疏松不同的是,骨缺损愈合不仅包括骨量的恢复,而且包括骨质的成熟。成骨细胞、破骨细胞和骨细胞是骨再生的三大功能细胞,在骨缺损愈合过程中扮演着不可替代的角色。因此,本课题利用艾地骨化醇抑制骨吸收的特性来治疗局部骨缺损,以期获得良好的治疗效果,并且建立骨缺损模型研究艾地骨化醇对三大功能细胞影响,从而探讨其对骨缺损愈合的影响,并期望该研究成果能为临床骨缺损的治疗提供一定的理论基础及新的思路。
  实验目的:
  本课题通过制备骨缺损模型,旨在探讨系统性应用艾地骨化醇对成骨细胞、破骨细胞、骨细胞的影响及其相关机制,弥补艾地骨化醇在骨缺损修复方面的研究空缺,为临床骨缺损的治疗提供一定的理论基础及新的思路。
  实验方法:
  将48只8周龄雄性Wistar大鼠(体重180-220g)随机分为对照组(CON组)和艾地骨化醇组(ELD组),每组24只。所有动物全麻后于双侧股骨中段分别制备大小为1mm×3mm×5mm(深度×宽度×长度)的骨缺损,并在骨缺损表面覆盖胶原膜。ELD组术后通过灌胃方式给予艾地骨化醇(剂量为50ng/kg),CON组投给等量的脂肪酸,隔日给药一次。24只大鼠分别于术后1、2、4和8周处死并取材(n=6),提取蛋白和mRNA,利用Westernblot检测RANKL(Receptoractivatorofnuclearfactorkappa-Bligand,核因子kB受体活化因子配体)、OPG(Osteoprotegerin,骨保护素)和OCN蛋白的表达情况;利用RT-PCR检测RANKL、OPG和OCNmRNA的表达水平。24只大鼠分别于术后1、2、4和8周处死并取材(n=6),经石蜡包埋后制备5μm的连续切片。通过HE染色进行新生骨大体形态学观察;通过马松染色检测新生骨中非成熟骨组织所占比例;通过TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色方法检测破骨细胞数目;利用免疫组织化学染色方法检测ALP(Alkalinephosphatase,碱性磷酸酶)、CK(CathepsinK,组织蛋白酶K)、OCN(Osteocalcin,骨钙素)、DMP1(Dentinmatrixprotein1,牙本质基质蛋白1)和FGF23(Fibroblastgrowthfactor23,成纤维生长因子23)的表达情况。本课题通过检测上述因子,探讨艾地骨化醇对骨形成以及骨矿化的影响。
  实验结果:
  1.ELD增加新生骨骨量
  骨缺损区域HE染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),大量纤维结缔组织和新生编织骨充填整个骨缺损部位,ELD组新生编织骨骨量明显高于CON组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),4周ELD组新生骨骨量高于CON组,8周CON组和ELD组之间骨量无明显差异。
  2.ELD对成骨和破骨功能的影响
  骨缺损区域ALP/TRAP双重染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),ELD组ALP的表达明显多于CON组。CON组TRAP阳性破骨细胞数目明显高于ELD组,破骨细胞深染、体积大且呈现多核,提示破骨功能活跃;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组ALP的表达多于CON组,CON组TRAP阳性破骨细胞数目有所降低但仍然高于ELD组。
  骨缺损区域CK免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),CON组CK阳性破骨细胞数目明显多于ELD组,并且ELD组的CK阳性破骨细胞与骨组织表面附着不甚紧密,体积较小胞体扁平;在骨缺损愈合的后期(4、8周),CON组CK阳性破骨细胞数目有所减低但仍然高于ELD组。
  骨缺损区域RANKL、OPG蛋白的Westernblot结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),与CON组相比,ELD组RANKL蛋白的表达水平明显降低,OPG蛋白的表达水平明显上调,并且ELD组RANKL/OPG的比例明显降低。
  骨缺损区域RANKL、OPGmRNA的RT-PCR结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明显地下调RANKLmRNA的表达,促进OPGmRNA的表达,并且ELD组RANKL/OPG的比例显著降低。
  3.ELD对新骨成熟程度的影响
  骨缺损区域马松染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组之间未成熟骨组织所占比例(COL/TV)无明显差异,2周CON组未成熟骨组织所占比例(COL/TV)高于ELD组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组骨缺损部位可见大量带状红染的成熟骨组织,并且新生骨裂缝较少骨质平滑细密,ELD组的未成熟骨组织的比例(COL/TV)明显低于CON组。
  4.ELD对成骨细胞矿化因子的影响
  骨缺损区域OCN免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组骨基质OCN的表达无明显差异,2周ELD组成骨细胞胞质内OCN的表达明显多于CON组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组OCN主要分布在骨基质中且表达量明显高于CON组。
  骨缺损区域OCN蛋白的Westernblot结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组OCN的表达无明显差异,2周ELD组OCN蛋白的表达较CON组有所增加;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组OCN蛋白的表达水平明显高于CON组。
  骨缺损区域OCNmRNA的RT-PCR结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明显促进OCNmRNA的表达。
  5.ELD对骨细胞矿化因子的影响
  骨缺损区域DMP1免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的后期(4、8周),CON组骨细胞排列较紊乱,而ELD组的骨细胞排列较为整齐有序,ELD组的DMP1阳性骨细胞数目显著多于CON组。
  骨缺损区域的FGF23免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组FGF23阳性骨细胞数目显著低于CON组。
  结论:
  1.艾地骨化醇一方面通过下调RANKL的表达,降低RANKL/OPG的比例,抑制破骨细胞生成和骨吸收;另一方面通过促进成骨细胞分化和骨形成,加速骨缺损的愈合。
  2.艾地骨化醇一方面通过促进成骨细胞矿化相关因子OCN的表达,促进新骨矿化;另一方面通过促进骨细胞矿化相关因子DMP1的表达,间接抑制骨细胞矿化相关因子FGF23的表达,促进新骨矿化,加速骨缺损愈合。
[硕士论文] 邵艳琳
口腔临床医学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:应用超髙效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用(Ultra high Performance Liquid Chromatography/Quadrupole-Time-of-Flight-Mass Spectrometry,UHPLC/Q-TOF-MS)技术研究药物干预前后种植体周围黏膜炎龈沟液的代谢组学特征,寻找种植体周围黏膜炎及其治疗前后的差异代谢产物,进一步寻找种植体周围黏膜炎可能的生物标记物,为临床上预防、早诊断、早治疗种植体周围黏膜炎及种植体周围炎提供理论依据。
  方法:采集患者的龈沟液(已行牙种植手术并且种植牙冠修复完成半年以上),全部使用滤纸条法采集,分别有健康牙组(A组)15例,健康种植体组(B组)15例,种植体周围黏膜炎组(C组)15例,药物干预后组(D组)15例。从每个组中各随机选取5例样本,应用超髙效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪对龈沟液样本进行检测分析,使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00软件对原始数据进行预处理和归一化处理。然后分别进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(Partial least square-discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)来识别并观察组间差异,上述三种分析都使用 SIMCA-P13.0软件。根据OPLS-DA模型的得分图筛选出变量重要性投影(Variable Importance in the Projection,VIP)值(VIP>1.0)的离子,同时结合独立样本t检验(P<0.05)寻找组间差异代谢产物。差异性代谢物的定性方法为:根据准确的相对分子质量,保留时间,离子模式和二级质谱信息,搜索在线数据库Metlin library、人类代谢物数据库(Human Metabolome Database,HMDB)进行精确的比对。
  结果:
  1.临床指标分析结果四个组的探诊深度(Probing depth,PD)、龈沟液重量(Peri-implant sulcus fluid,PISF)、改良菌斑指数(Modified plaque index,mPLI)、改良龈沟出血指数(Modified sulcus bleeding index,mSBI)均有统计学差异(P<0.01)。用LSD法进行两两比较,A组、B组以及D组之间没有统计学差异(P>0.05),C组各项指标值均高于A组、B组、D组,且差异有统计学意义(P<0.01)。
  2.色谱图结果正离子模式下,谱图主要在6—10min有差异;负离子模式下差异主要表现在9—11min。
  3. PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析结果在PCA得分图上A组与B组、B组与C组、C组与D组、B组与D组样品在正负离子模式下均不能得到很好的区分,有部分样品重叠;在PLS-DA和OPLS-DA得分图上,在正离子模式和负离子模式下,A组与B组、B组与C组、C组与D组、B组与D组样品均能够完全区分开,表明各对比组的两组样品之间的代谢成分有明显的差异。
  4.差异代谢产物鉴定结果
  与健康牙组相比,健康种植体组呈上调趋势的差异代谢产物有:天门冬氨酸、脱氢鞘氨醇;呈下调趋势的差异代谢产物有:L-胱氨酸、N-硬脂酰脯氨酸。
  与健康种植体组相比,种植体周围黏膜炎组呈上调趋势的差异代谢产物有:丙氨酸、3-吲哚乙酸、黄嘌呤、天冬氨酸-异亮氨酸、泛酸、脯氨酰缬氨酸、L-甘油磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱(P-16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11Z)/P-18:1(9Z));呈下调趋势的差异代谢产物有:1,11-十一烷二羧酸。
  与种植体周围黏膜炎组相比,药物干预后组呈下调趋势的差异代谢产物有:4-羟基异喹胍、N,N-二甲基鞘氨醇、2-棕榈酸、尿石素A-3-O-葡萄糖醛酸、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11Z)/P-18:1(9Z))。
  与健康种植体组相比,药物干预后组呈上调趋势的差异代谢产物有:焦磷酸硫胺素、溶血磷脂酰胆碱(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/P-18:1(9Z));呈下调趋势的差异代谢产物有:4-羟基异喹胍、C2二氢神经酰胺、脱氢鞘氨醇、2-amino-14,16-dimethyloctadecan-3-ol、1,11-十一烷二羧酸、16β-羟甲基炔诺酮。
  结论:
  1.种植体周围黏膜炎是可逆的,改良菌斑指数、改良龈沟出血指数、探诊深度及种植体周围龈沟液量可作为检查种植体周围疾病的常用指标,种植体周围龈沟液量在炎症状态时分泌增多。
  2.基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联合多元变量统计分析的代谢组学技术是一种没有创伤、快速有效、灵敏的寻找差异性代谢产物的方法,为研究种植体周围黏膜炎以及种植体周围疾病的发病机制提供新思路。
  3.种植体周围黏膜炎中蛋白质代谢、脂代谢、糖代谢及柠檬酸循环、嘌呤降解途径、磷脂代谢存在异常。
  4.黄嘌呤、溶血磷脂酰胆碱(P-16:0)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:1(11Z)/P-18:1(9Z))可能是种植体周围黏膜炎潜在的标志物。
  5.盐酸米诺环素等药物治疗种植体周围黏膜炎两周后,虽然黏膜的临床指标恢复正常,但是仍然存在糖代谢、磷脂代谢和鞘脂代谢异常。
[硕士论文] 张璐
口腔临床医学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过制取富自体浓缩生长因子纤维蛋白(concentrated growth factors,CGF)提取液,观察其对MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化的影响,为临床应用CGF提供相应的实验依据。
  方法:
  (1)将收集于志愿者的血液通过Medifuge离心加速机制备CGF,再采用冷冻联合37℃孵育的方法制取 CGF提取液。
  (2)实验组采用浓度分别为5%、10%、20%的CGF条件培养基(含10%FBS,1%双抗),对照组采用α-MEM完全培养基(含10%FBS,1%双抗)培养MC3T3-E1成骨细胞,培养1、3、5、7天后CCK-8法检测细胞增殖情况,确定CGF提取液的最佳使用浓度,应用于后续实验。
  (3)实验组使用CGF条件培养基,对照组使用α-MEM完全培养基,分别在第1、3、5、7天时,进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测;在第3、7天时,实时荧光定量PCR(RT-PCR或qPCR)测定 MC3T3-E1成骨细胞中 Runt相关转录因子-2(Runt-related transcription factor-2,Runx2)和成骨细胞特异性转录因子(Osterix,Osx)基因的表达情况。
  结果:
  (1)按照CGF标准化制备程序,能成功将血液分成明显的三层结构,形成体积较大、柔软、韧性强的CGF凝胶。
  (2)在分别培养1、3、5、7天,CCK-8法测得各浓度的CGF条件培养基的吸光度值(OD)均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);比较三种浓度CGF条件培养基的效果,10%CGF组在各个时间点促细胞增殖的作用均强于5%CGF、20%CGF组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。
  (3)ALP检测结果发现,实验组和对照组的吸光度值均随着时间延长而逐渐增加(P<0.05),在第1天时两组吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),但分别在第3、5、7天时,实验组的吸光度值均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组MC3T3-E1成骨细胞中Runx2和Osx的基因表达量都随着实验时间的延长逐渐增加(P<0.05),且在各个时间点,实验组Runx2和Osx的基因表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  (1)CGF提取液可促进MC3T3-E1成骨细胞增殖,但浓度为10%的CGF提取液促进细胞增殖的效果最明显。
  (2)CGF提取液中的生长因子能够增加MC3T3-E1成骨细胞的碱性磷酸酶活性,促进细胞分化成熟。
  (3)CGF提取液中的生长因子能有效地提高MC3T3-E1成骨细胞中成骨相关基因的表达水平。
[硕士论文] 张梦龙
口腔临床医学 中国医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:随着社会的进步和人们牙齿美容意识的逐步提高,牙齿漂白已经成为口腔治疗中不可或缺的一部分,深入研究和系统评价牙齿漂白系统的临床疗效及发展前景具有重要的临床意义。本文将通过临床研究评价Opalescence PF家庭美白套装美白牙齿的疗效,观察治疗期间牙齿敏感症状的发生率以及疼痛程度的情况,为Opalescence PF家庭美白套装的临床应用提供依据。
  方法:随机选择2015年6月-2016年9月间在中国医科大学附属口腔医院就诊的生理性黄牙患者30例,使用含15%过氧化脲的Opalescence PF家庭美白套装进行漂白治疗,嘱患者正确的使用方法,对受试者随访观察,并进行资料采集。使用Vita比色板分析比较漂白前后受试者牙面色度值的变化,记录受试者漂白过程中牙齿酸痛的发生情况,并根据治疗后即刻,1个月,3个月,6个月的复查结果评价牙齿漂白的疗效和稳定性。
  结果:漂白后即刻,1个月,3个月,6个月牙齿的比色值与治疗前相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。漂白后即刻,1个月,3个月,6个月总有效率均为100%,显效率分别为90%,53.3%,43.3%,20%。漂白后1个月,3个月,6个月显效率与漂白后即刻相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。在治疗过程中,30名受试者均出现不同程度的牙齿敏感情况,其中轻度敏感14例,中度敏感16例,但均在术中停药5-6h后症状消失。
  结论:Opalescence PF家庭美白系统治疗生理性黄牙具有较为显著的临床疗效,随着漂白后时间增加,牙齿颜色逐渐回复。漂白过程中会出现不同程度的牙齿敏感症状,但均在术中停药5-6h后缓解,为一过性不良反应。Opalescence PF家庭美白系统具有较好的临床治疗效果。
[博士论文] 叶欣
口腔临床医学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:牙周炎是口腔科常见疾病,是导致牙齿早失的主要原因。牙周炎以牙周支持组织包括牙槽骨的破坏为主要病理表现,其治疗以重建牙周组织,恢复牙周组织的结构和功能为目标。同其他部位的骨组织相同,牙槽骨终生处于骨改建中,即成骨细胞的骨生成和破骨细胞的骨吸收形成平衡,二者相对作用的强弱决定骨量的变化。牙周炎发生时,局部的炎症反应使成骨细胞的骨生成受到抑制,而破骨细胞的骨吸收作用被促进。牙周医学研究表明牙周炎发生及病变程度与心血管疾病密切相关,而高脂血症作为共同的致病因素同时促进了这两类疾病的发生。高脂血症以升高的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-c),甘油三脂(triglyceride,TG),总胆固醇(total cholesterol,TC)为主要表现,其中LDL-c升高被认为是心血管疾病的主要致病因素。高脂血症可引起脂质过氧化,LDL的氧化主要发生在动脉血管壁,产生多种具有生物活性的脂质氧化产物,在动脉粥样硬化斑块病变发生中起关键作用。其中低度氧化修饰的LDL(minimally modified LDL,MM-LDL)即LDL不完全氧化的产物,被认为具有更高的促炎能力。研究表明脂质氧化产物促进了血管细胞钙化,而抑制了成骨细胞钙化,可能是心血管疾病血管钙化和骨质破坏并发的机制。在牙周炎的发生发展中,脂质氧化产物一方面影响系统炎症水平和免疫状态,增加了机体对牙周炎的易感性;另一方面直接作用于成骨细胞及破骨细胞,促进骨吸收而抑制新骨生成,最终骨密度及骨量降低。研究发现多种脂质氧化产物参与抑制成骨前体细胞的分化及骨基质产生。
  目的:
  本实验研究ox-PAPC是否影响成骨细胞增殖,凋亡和成骨相关基因表达;同时观察重要的成骨调控信号——经典Wnt通路是否参与了上述ox-PAPC对成骨分化的影响及具体分子机制。
  方法:
  第一部分: ox-PAPC对成骨细胞活性及成骨相关基因表达的影响
  取新生小鼠颅骨,分离并培养原代成骨细胞,鉴定后取第二代细胞,常规培养并以0,15,30μg/ml ox-PAPC刺激,分别于刺激0,24,48,72,96小时用CCK-8法检测细胞活性;用含5%血清的培养基培养并以0,15,30μg/ml ox-PAPC刺激48小时,用caspase-3活性检测评价细胞凋亡。
  分别培养小鼠原代成骨细胞及MC3T3-E1前成骨细胞系,以成骨培养基,同时以15μg/ml ox-PAPC或PAPC刺激3小时,1天,3天,5天,提取总RNA,采用实时定量反转录-聚合酶链式反应(real time reverse transcription-polymerchain reaction,real time RT-PCR)技术分析成骨因子Runx2,oxterix,ALP和OC的表达变化。
  第二部分:ox-PAPC对经典Wnt信号通路及其诱导的成骨分化的影响及作用机制
  1.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/ml Wnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg/mloxPAPC刺激1天,采用细胞免疫荧光技术及Western blot技术检测β-catenin的细胞核/浆分布,评价ox-PAPC对经典Wnt通路活性水平的影响。
  2.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/mlWnt-3a或者20 ng/ml Wnt-3a加15μg/mloxPAPC刺激2天,检测细胞内ALP活性;刺激2天和3天,采用Western blot法分别检测Runx2及BSP蛋白水平的变化,以分析ox-PAPC对经典Wnt信号诱导的成骨分化的影响。
  3.培养MC3T3-E1细胞,以15μg/ml ox-PAPC刺激不同时间,采用Westernblot技术检测总ERK,总p38 MAPK及p-ERK,p-p38 MAPK水平,研究ox-PAPC刺激后ERK通路及p38 MAPK通路活性的动态变化;然后以20 ng/ml Wnt-3a和/或15μg/ml ox-PAPC刺激1小时,同样采用Western blot法检测总ERK,总p38MAPK及p-ERK,p-p38 MAPK水平,研究Wnt-3a和ox-PAPC分别对ERK及p38 MAPK通路活性的作用。
  4.培养MC3T3-E1细胞,以20 ng/ml Wnt-3a,15μg/ml oxPAPC加或不加ERK/p-38 MAPK通路抑制剂刺激细胞,同前述方法检测成骨因子的表达和活性变化以及经典Wnt信号通路的活性变化。
  结果:
  第一部分:
  成功分离培养原代小鼠颅骨成骨细胞,并经免疫细胞化学染色鉴定BSP(+);15和30μg/ml ox-PAPC可促进原代成骨细胞增殖,并促进5%血清培养条件下成骨细胞凋亡;而15μg/ml和30μg/ml浓度组间细胞增殖及凋亡均未见明显差异。原代成骨细胞及MC3T3-E1细胞,ox-PAPC刺激组成骨相关因子osterix,Runx2,ALP和OC mRNA表达明显降低;而PAPC刺激组各基因表达均无明显变化。
  第二部分:
  1.MC3T3-E1对照组细胞核内β-catenin表达水平较低,核内β-catenin表达阳性细胞较少,经典Wnt信号通路未激活;经Wnt-3a刺激后,核内β-catenin表达阳性的细胞增多,细胞核/浆β-catenin比值升高;Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,免疫荧光显示核内β-catenin表达阳性的细胞较Wnt-3a单独处理组减少,western定量结果显示细胞核/浆β-catenin蛋白比值较Wnt-3a单独处理组明显降低。
  2.MC3T3-E1以Wnt-3a刺激2天后,ALP活性升高,而以ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激后,ALP活性较Wnt-3a单独处理组明显下降。同样,Wnt-3a刺激2天后Runx2蛋白水平及3天后的BSP蛋白水平升高,ox-PAPC和Wnt-3a共同刺激组Runx2及BSP水平较Wnt-3a单独组均明显降低。
  3.MC3T3-E1经ox-PAPC刺激后,总ERK和总p38 MAPK水平无明显变化,而p-ERK及p-p38 MAPK的相对水平则高于对照组,其升高时间可持续至刺激后3小时。刺激1小时后,western结果显示ox-PAPC刺激明显升高p-ERK/ERK及p-p38 MAPK/p38 MAPK相对水平,而Wnt-3a对二者均无影响。
  4.MC3T3-E1经Wnt-3a和ox-PAPC共同刺激后,β-catenin核内表达阳性的细胞数较Wnt-3a单独处理组减少,核内表达降低,ALP活性和Runx2,BSP蛋白水平较Wnt-3a单独处理组明显下降。以ERK通路抑制剂PD98059与Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激细胞,可以消除上述ox-PAPC对β-catenin核内转移的抑制作用,逆转了ox-PAPC引起的ALP活性及Runx2和BSP蛋白表达水平下降,且与Wnt-3a单独处理组相比无显著差异。以p38 MAPK抑制剂SB203580与Wnt-3a+ox-PAPC共同刺激细胞,对β-catenin核内转移无影响,不能逆转ox-PAPC对Wnt-3a激活的成骨因子表达及活性的抑制作用,反而进一步降低ALP活性及Runx2蛋白表达水平。
  结论:
  1.Ox-PAPC促进原代小鼠成骨细胞增殖,在低血清培养高细胞密度情况下促进细胞凋亡。Ox-PAPC抑制MC3T3-E1细胞及原代成骨细胞内成骨相关因子osterix,Runx2和ALP,OC的mRNA表达;而PAPC对此无明显抑制作用。氧化磷脂对成骨分化和功能有抑制作用。
  2.Ox-PAPC抑制Wnt-3a激活的β-catenin核内转移,即抑制了经典Wnt通路激活;并抑制Wnt-3a激活的ALP活性及Runx2,BSP蛋白表达。ox-PAPC抑制经典Wnt信号诱导的成骨分化。
  3.Ox-PAPC激活ERK及p38 MAPK通路,阻断ERK通路可以逆转ox-PAPC对经典Wnt通路及对Wnt-3a激活的成骨分化的抑制作用。Ox-PAPC对经典Wnt通路及Wnt-3a诱导的成骨分化的抑制是通过ERK通路激活实现。
[博士论文] 杨中军
口腔颌面外科 山东大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  本研究是对山东地区非综合征唇腭裂患者进行收集,采样,并从外周血白细胞中提取基因组DNA,利用分子遗传学技术,对临床收集的非综合征唇腭裂患者进行MSX1基因和IRF6基因突变检测,寻找MSX1基因和IRF6基因突变携带者,进行突变基因型的生物信息学分析,探索MSX1基因和IRF6基因突变与非综合征唇腭裂的关系。
  方法:
  1)抽取患者及部分家系成员的外周静脉血2ml/人,另抽取正常人外周静脉血208份。EDTA抗凝,-70℃保存备用。采用全血基因组DNA试剂盒提取基因组DNA;
  2)聚合酶链式反应扩增MSX1和IRF6基因的全部外显子区域,将产物直接进行测序;
  3)从NCBI-Homologene数据库中提取人MSX1和IRF6蛋白的同源序列,将人MSX1蛋白(NP_002439.2)和9种脊椎动物的Msx1蛋白(NP_001182191.1,XP_001118871.2,XP_545946.2,NP_777223.1,NP_034965.2,NP_112321.1,NP_990819.1,NP_571348.1和NP_001032329.1)进行比对,从NCBI-Homologene数据库中提取人IRF6蛋白的同源序列。将人IRF6蛋白(NP_006138.1)和9种脊椎动物的Irf6蛋白(XP_514168.2,XP_001110321.1,XP_005622392.1,NP_001070402.1,NP_058547.2,NP_001102329.1,XP_417990.4,NP_956892.1和NP_001025493.1)进行比对,利用ClustalW2软件分析氨基酸的保守性;
  4)从NCBI-Homologene数据库中提取人MSX1蛋白的同源序列,运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较,并且利用PsiPred3.0程序对人MSX1的2D结构进行预测;从NCBI-Homologene数据库中提取人IRF6蛋白的同源序列。运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较,并且并且在线网站PredictProtein(http://www.predictprotein)的2D结构进行预测;
  5)运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较。利用在线网站(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析MSX1蛋白序列和IRF6蛋白保守性;6)利用在线软件Phyre(www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/)根据氨基酸序列一级保守性和已知蛋白结构预测野生型和突变型IRF6蛋白的三维结构,并使用PyMOL软件输出图像。
  结果:
  在54例非综合征性唇腭裂患儿中完成了MSX1和IRF6基因突变筛查。在编号13#患者中发现了MSX1基因第二外显子上的一个错义突变(c.492C>G; p.Cys164Trp)。先证者性别男,年龄1岁,单纯型唇裂,父母表型正常,没有唇腭裂家族史。在发现患儿存在MSX1基因突变后我们对父母追加了MSX1突变检测,父母基因型与正常人一致。检测到的突变位于cDNA序列的492位,编码的氨基酸为半胱氨酸(Cys),患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,编码的氨基酸变成色氨酸(Trp)。将人MSX1蛋白(NP_002439.2)和9种脊椎动物(P.troglodytes,M.mulatta,C.lupus,B.taurus,M.musculus,R.norvegicus,G.gallus,D.rerio和X.tropicalis)的Msx1蛋白(NP_001182191.1,XP_001118871.2,XP_545946.2,NP_777223.1,NP_034965.2,NP_112321.1,NP_990819.1,NP_571348.1和NP_001032329.1)进行比对,结果显示164位点的氨基酸Cys在生物进化过程中高度保守,提示该位点的突变可能导致氨基酸功能的改变。蛋白质二维结构分析显示,164Cys在为高度保守残基,位于保守的2D片段。这个残基的突变会影响人类MSX1蛋白质的功能。其中,p.Cys164Trp这一突变由半胱氨酸替换为色氨酸,半胱氨酸为一含有侧链的羟基氨基酸,这一突变可能会消除164Cys与邻近残基的静电作用,由带电残基转变为中性残基,带电性质的改变会严重影响蛋白的活性;另外半胱氨酸为亲水基团而色氨酸是疏水基团,亲疏水性质的改变会影响蛋白的活性。Weblogo分析显示在MSX1蛋白第164位堆栈只有C(Cys),表示该位点高度保守,提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。
  在54例非综合征性唇腭裂患儿中完成了IRF6基因测序,在一例散发性患儿中发现了IRF6基因的一个无义突变。研究编号40#,性别男,年龄1.5岁,单纯型腭裂。患儿是散发病例,没有获得亲生父母的DNA,家族史不详。测序结果与正常人基因组IRF6序列和对照组序列进行比对,显示IRF6基因第9外显子上的一个无义突变,可以导致IRF6蛋白在440位置终止(c.1320C>G;p.Tyr440X)。将人IRF6蛋白(NP_006138.1)和9种脊椎动物的(P.troglodytes,M.mulatta,C.lupus,B.taurus,M.musculus,R.norvegicus,G.gallus,D.rerio和X.tropicalis)的Irf6蛋白(XP_514168.2,XP_001110321.1,XP_005622392.1,NP_001070402.1,NP_058547.2,NP_001102329.1,XP_417990.4,NP_956892.1和NP_001025493.1)进行比对,结果显示440位点的氨基酸之后的序列高度保守,提示该改变对蛋白质功能影响较大。蛋白质二级结构预测显示,截短的蛋白质二级结构发生改变,提示突变以后对蛋白质功能有一定影响。Weblogo分析显示在IRF6蛋白第440位堆栈只有Y(Tyr),表示该位点高度保守,提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。蛋白三维结构预测显示截短的突变型IRF6蛋白三维结构发生改变,并形成了α-螺旋减少,对蛋白质功能造成了影响。
  结论:
  1、通过对临床收集的非综合征性唇腭裂患者MSX1基因筛查检测,发现了一个可能导致非综合征性唇腭裂的错义突变。
  (1)在编号13#患者中发现了MSX1基因第二外显子上的一个错义突变(c.492C>G; p.Cys164Trp)。检测到的突变位于cDNA序列的492位,编码的氨基酸为半胱氨酸(Cys),患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,编码的氨基酸变成色氨酸(Trp)。先证者的父母不存在此突变类型,该突变为新生突变。目前国内并没有关于MSX1突变可以导致非综合征唇腭裂的发生报道,本研究是首次在中国人群非综合征性唇腭裂患者中发现了一个MSX1基因突变。
  (2)对该位点进行生物信息学分析,显示该位点在生物进化过程中高度保守,突变可能影响蛋白质功能。将人MSX1蛋白和9种脊椎动物的Msx1蛋白进行比对,结果显示164位点的氨基酸Cys在生物进化过程中高度保守,Weblogo分析显示在MSX1蛋白第164位堆栈只有C(Cys),表示该位点高度保守。蛋白质二维结构分析显示,164Cys在为高度保守残基,位于保守的2D片段。这个残基的突变会影响人类MSX1蛋白质的功能。以上研究都提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。
  2、通过对临床收集的非综合征性唇腭裂患者IRF6基因筛查检测,发现了一个可能导致非综合征性唇腭裂的无义突变。
  (1)在54例非综合征患儿中完成了IRF6基因测序,在一例散发性患儿中发现了IRF6基因的一个无义突变。患儿是散发病例,没有获得亲生父母的DNA,家族史不详。测序结果与正常人基因组IRF6序列和对照组序列进行比对,显示IRF6基因第9外显子上的一个无义突变,可以导致IRF6蛋白在440位置终止(c.1320C>G; p.Tyr440X)。目前国内外已经有关于IRF6突变可以导致非综合征唇腭裂的报道,本研究首次报道了IRF6上的一个新的突变,有助于扩大IRF6突变的表达谱,为深入理解IRF6基因与非综合征性唇腭裂的关系打下了一定基础。
  (2)生物信息学分析显示,该突变对蛋白质功能及结构都有较大影响。将人IRF6蛋白和9种脊椎动物的的Irf6蛋白进行比对并进行Weblogo分析,结果显示440位点的氨基酸之后的序列高度保守,蛋白质二维和三维结构分析也显示突变蛋白截短后功能有一定改变。
  意义:
  非综合征性唇腭裂的致病基因一直是该领域研究的热点和难点。本研究通过对临床收集到非综合征性唇腭裂病例进行致病基因的突变筛查,在中国人群中检测到非综合征性唇腭裂致病基因和新突变类型,并对突变蛋白进行了生物信息学分析,进一步验证了突变蛋白和非综合征性唇腭裂的联系。本研究在首次发现了MSX1和IRF6基因上的两个新的突变类型,并进行了生物信息学分析,不仅可以加深对此类疾病的认识,而且有利于更加全面深入地了解相关致病基因的结构与功能,进而为研究非综合征性唇腭裂的分子机制提供线索,提高临床预防和治疗此类疾病的水平。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部