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[博士论文] 杜令倩
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本课题旨通过体内外实验探讨IFN-β修饰的人GMSCs对TSCC的生物学效应及作用机制,为临床治疗TSCC提供新思路。本实验分离培养人GMSCs,构建表达IFN-β的慢病毒载体及空载载体,分别转染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β、GMSCs/vector,检测GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在体外对TSCC细胞生物学活性的影响,并探讨其作用机制;使用裸鼠TSCC移植瘤模型来检测GMSCs/IFN-β是否能够选择性的迁移至肿瘤组织内,并作为IFN-β释放的载体发挥抑制TSCC生长的效应。
  材料与方法:
  1.有限稀释法克隆培养人GMSCs及其多向分化能力的检测
  牙龈标本取自进行牙冠延长术的健康牙龈组织,通过有限稀释法分离培养人GMSCs,并检测人GMSCs克隆形成能力、群体倍增值,流式细胞仪检测其细胞表面干细胞标志物的表达。为检测人GMSCs向成骨方向分化的能力,将GMSCs分别接种于6孔板和24孔板中,加入成骨诱导液进行培养,基础培养液为含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的细胞培养液(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM),诱导剂为50mg/L的维生素C、0.1μmol/L的地塞米松、10mmol/L的β-磷酸甘油钠,培养28天(days,d)以后,在24孔板中进行茜素红染液染色。
  2.IFN-β修饰的人GMSCs构建
  构建带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的表达IFN-β的慢病毒载体(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin-IFN-β)及空载体病毒(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),分别转染人GMSCs得到GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector,为检测携带IFN-β基因慢病毒的转染效率,转染一周后,通过qRT-PCR检测GMSCs/IFN-β及GMSCs/vector中IFN-β在mRNA水平的表达;并收集转染一周后的条件培养基(Condition medium,CM),通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CM中IFN-β蛋白的表达水平。
  3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β对TSCC细胞的体外生物学效应
  3.1.CM的收集
  使用CM来检测GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β对TSCC细胞系Cal27细胞生物学活性的影响。GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β以新鲜培养液培养24小时(hours,h)后,收集培养液作为CM,基础培养基作为空白对照组(含10%FBS的DMEM),含750pg/ml IFN-β的基础培养基作为阳性对照组。
  3.2.CCK-8(Cell counting kit-8)法检测细胞增殖
  TSCC细胞系Cal27细胞以1×103每孔的密度接入96孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,每天更换新鲜的刺激,于设计好的时间点每孔内加入100μl含10μl CCK-8的DMEM,培养箱内恒温孵育2h后,使用酶标仪检测450nm处OD值。
  3.3.克隆形成实验
  Cal27细胞以1×103每孔的密度接入6孔板,接种细胞24h后按照设计的组别加入刺激,每天更换新鲜的刺激,7d后采用结晶紫染色法染色,40倍镜下计数形成克隆的数量,大于或等于50个细胞算一个克隆。
  结果:
  1.分离培养的人GMSCs的生物学活性
  原代培养的人牙龈细胞呈成纤维细胞的形态特征,通过有限稀释法分离培养人GMSCs,经过14d培养后,通过克隆计数计算,人GMSCs的克隆形成率(colony forming unit-fibroblastic,CFU-F)为(21.4士2.8)%;人GMSCs传至12代时仍能表现出较高的生长活性,其群体倍增值为40.95士4.19;通过流式细胞仪检测,人GMSCs表达间充质源性干细胞表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和Stro-1,不表达造血源性干细胞表面标志物CD14、CD34、CD45;人GMSCs经成骨诱导剂培养28d后,茜素红钙盐染色显示诱导组人GMSCs形成红色的矿化结节;人GMSCs经成脂诱导剂培养28d后,油红O染色显示诱导组人GMSCs细胞内出现密集红染的脂肪小滴;经成软骨诱导剂培养28d后,免疫组织化学染色显示诱导组人GMSCs细胞团Ⅱ型胶原染色阳性;在qRT-PCR实验中,经过诱导的GMSCs组成骨相关基因(RUNX2、OPN和BSP2)、成脂相关基因(leptin、adipsin和PPARγ2)和成软骨相关基因(aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9)mRNA表达水平显著高于未加诱导剂的正常对照组。
  2.构建的GMSCs/IFN-β能够稳定表达分泌IFN-β
  携带IFN-β的慢病毒及空载体病毒转染人GMSCs后,人GMSCs形态未发生明显变化,细胞呈长梭形,有成纤维细胞的形态特征;转染慢病毒48h后荧光显微镜下观察,GMSCs/vector组与GMSCs/IFN-β组均有较强的荧光表达;QRT-PCR结果显示GMSCs/IFN-β组IFN-βmRNA表达量显著高于GMSCs、GMSCs/vector组(P<0.01);ELISA结果显示GMSCs/IFN-β组IFN-β分泌量为756.7±19.91pg/ml,显著高于GMSCs、GMSCs/vector组(P<0.01),表明GMSCs/IFN-β分泌的IFN-β蛋白水平与mRNA水平一致,而GMSCs与GMSCs/vector两组间IFN-β的表达无明显差异,实验结果证实GMSC/IFN-β能够稳定的表达分泌IFN-β。
  3.GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β在体外显著抑制Cal27细胞的生长增殖
  CCK8结果显示,与空白对照组相比,培养2d后,各实验组Cal27细胞生长增殖明显减慢(P<0.01);而GMSCs/vector组与GMSCs组相比,Cal27细胞生长活性无显著性差异;GMSCs/IFN-β组、IFN-β组,与GMSCs、GMSCs/vector组相比,表现出更显著的抑制Cal27细胞生长的效应(P<0.01);GMSCs/IFN-β组与IFN-β组对Cal27细胞生长增殖的抑制效应无明显差异。克隆形成实验得到类似的结果,与空白对照组相比,各实验组形成的克隆数目显著减少(P<0.01);而与GMSCs组相比,GMSCs/vector组Cal27细胞克隆形成数目无显著性差异;与GMSCs组、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β及IFN-β表现出更显著的抑制Cal27细胞克隆形成能力的效应(P<0.01);GMSCs/IFN-β组与IFN-β组Cal27细胞克隆形成数目无明显差异。为检测GMSCs、GMSCs/vector、GMSCs/IFN-β及IFN-β抑制Cal27细胞生长增殖的机制,使用流式细胞仪检测各组对细胞周期及凋亡的影响,结果显示,与空白对照组相比,各实验组对Cal27细胞的细胞周期无显著影响,各组Cal27细胞中S期细胞的所占的比例统计学差异;与空白对照组相比,各实验组均显著促进Cal27细胞凋亡(P<0.01);与GMSCs组、GMSCs/vector组相比,GMSCs/IFN-β及IFN-β表现出更显著的促进Cal27细胞凋亡的效应(P<0.01),结果证实GMSCs/IFN-β在体外显著抑制Cal27细胞的生长增殖并促进其凋亡。Western blotting结果显示,GMSCs/IFN-β作用后,Cal27细胞中AKT的磷酸化水平显著下降,提示GMSCs/IFN-β抑制Cal27细胞的生长增殖,可能与AKT信号通路的下调有关。
  结论:
  1.通过有限稀释法成功从人牙龈组织中分离培养出GMSCs。
  2.成功构建IFN-β修饰的人GMSCs(GMSCs/IFN-β),GMSCs/IFN-β能稳定表达分泌IFN-β。
  3.人GMSCs能够抑制TSCC细胞系Cal27细胞的生长增殖、迁移及侵袭,促进其凋亡,反映出GMSCs作为IFN-β释放载体对TSCC治疗的有效性和安全性。
  4.与GMSCs相比,GMSCs/IFN-β能够更显著地抑制TSCC细胞生长增殖、促进凋亡、抑制其侵袭和迁移,Western blotting结果提示GMSCs/IFN-β抑制Cal27细胞的生长增殖效应,可能与AKT信号通路的下调有关。
  5.尾静脉注射的GMSCs、GMSCs/vector及GMSCs/IFN-β能够向裸鼠TSCC移植瘤组织迁移并在体内抑制肿瘤组织的生长,GMSCs/IFN-β(i.v.)显示出比其他各组更为显著的抑制肿瘤生长的效应,结果提示GMSCs/IFN-β在肿瘤组织局部分泌释放IFN-β可能发挥抑制TSCC生长的效应,反映出GMSCs作为IFN-β释放载体对TSCC治疗安全有效,具有良好的应用前景。
[硕士论文] 周姝含
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  观察口腔鳞状细胞癌中OPN和TIP30的表达情况,研究上调OPN或TIP30后对舌鳞癌细胞cal-27细胞株生物行为的影响。
  研究方法:
  通过蛋白印迹(western blot)法检测口腔鳞状细胞癌组织(n=14),癌旁组织(n=14)和正常口腔黏膜(n=8)中OPN和TIP30的蛋白表达情况。分别通过感染或转染技术上调cal-27细胞株的OPN和TIP30。分别运用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法和蛋白印迹法检测感染或转染细胞株中OPN和TIP30的表达情况。通过CCK-8实验检测上调后cal-27细胞株的增殖能力,通过细胞划痕实验检测上调后cal-27细胞株的迁移能力。采用SPSS20.0软件分析上述结果。
  研究结果:
  1、OPN在口腔鳞癌,癌旁组织和口腔正常组织中的蛋白表达情况的比较
  采用单因素方差分析和多个样品均数的多重比较法分析。OPN蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达高于癌旁组织和正常口腔黏膜组织(P<0.001)。尚不能认为癌旁组织和正常口腔黏膜组织中OPN蛋白表达有差异(P=0.592)。
  2、TIP30在口腔鳞癌,癌旁组织和口腔正常组织中的蛋白表达情况的比较
  采用单因素方差分析和多个样品均数的多重比较法分析。TIP30蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达低于癌旁组织和正常口腔黏膜组织(P<0.001)。尚不能认为癌旁组织和正常口腔黏膜组织中TIP30蛋白表达有差异(P=0.540)。
  3、上调cal-27细胞株的OPN mRNA和蛋白表达检测
  采用配对T检验分析。感染shOPN病毒的cal-27细胞比对照组(shN)中OPN的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.001,P=0.002)。
  4、上调cal-27细胞株的TIP30mRNA和蛋白表达检测
  采用配对T检验分析。转染pTIP30质粒的cal-27细胞比对照组(pc3.0)中TIP30的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P=0.001,P=0.003)。
  5、OPN上调后cal-27细胞株的增殖能力检测
  采用多重重复测量资料的方差分析。cal-27-shOPN细胞的增殖能力强于cal-27-shN细胞(P<0.001)。
  6、TIP30上调后cal-27细胞株的增殖能力检测
  采用多重重复测量资料的方差分析。cal-27-pTIP30细胞的增殖能力低于cal-27-pc3.0细胞(P<0.001)。
  7、OPN上调后cal-27细胞株的迁移能力检测
  采用多重重复测量资料的方差分析。24h时,cal-27-shOPN细胞的迁移能力强于cal-27-shN细胞(P=0.002)。
  8、TIP30上调后cal-27细胞株的迁移能力检测
  采用多重重复测量资料的方差分析。24h时,cal-27-pTIP30细胞的迁移能力低于cal-27-pc3.0细胞(P=0.005)。
  研究结论:
  口腔鳞状细胞癌中,OPN的表达升高,TIP30的表达降低。上调cal-27细胞株的OPN表达,能提高细胞的增殖和迁移能力;上调cal-27细胞株的TIP30表达,能降低细胞的增殖和迁移能力。OPN在口腔鳞状细胞癌的发生、发展中有促进作用,而TIP30作用可能相反。
[博士论文] 崔言军
口腔颌面外科 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas OSCC)是一种起源于口腔粘膜上皮的头颈部最常见的恶性肿瘤,发病率约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上,位列全身恶性肿瘤的第八位。
  BNIP3(BCL2/adenovirus E1B19kd-interacting protein3)是一种能与腺病毒E1B19kD蛋白相互结合的促调亡蛋白,在多种肿瘤的发生发展中扮演着重要角色,缺氧条件下BNIP3基因可以诱导程序性细胞死亡或凋亡。近来研究发现BNIP3还可使得细胞发生自噬。
  microRNA(miRNA)是一类大小约17~25nt的小分子非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3'-UTR结合,降解或者抑制mRNA的翻译,实现对靶基因的负调控。
  本研究旨在探讨BNIP3在口腔鳞癌中的表达情况、可能的分子调节机制以及在口腔鳞癌细胞中的生物学作用,为临床治疗提供新的思路及依据,共分以下三部分。第一部分:应用Western Blot和荧光定量PCR方法,在细胞和组织水平上检测BNIP3与miR-150在口腔鳞癌中的表达水平,分析miR-150与BNIP3的相关性。第二部分:构建稳定过表达、沉默表达miR-150细胞株,观察miR-150对CAL-27细胞侵袭等生物学行为的影响,揭示miR-150在口腔鳞癌发生发展中的作用,为口腔鳞癌的早期诊断及靶向治疗提供参考依据。第三部分:Western Blot分析miR-150表达改变对BNIP3蛋白的调控作用,并在体外实验中研究miR-150对口腔鳞癌细胞自噬水平的影响,初步探讨miR-150在口腔鳞癌细胞内调控自噬的分子机制,为口腔鳞癌的分子治疗提供新的靶点。
  方法:
  1.运用实时荧光定量PCR技术,分别检测暴露在正常氧(20%O2)和低氧(1%O2)条件下的口腔鳞癌细胞CAL-27及配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织样本(n=8)中内源性miR-150和BNIP3的mRNA表达水平,并利用Spearman分析miR-150的表达与BNIP3是否存在相关性。
  2.利用Western Blot方法,分别检测暴露在正常氧(20%O2)和低氧(1%O2)条件下的口腔鳞癌细胞CAL-27及配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织样本(n=8)中内源性BNIP3的蛋白表达水平。
  3.采用锐博公司的转染试剂riboFECTTMCP Reagent,向CAL-27细胞中瞬时转染不同终浓度miR-150mimic和miR-150inhibitor,建立稳定过表达、沉默表达miR-150细胞株,转染48h后用荧光定量PCR检测miR-150的转染效率,鉴定并筛选效果最佳处理浓度,用于后续实验研究。
  4.运用细胞划痕实验、Transwell迁移实验及Transwell侵袭实验等方法检测过表达和沉默表达miR-150对口腔鳞癌细胞CAL-27迁移和侵袭的影响。
  5.建立体外低氧培养的口腔鳞癌细胞模型,模拟肿瘤低氧微环境,CAL-27细胞低氧(1%O2)暴露4h,8h,16h,24h后,通过细胞免疫荧光法检测自噬小体荧光颗粒的聚集;透射电镜观察自噬小体结构的数量;Western Blot检测细胞中表达自噬蛋白BNIP3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和P62的变化。
  6.采用miR-150mimic和miR-150inhibitor瞬时转染口腔鳞癌细胞CAL-27,应用Western Blot、细胞免疫荧光和细胞电镜方法,验证在低氧条件下miR-150对口腔鳞癌细胞自噬的影响。
  7.miR-150mimic和miR-150inhibitor转染CAL-27细胞,48h后通过Western Blot检测BNIP3蛋白的表达变化,验证miR-150对低氧条件下的CAL-27细胞中BNIP3有负调控作用。
  结果:
  1.miR-150在癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常口腔组织(P<0.05);低氧(1%O2)条件下的miR-150表达水平较正常氧(20%O2)组显著下调(P<0.05),以癌旁正常口腔组织的平均值作为对照,miR-150在CAL-27细胞中(1%O2)的表达水平显著低于8例正常口腔组织中miR-150表达的平均值(P<0.05)。
  2.相对于正常氧(20%O2)组,BNIP3mRNA在低氧(1%O2)条件中表达显著上调(P<0.05),BNIP3mRNA在癌组织中的表达水平亦显著高于癌旁正常口腔组织(P<0.05),以癌旁正常口腔组织的平均值作为对照,BNIP3mRNA在CAL-27细胞中(1%O2)的表达水平显著高于8例正常口腔组织中BNIP3mRNA表达的平均值(P<0.05)。Western Blot结果显示BNIP3的蛋白表达与mRNA表达情况趋势相同。
  3.Spearman相关分析显示在配对的8例口腔鳞癌组织和癌旁正常组织中miR-150的表达水平与BNIP3的表达存在负相关(r=-0.482,P<0.01)。
  4.荧光定量PCR结果显示,转染终浓度100nmol/L miR-150mimic组CAL-27细胞miR-150表达最高(P<0.01),因此,选择100nmol/L作为本实验miR-150mimic的处理浓度;转染终浓度50nmol/L miR-150inhibitor组CAL-27细胞miR-150表达最低(P<0.01),因此,选择50nmol/L作为本实验miR-150inhibitor的处理浓度,用于后续实验研究。
  5.划痕实验结果显示,转染miR-150mimic的CAL-27细胞迁移速度明显慢于对照组,其24h的迁移率分别为(14.28士2.46)%和(42.86士8.31)%,结果有显著性差异(P<0.05);而转染miR-150inhibitor的CAL-27细胞迁移速度明显快于对照组,其24h的迁移速度分别为(64.28士9.73)%和(35.71士2.59)%,结果有显著性差异(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的迁移能力。
  6.Transwell迁移实验结果显示,转染miR-150mimic的CAL-27细胞24h后的穿越Transwell膜的细胞数(32±12)较对照组(81±13)明显减少,差异具有显著统计学意义(P<0.05);而转染miR-150inhibitor的CAL-27细胞24h穿越Transwell膜的细胞数(173±15)较对照组(95±11)明显增加,差异具有显著统计学意义(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的迁移能力。
  7.Transwell侵袭实验显示,铺胶24h后,转染miR-150mimic的CAL-27细胞24h后的穿透基质胶的细胞数(35±09)较对照组(97±32)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);而转染miR-150inhibitor的CAL-27细胞24h穿透基质胶的细胞数(195±29)较对照组(99±25)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明过表达miR-150能在体外抑制口腔鳞癌细胞CAL-27的侵袭能力。
  8.口腔鳞癌细胞CAL-27暴露低氧(1%O2)环境4h、8h、16h、24h后,CAL-27细胞自噬激活,随低氧暴露时间延长呈上升趋势。在自噬模型中,Western Blot结果显示,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、BNIP3、Beclin-1表达上调,p62蛋白的表达降低;荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬泡和自噬小体数量均较低氧暴露前明显增加(P<0.05)。
  9.CAL-27细胞转染miR-150inhibitor低氧(1%O2)条件24h后,荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬泡和自噬小体数量相对于对照组(negative control),均明显增加(P<0.05),提示自噬水平增强;而转染miR-150mimic24h后,荧光显微镜观察细胞自噬小体荧光颗粒的聚集、透射电镜观察自噬泡和自噬小体数量相对于对照组(negative control),均明显减少(P<0.05),提示自噬水平减弱。
  10.低氧(1%O2)条件CAL-27细胞转染miR-150mimic48h后,BNIP3蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05);相反,转染miR-150inhibitor的CAL-27细胞48h后,BNIP3蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05),提示miR-150对低氧条件下的CAL-27细胞中BNIP3有负调控作用。
  结论:
  miR-150在口腔鳞癌组织和低氧暴露的CAL-27细胞中低表达,BNIP3在口腔鳞癌组织和低氧暴露的CAL-27细胞中高表达,miR-150与BNIP3的表达存在负相关;miR-150的过表达能够显著抑制口腔鳞癌细胞CAL-27迁移及侵袭;miR-150通过负向调控CAL-27细胞内BNIP3的蛋白表达抑制口腔鳞癌细胞自噬。
[博士论文] 朱晓远
耳鼻咽喉科学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:腺样囊性癌(Adenoid cystic carcinoma,ACC)是唾液腺肿瘤中侵袭性最强的恶性肿瘤之一,约占唾液腺癌的21%-24%,具有嗜神经生长的特性,超过60%的唾液腺腺样囊性癌的患者会复发并伴有远处转移。5年生存率较高,但10年甚至更长时间的生存率偏低,术后极易复发,治疗较棘手。目前,临床上对其没有行之有效的治疗方案。唾液腺腺样囊性癌(SACC,Salivary glands Adenoid cysticcarcinoma)对化疗不敏感,其主要的治疗手段为手术切除联合术后放疗。因为对常规治疗手段的治疗效果并不满意,我们需要进一步了解SACC的生物学行为和分子遗传学特征,试图提供新的见解和治疗策略。随着对腺样囊性癌发生发展的分子机制研究的深入,研究者们发现基因治疗可能是腺样囊性癌治疗的突破点。通过对在肿瘤发生发展中起到调控作用的基因的研究,我们或许能够以调控原癌基因的表达来抑制肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞凋亡,最终达到治疗SACC的目的。
  腺样囊性癌的分子水平下的发病机制是十分复杂的过程,其中染色体6q和9q之间的易位((6;9)(q22-23;p23-24))具有十分重要的作用。Persson等研究者首次报道这种易位能够导致MYB和NFIB基因融合,这种融合具有ACC特异性,占全部ACC发病原因中的86%,使其在分子水平有别于其他肿瘤。MYB-NFIB融合将导致MYB蛋白过表达,及MYB相关靶向基因的表达改变从而导致肿瘤的发生。目前,研究发现约40%人类SACC中都存在MYB-NFIB基因融合,全基因组测序也证实了MYB基因的改变在SACC中普遍存在,同时也在SACC中检测到NOTCH-1改变。NOTCH-1在不同肿瘤组织中作用不尽相同,促瘤和抑瘤作用同时存在,尚无其与MYB在SACC发生发展中之间相互作用的研究。另外,研究发现在不具有MYB-NFIB融合的SACC中也有超过50%具有完整长度MYB基因的过表达,而这种现象并不发生在唾液腺其他肿瘤中。另外,一些研究表明MYB与其下游信号通路的相互作用是导致SACC发生的重要因素。这些研究均提示MYB基因改变可能在SACC的发生发展中起重要作用。由于缺乏有效的研究模型,目前尚无MYB基因改变所引起的MYB过表达在SACC发生发展中作用的相关研究。
  据此,我们假设MYB过度表达作为原癌基因“启动子”在SACC发生发展中起着重要作用。本实验中我们采用TRE-MYB小鼠和MMTV-tTA小鼠进行杂交建立唾液腺和乳腺特异性过表达MYB的TRE-MYB-M.tTA转基因小鼠模型,进一步研究MYB基因在SACC发生发展中的作用,NOTCH-1是否与其共同影响这一过程。
  本课题针对以上相关问题分为以下三个部分进行研究:第一部分:建立TRE-MYB转基因,使用TetO-MYB和CMV-rtTA质粒共同转染细胞,通过观察其在多西环素作用下MYB的表达水平来对比小鼠和人类细胞对Tet-On系统的敏感性。在该系统的基础之上进一步建立TRE-MYB转基因小鼠模型。将TRE-MYB小鼠与MMTV.tTA小鼠进行杂交,从其后代中获得同时具有TRE-MYB和 MMTV.tTA基因的 TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。在TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中收集唾液腺肿瘤,从组织病理学角度对其进行鉴定,并检测其p63和c-KIT的表达水平;第二部分:对TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC的MYB表达水平进行检测,并观察在多西环素抑制MYB表达后对SACC的影响,从而对MYB在SACC发生发展中作用进行研究;第三部分:对TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC中NOTCH-1表达水平进行检测,研究其与MYB之间的相关性。初步探索SACC与其他相关肿瘤信号通路和肿瘤标记物的关系。
  第一部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠模型建立及其形成唾液腺腺样囊性癌鉴定
  目的:
  建立TRE-MYB-MtTA(+/+)转基因小鼠模型并对所形成SACC进行鉴定
  方法:
  使用CMV-rtTA和TetO-MYB质粒对小鼠SCC和人类ACC细胞进行转染,在多西环素的作用下观察对比各细胞MYB的表达水平,确定TRE-MYB转基因表征后进一步建立TRE-MYB转基因小鼠。将获得的TRE-MYB小鼠与获赠于美国内布拉斯加医学中心Dr.Wagner实验室的MMTV.tTA小鼠进行杂交,在其后代中筛选出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠并持续喂养。当TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC成瘤后,收集肿瘤,从组织病理学角度对其进行诊断。同时,在蛋白水平对其p63和c-KIT的表达进行检测。取小鼠正常唾液腺组织作为空白对照。
  结果:
  由CMV-rtTA和TetO-MYB质粒共同转染的细胞的MYB的表达能够受到多西环素的调控,并在此基础上成功建立了TRE-MYB转基因小鼠。通过TRE-MYB小鼠与MMTV.tTA小鼠杂交,在其后代成功筛选出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中共有9只小鼠成瘤,其中8只为唾液腺肿瘤(其中2只小鼠分别形成2个肿瘤,共10例,留取1只成瘤小鼠进行第二部分实验),1只为乳腺肿瘤,组织病理切片显示9例唾液腺肿瘤均为SACC,1例乳腺肿瘤为乳腺癌。正常唾液腺组织、SACC和乳腺癌中均在蛋白水平不同程度表达p63。空白对照组不表达或者低表达c-KIT,SACC均不同程度过表达c-KIT,乳腺癌不表达c-KIT。
  结论:
  成功建立TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠模型,其唾液腺所形成肿瘤均为SACC。TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC均不同程度的表达p63和c-KIT。
  第二部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中MYB基因的表达
  目的:
  研究MYB基因改变导致MYB过表达是否是TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠形成SACC的原因。
  方法:
  取第一部分小鼠肿瘤,分别采用Weatern Blot和免疫组织化学染色对MYB的表达进行检测,已正常唾液腺组织和乳腺癌作为对照。第一部分所留取的荷瘤小鼠采用含有2mg/ml多西环素的RO水持续喂养,测量初始肿瘤体积并每两天测量一次。最后取其肿瘤组织切片进行诊断,采用免疫组织化学染色对MYB表达进行检测。
  结果:
  Western Blotting结果显示9例TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠唾液腺腺样囊癌和1例乳腺癌均过表达MYB。免疫组化结果显示9例SACC均不同程度过表达MYB,乳腺癌中未见表达。多西环素喂养后的小鼠SACC初始肿瘤体积为4767mm3,其体积随天数增加明显缩小,83天后其体积为1368 mm3。其病理组织切片诊断为SACC,免疫组化显示存在MYB过表达但所表达的细胞数较少。
  结论:
  MYB基因改变导致MYB过表达可能是引起SACC发生发展的原因之一,抑制其表达能够使肿瘤消退。
  第三部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺样囊性癌中NOTCH-1表达及其与MYB基因的相关性
  目的:
  研究MYB是否与NOTCH-1基因协同作用促进TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC生成。初步探索SACC与其他相关肿瘤信号通路和肿瘤标记物的关系。
  方法:
  取第一部分TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成唾液腺腺样囊癌组织,分别采用Weatern Blot和免疫组织化学染色对NOTCH-1表达进行检测。采用Real-timePCR在mRNA水平上对Hes1、Hes5、Hey1和Hey2表达水平进行检测。
  结果:
  9例TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成唾液腺腺样囊癌在蛋白水平均不同程度过表达NOTCH-1。在mRNA表达水平,与空白对照组相比较,肿瘤组中Hes5、Hey1和Hey2的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  MYB与NOTCH-1基因的协同作用可能是促进SACC形成的原因之一。
[博士论文] 杨柳
口腔颌面外科 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  唾液腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是一种罕见的恶性肿瘤,仅占所有头颈部肿瘤的1%。其特点是较高的局部侵犯及远处转移,易转移至肺、肝和骨骼。远处转移患者存活率低于未转移者。目前,对于唾液腺腺样囊性癌的治疗尚无有效的解决方案,治疗手段仍是以手术联合放疗或者化疗的综合治疗为主,长期的生存率偏低,治疗效果不佳。由于缺乏具有特异性的肿瘤标志物,SACC治疗存在局限。随着对唾液腺腺样囊性癌生物学行为和分子机制研究的不断深入,能否找到更具有特异性的肿瘤标记物对诊断和治疗唾液腺腺样囊性癌有重大的意义。
  上皮间充质转化(EMT)是一个重要的生理病理过程,它导致大多数恶性肿瘤的复发和转移,在转移过程中上皮细胞转化为间充质细胞。Slug是EMT的转录因子,具有锌指结构,在EMT进程、癌细胞的入侵和转移、维持干细胞的特征中发挥重要作用。SACC肿瘤组织中,Slug蛋白表达升高且在其侵犯神经过程中Slug沉默可下调EMMPRIN,上调E-钙粘蛋白的表达,抑制EMT。
  BTB域是在真核生物中存在的蛋白质相互作用的基序。BTB/POZ结构域蛋白7(BTBD7)含有保守的BTB/POZ蛋白交互作用基序,包含明显的转录因子的结合位点,包括甲胎蛋白(AFP)1,CAAT增强子结合蛋β,GATA,激活蛋白等。近年来,BTBD7被认为是促进上皮组织重组和分支结构器官形成的调控因子。局部BTBD7高表达会引起Slug、E-钙粘蛋白的局部改变以及提高上皮细胞能动性。此外,BTBD7参与肺癌侵袭转移过程和肝细胞癌中的EMT。然而,BTBD7在唾液腺腺样囊性癌(SACC)中的作用研究未见报道。
  本研究通过免疫组织化学的方法,检测BTBD7和Slug在SACC组织中的表达情况,分析BTBD7的表达与临床病理参数以及患者预后的关系,分析其表达在SACC中的意义;通过基因沉默技术,进一步研究BTBD7沉默对高侵袭性SACC-LM肿瘤细胞体外侵袭、转移、增殖能力等生物学行为的影响,采用qRT-PCR技术和Western blot技术检测BTBD7沉默后Slug以及EMT相关基因的表达,探讨BTBD7在SACC中的生物学机制,为SACC的诊断和治疗提供新的靶点。
  方法:
  1、收集因病损手术切除的66例唾液腺腺样囊性癌患者的组织蜡块和15例正常的唾液腺组织蜡块,免疫组织化学法检测BTBD7及Slug蛋白在SACC组织和正常唾液腺组织中的表达,统计学分析检验BTBD7与Slug在SACC中表达的相关性以及与患者的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、组织类型,远处转移的相关性。
  2、Kaplan-Meier生存分析法分析BTBD7阳性与BTBD7阴性患者生存率的差异。COX多元比例风险分析探寻影响SACC患者生存的影响因素。
  3、细胞免疫荧光检测BTBD7及Slug在SACC-LM细胞及SACC-83细胞中的表达情况。
  4、利用小干扰RNA技术沉默SACC-LM细胞中BTBD7基因的表达,qRT-PCR技术和Western blot技术检测BTBD7、Slug以及EMT相关基因的mRNA和蛋白表达的变化。
  5、细胞划痕试验检测BTBD7基因沉默后SACC-LM细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力,MTT实验检测细胞的增殖能力。
  结果:
  1.在唾液腺腺样囊性癌组织中,BTBD7和Slug多为高表达,而在正常唾液腺组织中多为不表达或者低表达。BTBD7和Slug表达增高与SACC的TNM分级,组织类型、远处转移相关,与患者的年龄、性别、肿瘤的大小无关。在唾液腺腺样囊性癌组织中,BTBD7与Slug的阳性表达呈显著正相关,在Slug阳性表达的组织中,BTBD7阳性表达率为70.2%(33/47)。
  2.根据66位患有唾液腺腺样囊性癌的患者术后随访结果,Kaplan-Meier生存曲线表明,BTBD7阳性表达的患者总体存活率显著低于BTBD7阴性表达的患者。COX多元比例风险分析表明BTBD7阳性表达、Slug阳性表达和肿瘤的远处转移是患者预后的独立风险因素。BTBD7阳性表达的患者的生存风险是阴性表达患者的3.287倍。
  3.免疫荧光染色显示,BTBD7和Slug在SACC-LM和SACC-83细胞系中呈阳性表达。BTBD7阳性表达主要是位于两种细胞的胞质,Slug在两种细胞的胞质和胞核中均有表达。
  4.qRT-PCR技术和Western bolt技术检测发现,BTBD7基因沉默后,SACC-LM细胞中,BTBD7、Slug、MMP9的mRNA及蛋白的表达显著升高,相反,E-钙粘连蛋白的mRNA及蛋白的表达明显降低。
  5.沉默BTBD7基因,明显抑制SACC-LM细胞的迁移、侵袭能力,细胞的增殖能力未见明显的影响。
  结论:
  在唾液腺腺样囊性癌组织中,BTBD7阳性表达的患者生存率较低,预后差,预示其在SACC的发展进程中发挥着重要的作用。在唾液腺腺样囊性癌细胞系SACC-LM中,BTBD7基因沉默后能显著提高Slug mRNA及蛋白的表达并调控金属基质蛋白酶9和E-钙粘蛋白的表达,明显降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力,提示在SACC中,BTBD7可能作为Slug的上游基因调控肿瘤的EMT进程,为SACC的诊断、预后判断以及生物治疗提供新的生物学靶点。
[硕士论文] 彭欢
口腔医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  合成性质稳定的叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒,观察其对体外培养人鳞状上皮舌癌SCC-9细胞的抑制率,探讨纳米粒对肿瘤细胞的靶向作用机制。
  方法:
  采用离子交联法合成叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒,透射电镜观察其形态,纳米粒度分析仪测量纳米粒平均粒径、电位,检测载药率以及包封率。将体外培养的处于对数期的人鳞状上皮舌癌SCC-9细胞分为0、1、2、3、4、5、6、7八组。1、2、3组选用三个梯度浓度1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L的DAC处理细胞,4、5、6组采用同样三个浓度梯度1×10-7mol/L、1×10-6 mol/L、1×10-5mol/L的叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒处理细胞,7组为叶酸壳聚糖空载体组,0组为空白对照组。MTT法检测各组对舌癌细胞的抑制率。
  结果:
  叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒形态为球形,分布均匀,平均粒径为212nm,Zeta电位绝对值平均值为31.8mv,性质稳定。载药纳米粒的包封率为75%,载药率为18%。叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒组较单纯地西他滨组对人鳞状上皮舌癌SCC-9细胞抑制率高,且差异具有统计学意义。
  结论:
  (1)本实验成功合成叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒;
  (2)叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒性质稳定,载药率以及包封率较高;
  (3)叶酸壳聚糖载地西他滨纳米粒可能靶向作用于人鳞状上皮舌癌SCC-9细胞,抑制SCC-9的生长。
[硕士论文] 刘雪莹
口腔临床医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究叶酸偶联壳聚糖携带5'-氮杂-2'-脱氧胞苻(5-aza-2deoxycytidine,地西他滨,DAC)纳米粒对比5'-氮杂-2'-脱氧胞苷作用于体外培养的人鳞状上皮舌癌SCC-9细胞,了解叶酸偶联壳聚糖载药DAC对SCC-9细胞的p16基因和p16蛋白的表达情况,及对SCC-9细胞的抑制作用,从而探索叶酸偶联壳聚糖载药纳米粒携DAC对细胞的p16基因的高甲基化状态的还原能力的有效性,以及同时了解载药系统对细胞提高药效的能力。
  方法:合成叶酸壳聚糖载药DAC纳米粒,测其zeta电位证实其为稳定的纳米颗粒后,将SCC-9细胞分为0、1、2、3、4、5、6、7八组。2、3、4组选用三个梯度浓度1×10-7mol/L、1×10-6 mol/L、1×10-5mol/L的DAC进行处理细胞,5、6、7组采用同样三个浓度梯度1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L的叶酸壳聚糖载药DAC纳米粒处理细胞,0组为空白生理盐水对照组,1组为空白叶酸壳聚糖处理组,0组内设3个浓度的组内对照a、b、c,1组内设3个组内对照,为e、f、c组。观察叶酸壳聚糖载药DAC纳米颗粒对比DAC作用细胞,用MTT法测各组药物处理细胞5天内的SCC-9细胞抑制率;药物各自作用48小时后,实时荧光定量PCR法检测细胞中p16基因mRNA的表达和应用免疫组化SP法检测细胞p16的蛋白表达。
  结果:MTT结果表明相同浓度的叶酸-壳聚糖载药DAC纳米颗粒组药物对细胞的抑制率高于同样浓度下的DAC组(P<0.05),且药物对细胞的抑制率均与药物浓度呈正相关关系。实时荧光定量PCR结果显示2、3、4、5、6、7组的p16基因mRNA表达量显著高于0、1组(P<0.05)。0组和1组无统计学意义(P>0.05)。相同浓度的叶酸-壳聚糖载药DAC纳米颗粒组的p16基因的mRNA表达量高于同样浓度下的DAC组(P<0.05);免疫组化结果显示,2、3、4、5、6、7组相较于0、1组呈强阳性表达,有统计学意义(P<0.05),相同浓度的叶酸-壳聚糖载药DAC纳米颗粒组的p16蛋白的表达量高于同样浓度下的DAC组并具有统计学意义(P<0.05),0组和1组没有统计学意义(P>0.05)。
  结论:1.叶酸-壳聚糖载药纳米粒携带DAC和DAC均对SCC-9细胞有明显的去甲基化能力。
  2.叶酸-壳聚糖载药纳米粒携带DAC对比DAC具有更高效逆转SCC-9细胞p16基因甲基化状态,并具有促使p16基因mRNA和蛋白恢复表达的作用。
  3.叶酸-壳聚糖载药纳米粒携带DAC和DAC,去甲基化能力没有随着药物浓度升高而升高。
  4.叶酸-壳聚糖载药纳米粒携带DAC组对比DAC组,药物抑制率更明显。
[硕士论文] 杨蕾
口腔颌面外科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究5-氟尿嘧啶与顺铂联合诱导化疗方案舌鳞状细胞癌肿瘤组织中多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、P糖蛋白(P-gp)表达情况,探讨5-氟尿嘧啶与顺铂联合(PF)化疗方案诱导治疗对舌鳞状细胞癌多药耐药相关蛋白的关系及预后的影响。
  方法:
  1、收集经病理确诊为舌鳞状细胞癌的患者82例,根据治疗方式不同分为:PF诱导方案化疗+手术治疗组,单纯手术治疗组,每组各41例,通过回顾性分析对比两组临床基线资料之间的关系。
  2、免疫组化SP法:检测82例舌鳞状细胞癌组织中MRP1、MRP2、P-gp三种耐药相关蛋白的表达情况,对比PF化疗+手术治疗组中化疗前、后上述指标表达的差异。
  3、Log-rank检验、Kaplan-Meier法及COX模型分析上述三种蛋白及临床病理相关指标与舌鳞状细胞癌患者预后生存时间的关系。
  结果:
  1、PF诱导化疗+手术治疗组和单纯手术治疗组的临床病理参数分析结果显示:两组间的性别、年龄、病变部位,TNM分期,病理分级,淋巴结转移,肿瘤大小,颈清方式,复发/转移资料匹配。两组病例治疗前活检标本的MRP1、MRP2、P-gp表达差异均无显著性(P>0.05),提示两组之间具有可比性。
  2、PF诱导化疗后舌鳞状细胞癌中原发灶和区域淋巴结临床评价CR为1例(2.4%),PR为20例(48.7%),SD为19例(46.3%),PD为1例(2.5%),依据术后病理检查情况,达到总有效率(CR+PR)51.21%。
  3、PF化疗组诱导化疗前舌鳞状细胞癌组织中P-pg、MRP1和MRP2蛋白的阳性率分别为56.09%(23/41)、60.97%(25/41)和53.65%(22/41),经2个疗程化疗后TSCC组织中P-pg、MRP1和MRP2阳性率为70.73%(29/41)、78.05%(32/41)和51.22%(21/41)。其中P-pg、MRP1化疗前后阳性表达率差异均有显著性(P<0.05)。
  4、Kaplan-Meier法、COX模型多因素结果分析显示PF诱导化疗+手术治疗组,P-gp的表达、临床分期是影响舌鳞状细胞癌预后的独立危险因素。
  结论:
  1、PF诱导化疗后舌鳞状细胞癌组织中P-gp及MRP1蛋白表达较化疗前呈上调趋势,提示该方案可诱导舌鳞状细胞癌耐药性产生。
  2、PF诱导化疗后,P-gp的表达、临床分期是舌鳞状细胞癌预后的独立危险因素。
  3、舌鳞状细胞癌经5-氟尿嘧啶与顺铂联合诱导化疗,可使肿瘤缩小,缓解肿瘤发展,但PF诱导化疗方案与单纯手术治疗两种方案相比,5年总体生存率无显著性差异。
[硕士论文] 刘又彰
口腔临床医学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨青蒿琥酯(ART)与顺铂(DDP)单独给药或联合用药对裸鼠耐药细胞腮腺移植瘤的细胞增殖、耐药相关蛋白c-Myc及ABCG2及其mRNA表达的影响。
  方法:以人宫颈癌HELA细胞为亲本,经DDP低浓度、周期性体外诱导获得耐药子代癌细胞HELA-DDP,将耐药癌细胞接种于BALB/C-nu裸鼠一侧腮腺,建立耐药细胞腮腺移植瘤模型。接种7天后,触诊观察动物接种侧腮腺,如触及圆形或类圆形硬结,视为裸鼠腮腺移植瘤建模注射成功,而后应用随机表法将裸鼠分为生理盐水对照组、DDP1.0 mg/kg组、DDP2.0mg/kg组、ART50.0 mg/kg、ART100.0 mg/kg、ART200.0 mg/kg组、联合用药组(ART100 mg/kg+DDP1.0 mg/kg组),分别给予腹腔注射给药,各组隔天给药一次。给药30天后处死动物,获取瘤体标本,所获其余实验数据另文撰写。免疫组化法检测各组裸鼠腮腺移植瘤组织中c-Myc与ABCG2蛋白的表达水平;Western Blot法、实时荧光定量PCR法分别检测各组裸小鼠腮腺移植瘤组织中c-Myc与ABCG2基因的mRNA及蛋白表达水平。
  结果:
  1.实叫荧光定量PCR结果显示:ART从50 mg/kg剂量组至200 mg/kg剂量组均可抑制耐药痛细胞裸鼠腮腺移植瘤中c-Myc与ABCG2 mRNA的表达,与生理盐水组相比差异均具有显著性,与顺铂组相比差异均具有显著性。
  2.免疫组化结果显示: ART从50 mg/kg剂量组至200 mg/kg剂量组均可降低耐药癌细胞裸鼠腮腺移植瘤组织中c-Myc与ABCG2蛋白表达的平均光密度值,与生理盐水组相比差异具有显著性,与顺铂组相比差异具有显著性。
  3.Western Blot结果显示:ART从50 mg/kg剂量组至200 mg/kg剂量组均可降低耐药癌细胞裸鼠腮腺移植瘤组织中c-Myc与ABCG2蛋白表达水平,与生理盐水组相比差异均具有显著性。
  结论:
  1.ART具有抑制耐药癌细胞裸鼠移植瘤细胞增殖及逆转其耐药的作用。其可能与ART下调裸鼠移植瘤组织内c-Myc与ABCG2 mRNA和蛋白表达有关。
  2.ART和DDP联合用药时,ART既起到抑制肿瘤细胞增殖的作用,还起到逆转化疗耐药性的作用。
[博士论文] 梁晋
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的
  头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)主要影响口腔、舌咽部、口咽部、喉部以及涎腺等各个方面的功能,在口腔的恶性肿瘤类型中处于第六名的位置。而在口腔颌面部中的恶性肿瘤中,口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占了相当大的比例,大约80%左右。虽然近几年我们致力于OSCC的治疗以及相关发病的机制研究,并且取得了一定程度上的进展以及突破,但是在过去的几十年期间,口腔鳞状细胞癌病人的存活率却始终没有太过明显的提升和改善,平均每年确诊病例中死亡率仍可以达到50%甚至以上。舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)当中最为好发,具有较高的远处转移率和增殖能力。TSCC通常会导致言语,咀嚼及吞咽功能障碍。虽然,TSCC的治疗方案已经取得了一定进展,但TSCC的死亡率仍然很高。因此了解参与TSCC发展进程的分子机制,寻找TSCC的治疗靶点,发现TSCC新的治疗策略是有必要的。
  microRNA(miRNA)是一类非编码、并且拥有较小分子量的RNA,它发挥作用的方式是通过结合其靶基因mRNA的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR),在转录以后水平调控相关基因的表达。近年有学者通过实验发现,多种类型的miRNA分子通过沉默或者抑制癌基因表达的这种方式,从而参与到癌细胞生物程序的调控之中。已经有研究证实,miR-137在肿瘤发生发展中起重要作用。然而,miR-137在舌鳞状细胞癌中的作用的尚不清楚。为明确miR-137对舌鳞状细胞癌生物学行为的调控作用,并初步探索其分子生物学机制。本研究中,检测了舌鳞状细胞癌组织及细胞中,miR-137的表达的相对水平,并通过这种细胞转染miR-137mimic或着scramble检测细胞生物学行为的方式来改变。合成miR-137靶基因SP1的3’非编码区(untranslated regions,UTR)并插入海肾荧光素酶报告质粒。细胞用miR-137 mimic或scramble和pGL3-SP1-3'UTR或MUT3'UTR共转染48 h,利用双荧光素酶报告系统进行测定。从而探讨MicroRNA-137对舌鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响及对其分子调控机制的初步研究。
  方法
  第一部分:
  miR-137在舌鳞状细胞癌(TSCC)中的表达及表观遗传学对舌鳞状细胞癌细胞miR-137表达的调控。提取细胞总RNA,随后反转录过程成为cDNA,然后用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)来做内参,使用实时荧光定量PCR对舌鳞状细胞癌(TSCC)组织和其相关对照的正常组织进行一系列相关检测,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1和Cai27)、正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK) miR-137表达。舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1,UM1采用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)又或者采用组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理24 h。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用来测定细胞处理后miRNA-137的基因表达。
  第二部分:
  miR-137通过靶基因SP1对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1生物学行为产生影响。MTT试验、集落形成实验、细胞侵袭实验和细胞划痕实验来探讨miR-137 mimics和scramble转染舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1后对肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1分别转染miR-137 mimics,scramble后E-cadherin,N-catenin,Snail,Vimentin蛋白在舌鳞癌组织中的表达。靶向扫描(TargetScan)探究miR-137潜在的靶增殖基因。对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1用实时荧光定量PCR检测miR-137 mimics组、scramble组转染后SP1的表达。应用生物信息学和分子生物学技术,克隆SP1基因的3'UTR区并连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-REPORT上。所构建的新载体命名为pGL3-REPORT-SP1-3'UTR。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-137和SP1基因的靶向关系。
  结果
  第一部分:
  用实时荧光定量PCR分别检测25组舌鳞状细胞癌(TSCC)组织和25组正常对照组,分别测定了miR-137的表达。相对于正常对照组,TSCC组织中miR-137的表达下调。此外,我们也证明,与正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK)相比,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1和Ca127)中miR-137表达下调(P<0.001)。②TSCC细胞系SCC1,UM1用0.5,1.5及3μmol/L5-Aza-CdR(腔角质细胞甲基化抑制剂,5-氮杂-2'-脱氧胞苷,5-Aza-CdR)亦或是300 nmol/L的TSA(组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素,Trichostatin A,TSA)处理24 h。我们发现采用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR),亦或是组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古霉素A(TSA)处理后的舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1,UM1中miR-137表达均上调。
  第二部分:
  ①SCC1细胞系miR-137的表达量,转染scramble组和miR-137 mimic组分别是0.6327±0.12、32.725±0.34(P<0.001)。②MTT实验中,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics后,对细胞增殖的抑制能力相较于于对照组来说明显的提升,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。在集落形成实验当中,舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics组细胞集落数要明显的低于转染scramble组,而且此种差异具有统计学的意义(P<0.05),这提示着miR-137的表达可以显著的降低舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的增殖能力。③转染miR-137 mimics组较转染scramble组,上皮细胞生物学标志E-钙粘蛋白的表达升高,间充质细胞生物学标志N-钙粘蛋白、波性蛋白及Snail的表达降低。这些结果提示,miR-137抑制SCC1细胞的上皮间充质转化,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05)。④我们通过细胞体外侵袭实验得出结论:舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1转染miR-137 mimics组细胞数明显低于转染scramble组,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05),提示miR-137过表达能显著降低舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的侵袭能力。细胞划痕试验中,转染miR-137 mimics组细胞的划痕愈合速度较慢。提示miR-137过表达能有效的抑制细胞迁移能力,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。⑤在实时荧光定量PCR的实验检测当中我们可以看出,在SCC1细胞中, pGL3-REPORT-SP1-3'UTR与scramble共转染组、pGL3-REPORT-SP1-3'UTR与miR-137 mimics共转染组、pGL3-REPORT-MUT3'UTR与miR-137 mimics共转染组、pGL3-REPORT-MUT3'UTR与scramble共转染组的荧光素酶相对表达量分别为0.97±0.07、0.47±0.06、0.97±0.08、0.98±0.09,说明miR-137抑制了野生型SP13'UTR载体的荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05)。在Western-blot检测当中,SCC1细胞,转染miR-137mimics组与转染scramble组相比较,SP1蛋白的表达量明显的降低。MTT实验中,SP1与miR-137 mimics共转染组较control与scramble共转染组细胞增殖能力明显增高,且此种差异具有统计学方面的意义(P<0.05)。在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的相关检测当中,在SCC1细胞中,SP1与miR-137mimics共转染组较control与scramble共转染组,上皮细胞生物学标志E-钙粘蛋白的表达降低,间充质细胞生物学标志N-钙粘蛋白、波性蛋白及Snail的表达升高。这些结果提示,miR-137通过SP1调控SCC1细胞的上皮间充质转化,且此种差异具有统计学的意义(P<0.05)。
  结论
  1、相对于正常对照组织,舌鳞状细胞癌(TSCC)组织中miR-137的表达下调。与正常口腔角质细胞NOK16B细胞系和正常口腔角质细胞(NHOK)相比,在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系(SCC4,SCC1,UM1和Ca127)中miR-137表达均下调。
  2、在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞中,miR-137表达受表观遗传学调控。
  3、MiR-137抑制舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞的增殖能力、集落形成能力、上皮间充质转化、侵袭和迁移能力。
  4、在舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞系SCC1细胞中,MiR-137靶向于SP1,并通过SP1调控SCC1的增殖能力与上皮间充质转化。
[硕士论文] 孙福星
口腔医学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  检测肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)在成釉细胞瘤中的表达情况,探讨二者相关性及与成釉细胞瘤中微血管密度(microvessel density,MVD)的关系,初步探讨二者在成釉细胞瘤侵袭性生长中的作用机制。
  方法:
  收集成釉细胞瘤病理石蜡组织块43例作为研究对象,另收集正常口腔黏膜组织10例作为对照,采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)通用二步法分别检测两组中CD68标记的巨噬细胞、MMP-2和CD34标记的微血管密度的表达情况,结果判定后统计学处理分析,进一步讨论。
  结果:
  1、TAMs在ABs中的计数为27.48±17.64,主要表达于肿瘤基质;MMP-2在所有ABs中均有不同程度表达,主要表达于肿瘤实质;MVD在ABs中的计数为21.84±8.20。
  2、TAMs、MMP-2和MVD在ABs中的表达均高于正常黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.01)。
  3、在ABs中,MMP-2表达和TAMs计数呈正相关关系(rs=0.350,P<0.05),MVD计数随着 TAMs和 MMP-2的表达强度增加而增加,均成正相关关系(r=0.454,P<0.01;rs=0.459,P<0.01)。
  结论:
  1、TAMs和MMP-2在ABs中均有显著表达,参与ABs的发生发展;
  2、TAMs和MMP-2在ABs中的表达具有相关性,可能发挥协同作用;
  3、ABs中MVD较正常黏膜组织高,微血管生成参与肿瘤进展,TAMs和MMP-2可能发挥诱导血管生成作用促进ABs的侵袭性生长。
[博士论文] 赵丽娟
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),亦称涎腺腺样囊性癌,是头颈部一个重要的上皮源性恶性肿瘤,约占唾液腺恶性肿瘤的21-24%以及头颈部恶性肿瘤的1%左右。本病病程虽然进展缓慢但局部侵袭能力很强、血行性转移率高,容易侵犯周围神经和脉管,具有较高的复发率及远处转移率,尤其是易转移至肺部、骨及肝脏,其远处转移率可高达40%,被描述为头颈部最具有破坏性及最难以预测的肿瘤之一。虽然目前手术完全切除和辅助化疗已被证明可改善患者的长期生存率,但腺样囊性癌的预后仍然较差,局部复发及远处转移仍时有发生,即使是经过了根治性的手术切除及综合序列治疗后,或是原发部位已经得到良好控制后。腺样囊性癌的恶性增殖、转移对其复发具有重要影响,因此,寻找控制腺样囊性癌增殖的作用靶点,对其治疗、预后具有重要意义,而有丝分裂是真核细胞主要的增殖方式。
  有丝分裂异常是大多数恶性肿瘤发生的共同特征。纺锤体和动粒相关蛋白复合体亚基-1,或称为纺锤体与动粒相关蛋白-1(the spindle andkinetochore-associated complex subunit1,SKA1)的是一个新近发现的与有丝分裂相关的基因。SKA1蛋白定位于有丝分裂期间纺锤丝和外动粒界面,参与构成的纺锤体与动粒相关蛋白复合体(spindle and kinetochore associated complex,SKA复合体),是有丝分裂期间动粒与微管形成稳定结合所必需的组成部分。SKA复合体具有许多重要的功能,其能够调节微管的解聚,从而牵动姐妹染色单体的极向移动,确保有丝分裂的顺利完成。SKA复合体还具有沉默纺锤体检测点的功能,SKA复合体或其成员的损耗能够导致染色体排列不整齐或排列延迟,从而使检测点依赖的有丝分裂阻滞于分裂中期。研究发现,通过小分子RNA干扰的方式减少SKA1的表达后,虽然不会明显改变着丝粒的形态和结构,但会导致微管连结缺陷及染色体中期板集合延迟,引起严重的染色体分离缺陷。可见,SKA1及SKA复合体是确保有丝分裂顺利完成的关键组件,在真核细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用。
  目前的研究表明SKA1与肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤、非小细胞肺癌以及前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。采用RNA干扰技术沉默SKA1基因的表达后,发现上述恶性肿瘤的细胞增殖能力、克隆形成能力均明显下降,多数肿瘤的细胞周期也发生明显变化。多变量生存分析发现SKA1高表达是甲状腺乳头状癌淋巴结无瘤生存及远处转移无瘤生存的独立预后因素。也有研究发现,SKA1在肿瘤细胞中的表达与p21、ERK2、Bcl-2、Bax和磷酸化Akt等多个因子的表达相关。此外,SKA1与化疗药物顺铂的耐药也密切相关。上述研究表明,SKA1可能是通过多种机制影响肿瘤的恶性增殖及发生发展。提示SKA1基因有望成为一种新的肿瘤预后标志分子或肿瘤基因治疗的新靶点,对其进行RNA干涉,有可能成为肿瘤基因治疗的有效手段。目前,有关SKA1在头颈部腺样囊性癌中的相关作用尚未见有报道。本研究拟通过检测SKA1蛋白在头颈部腺样囊性癌组织中的表达,分析其与腺样囊性癌临床病理特征及预后的相关性;并进一步探讨SKA1在腺样囊性癌细胞恶性增殖、细胞周期及转移侵袭中的分子机制,以期为临床治疗及预后判断提供具有参考价值的科学理论依据。
  第一部分:SKA1在头颈部腺样囊性癌中的表达及临床意义的研究
  研究目的:检测SKA1在头颈部腺样囊性癌组织中的表达,分析SKA1表达的临床意义。
  研究方法:
  1.病例选择:本研究选取了聊城市人民医院2005年至2013年期间42例头颈部腺样囊性癌的石蜡包埋组织(其中40例纳入随访研究)。同时收集20例癌旁组织作为对照组。所有患者术前均未进行放射治疗、化疗、激素治疗以及其他任何抗肿瘤治疗。经两名不知晓临床病理资料的病理医师确诊为腺样囊性癌的样本纳入研究。
  2.免疫组化评估SKA1蛋白的表达:采用免疫组织化学SV(Super Vision)法判断ACC肿瘤组织组及癌旁正常组织组中SKA1蛋白的表达情况。免疫组织化学染色结果按照阳性细胞所占的百分比以及着色的深浅强度来进行综合判断。1)按照阳性细胞数占同类细胞数的百分比,可分为四组:①位于0-5%之间,为0分;②位于6-20%之间,为1分;③位于20-60%之间,为2分;④位于60-100%之间,为3分。2)按照阳性细胞的着色程度来判定评分:①细胞呈浅黄色显色为0分;②细胞着色黄色为1分;③细胞着色为棕黄色定为2分;④细胞着色为红褐色记为3分。总体评分=阳性细胞百分比评分×细胞着色强度评分,将0-1分定为阴性(-);2-4分计为阳性(+);>4分计为强阳性(++)
  3.统计学方法:采用SPSS16.0统计软件对各临床变量数据进行统计分析,组间比较采用Pearson卡方检验,病例数n≤1者采用Fisher确切概率法,以(P<0.05)为具有显著性差异。
  研究结果:
  1.SKA1在腺样囊性癌组织中的表达分布
  SKA1在腺样囊性癌组织中的阳性表达主要分布于肿瘤细胞内,包括导管细胞和变异肌上皮细胞,而肿瘤间质内未见明显着色。SKA1在腺样囊性癌癌细胞中的阳性表达表现为胞浆及/或胞核中的黄色或棕黄色颗粒沉淀。大部分阳性病例表现为胞核及胞浆均有着色,但细胞核着色强度更明显;个别病例则表现为仅胞浆存在着色。SKA1在腺样囊性癌组织中的表达明显高于其在癌旁正常组织中的表达,组间比较具有显著性差异(P<0.05)。
  2.SKA1的表达与腺样囊性癌临床病理特征及预后的关系
  临床资料统计分析表明,SKA1的表达在腺样囊性癌TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期患者的阳性率明显高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05),在SACC实性型中的表达水平明显高于筛孔状/管状型(P<0.05)。SKA1的表达与患者性别、年龄、有无淋巴结转移、有无神经侵袭以及患者5年生存率无明显相关,差别无统计学意义。40例患者的5年生存率为52.5%。
  结论:
  SACC肿瘤组中高表达SKA1蛋白,且在晚期患者及实性组织病理类型中表达明显增高,检测SKA1的表达有助于头颈部腺样囊性癌的诊断、治疗和预后判断。
  第二部分:SKA1调控涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83增殖与转移的分子机制
  研究目的:验证慢病毒介导的shSKA1是否能有效沉默涎腺腺样囊性癌细胞SKA1基因的表达,探讨SKA1调节头颈部腺样囊性癌恶性增殖及转移侵袭的分子机制。
  研究方法:
  1.慢病毒感染及感染效率评估:涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞被分为三组:Con组(空白对照细胞)、Lv-shCon组(阴性对照组/无义序列慢病毒感染的细胞组)和Lv-shSKA1组(靶向SKA1的慢病毒感染细胞组)。按照MOI=10,分别加入Lv-shSKA1慢病毒和Lv-shCon阴性对照慢病毒。感染3天,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,评估慢病毒对于腺样囊性癌SACC-83细胞的感染效率。
  2.荧光实时定量PCR(Real time PCR,qRT-PCR)检测SKA1 mRNA的表达:按说明Trizol1 ml提取总RNA,紫外分光光度法测定260 nm和280 nm两个波长处的光吸收,计算RNA浓度,逆转录反应,β-actin为内参基因行PCR反应,按照2-ΔΔCt法取RQ值(RQ=2-ΔΔCt)对基因表达进行相对定量。
  3.Western blot检测SKA1沉默后相关蛋白的表达:收集各组SACC细胞,观察细胞生长状态良好,细胞融合率达到80%以上,常规进行细胞裂解和蛋白提取,以及样品蛋白浓度测定。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)、转膜、加入一抗及二抗,按照ECL蛋白印迹显色试剂盒使用说明进行化学发光。
  4.MTT实验检测细胞增殖: MTT法检测SKA1基因沉默后对腺样囊性癌细胞增殖的影响,酶标仪测定595nm处的吸光值(OD595nm),以时间为横轴(X轴),光吸收值为纵轴(Y轴),绘制肿瘤细胞生长曲线。
  5.流式细胞仪(FIow cytometry, FCM)检测细胞周期:收集慢病毒感染的处于对数生长期的各组SACC细胞,按要求处理后PI(碘化丙啶)染色,过滤,上机,检测各组细胞的细胞周期分布。
  6.细胞伤口愈合实验(Wound healing assay)检测细胞迁移能力:分别收集处于对数生长期的各组SACC细胞,计数后接种到24孔板,常规培养至细胞单层融合,划痕,无血清培养基继续常规培养24 h后测量划痕距离。
  7.细胞侵袭实验(Transwell小室)检测细胞侵袭能力:按要求处理各组细胞后接种到已铺胶的Transwell小室,常规培养24 h后甲醇固定,0.1%结晶紫染色贴附在膜下室面的细胞,计数随机选取的5个高倍视野(40×)内的细胞。
  研究结果:
  1.免疫荧光显微镜下GFP阳性细胞计数结果显示无义序列慢病毒感染的细胞组(Lv-shCon组)和目的基因RNAi靶点慢病毒感染的细胞组(Lv-shSKA1组)的感染效率均高于80%。qRT-PCR和Western blot检测结果显示,Lv-shSKA1组中SKA1的mRNA和蛋白表达水平均显著低于Lv-shCon组。
  2.免疫印迹结果显示,沉默SKA1的表达后与腺样囊性癌细胞周期及转移侵袭相关的各种蛋白出现异常表达。表现为p27蛋白的表达上调,CDK4、CyclinD1, Cyclin E1, Cyclin B1及Ndc80蛋白的表达下降;E-cadherin表达上升而N-cadherin和MMP-9表达下调。
  3.MTT试验结果显示,与正常对照组和阴性对照慢病毒感染组相比,腺样囊性癌SACC-83细胞的Lv-shSKA1慢病毒感染组的细胞生长受到显著抑制。
  4.流式细胞术显示,SKA1基因被沉默后,SACC-83细胞的细胞周期阻滞于S期。
  5.细胞伤口愈合实验检测结果显示,Lv-shSKA1慢病毒感染组细胞迁移距离明显小于未转染组SACC-83细胞和Lv-shCon组细胞。
  6.Transwell小室体外侵袭实验结果显示,Lv-shSKA1慢病毒感染组的细胞穿过Matrigel胶贴附在膜下室面的细胞数明显少于正常对照组和阴性对照病毒感染组。
  结论:
  1.敲减SKA1基因在头颈部腺样囊性癌中的表达,可使细胞周期细胞周期阻滞于S期,有效抑制肿瘤细胞的增殖。
  2.SKA1基因沉默可下调细胞周期相关基因Ndc80,CDK4,Cyclin D1,CyclinE1,Cyclin B1的表达而促进p27蛋白的表达,进而阻滞细胞周期进程而细胞生长。
  3.敲减SKA1基因可促进E-cadherin但抑制N-cadherin的表达,抑制细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生,降低基质金属蛋白酶(MMP-9)的表达,抑制其对基底膜及细胞外基质的降解能力,达到其抑制腺样囊性癌细胞转移侵袭的目的。
  4.SKA1基因是头颈部腺样囊性癌肿瘤基因治疗的潜在新靶点。
[硕士论文] 许雪梅
眼科学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨JNK特定抑制剂SP600125对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移的影响及其机制。
  方法:用10、20、40μmol/L的JNK抑制剂SP600125处理人舌鳞癌Tca8113细胞24、48、72h,选用MTT法,检测SP600125对细胞增殖的抑制情况;选用细胞划痕实验检测SP600125对细胞迁移能力的影响。用10、20、40μmol/L的JNK抑制剂SP600125处理人舌鳞癌Tca8113细胞48h,选用免疫荧光实验,检测JNK和p-JNK蛋白的定位情况;选用Western blot,检测经SP600125处理后JNK和p-JNK蛋白的表达状况。
  结果:1.MTT结果显示:Tca8113细胞经10、20、40μmol/L SP600125分别处理24、48、72h后,与对照组相比,用药组的Tca8113细胞明显抑制增殖(P<0.01);呈现出浓度和时间依赖性。2.划痕实验结果显示:Tca8113细胞经10、20、40μmol/LSP600125分别处理24、48、72h后,与对照组相比,用药组的细胞移动距离短于对照组(P<0.01)。相同药物浓度时,用药时间越长,细胞移动距离越小;药物作用时间相同时,药物浓度越高,细胞移动距离越小。表明SP600125抑制Tca8113细胞的移动,呈现出浓度依赖性和时间依赖性。3.细胞免疫荧光染色结果显示:Tca8113细胞经10、20、40μmol/L SP600125处理48h,JNK蛋白主要定位在细胞质,用药组与对照组荧光密度未见明显变化;p-JNK蛋白主要定位在细胞质和细胞核内,用药组与对照组相比,随着用药浓度增加,其荧光密度减低。4.Western Blot结果显示:Tca8113细胞经10、20、40μ mol/L SP600125处理48h后提取蛋白,与对照组相比,经SP600125处理的Tca8113细胞中,p-JNK表达减少,且随着药物浓度的增加p-JNK表达越低(P<0.01)。表明SP600125抑制p-JNK的表达,呈浓度依赖性。
  结论:SP600125明显抑制Tca8113细胞的增殖、迁移,SP600125的抗肿瘤机制可能与JNK有关。
[硕士论文] 刘思强
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  从mRNA水平和蛋白水平两方面研究人类婆罗双树样基因4(SALL4)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas,OSCC)组织中的表达,并分析其与口腔鳞状细胞癌的临床病理参数之间的关系,并探讨其临床意义。
  材料与方法:
  收集2014年2月至2015年8月间,山东大学(山东省)口腔医院、齐鲁医院及山东省立医院口腔颌面外科收治的50例手术治疗且有完整资料的口腔鳞状细胞癌患者,以手术切除的口腔鳞状细胞癌组织作为实验组,并切取这些标本切缘的正常组织当对照组。
  分别采用RT-PCR、Western blotting、免疫组织化学方法(SP法),从mRNA水平和蛋白质水平两方面检测人类婆罗双树样基因4(SALL4)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas,OSCC)组织中的表达情况,并分析其与患者的性别、年龄、肿瘤的临床分期、肿瘤分化程度以及有无淋巴结的转移等临床病理参数之间的关系。应用SPSS17.0软件对所得的数据进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  1、RT-PCR的结果显示,SALL4 mRNA在口腔鳞状细胞癌组织(实验组)中的表达量高于癌旁正常组织(对照组),且具有统计学意义(P<0.05)。
  2、Western blotting的结果显示,SALL4蛋白在口腔鳞状细胞癌组织(实验组)中的表达水平高于其在癌旁正常组织(对照组)中的表达水平(以内参基因β-actin蛋白的表达作为标本质量参照),且差异具有统计学意义(P<0.05)。
  3、免疫组化染色(SP法)的结果显示,在口腔鳞状细胞癌组织中,SALL4蛋白的表达呈阳性,其阳性表达呈棕黄色颗粒状,定位于细胞核。SALL4蛋白在口腔鳞状细胞癌组织(实验组)中的阳性表达率(64%)高于其在癌旁正常组织(对照组)中的阳性表达率(14%),且差异具有统计学意义(P<0.05)。
  4、病例分组及SALL4与相关的临床病理参数的关系:按性别分组:SALL4阳性者,男性15例,女性17例,SALL4阴性者,男性8例,女性10例;按年龄分组:SALL4阳性者,年龄≤56岁14例,年龄>56岁18例,SALL4阴性者,年龄≤56岁7例,年龄>56岁11例;按肿瘤临床分期分组:SALL4阳性者,Ⅰ+Ⅱ期20例,Ⅲ+Ⅳ期12例,SALL4阴性者,Ⅰ+Ⅱ期16例,Ⅲ+Ⅳ期2例;按肿瘤的分化程度分组:SALL4阳性者,低分化5例,中分化8例,高分化19例,SALL4阴性者,低分化2例,中分化3例,高分化13例;按有无淋巴结转移分组:SALL4阳性者,无淋巴结转移15例,有淋巴结转移17例,SALL4阴性者,无淋巴结转移14例,有淋巴结转移4例。分别将以上分组中的参数与SALL4阳性表达的关系列表,进行统计学分析,结果显示:SALL4蛋白的表达与性别无关(P=0.869),与年龄无关(P=0.738),与肿瘤的分化程度无关(P=0.661);P值均>0.05。SALL4蛋白的表达与肿瘤的临床分期有关(P=0.046),与有无淋巴结转移有关(P=0.034);P值均<0.05。
  结论:
  1、SALL4在OSCC中的表达较癌旁正常组织中增高;在口腔鳞状细胞癌的临床病理诊断以及鉴别诊断中,SALL4具有一定作用,其可能作为一种具有良好敏感性及特异性的辅助指标。
  2、SALL4可能在OSCC的转移过程中发挥作用,但其具体的调控机制及生物学作用尚不明确,仍有待于进一步研究。
[硕士论文] 江南
口腔临床医学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:检测IL-35的两亚基Ebi3、IL-12p35在口腔白斑和口腔鳞癌组织中的表达情况,探讨IL-35在口腔白斑癌变过程中的作用,为口腔鳞癌的早期诊断及预后等方面提供新的参考指标。
  方法:1.口腔白斑32例,口腔鳞癌34例和正常口腔黏膜组织15例,石蜡包埋组织。采用免疫组织化学技术检测 IL-35的两个亚基 Ebi3、IL-12p35蛋白的表达变化分析其在口腔黏膜癌变过程中的变化趋势及意义。2.口腔鳞癌组织31例和正常口腔黏膜组织20例。采用qPCR技术检测基因Ebi3、p35在OSCC组织病损中的表达,分析上述因子与OSCC临床病理特征的关系。
  结果:1.Ebi3蛋白在正常口腔黏膜上皮无表达,但从口腔白斑单纯增生组织开始出现 Ebi3蛋白的阳性表达;Ebi3在口腔白斑组织中的阳性表达率31.25%(10/32),在 OSCC的阳性表达率为58.82%(20/34),两组间差异有统计学意义(χ2=5.055,P=0.025)。Ebi3阳性表达率及表达强度随上皮异常增生程度的增加而增加,二者存在正相关关系(r=0.409,P﹤0.05)。Ebi3蛋白表达与OSCC淋巴结转移有关(P﹤0.05),但与患者性别、年龄、分化程度以及肿瘤临床分期无关(P>0.05)。2.IL-12p35蛋白在正常口腔黏膜上皮无表达,但从口腔白斑单纯增生组织开始出现IL-12p35蛋白的阳性表达;IL-12p35在口腔白斑组织中的阳性表达率53.12%(17/32),在 OSCC的阳性表达率为67.65%(23/34),都高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05);但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。IL-12p35阳性表达率及表达强度随上皮异常增生程度的增加而增加,二者存在正相关关系(r=0.354,P﹤0.05)。IL-12p35蛋白表达与OSCC淋巴结转移有关(P﹤0.05),但与患者性别、年龄、分化程度以及肿瘤临床分期无关(P>0.05)。3.口腔鳞癌患者组织中 Ebi3、p35mRNA的相对表达量都高于对照组,差异有统计学意义(Z1=-3.119,P1=0.002;Z2=-2.116,P2=0.034),且与鳞癌患者的淋巴结转移有关(P?0.05)。
  结论:1. Ebi3、IL-12p35可能是口腔黏膜癌变的早期事件。2.Ebi3、IL-12p35蛋白的表达随着组织恶性程度增加而增加,提示在口腔鳞癌发展过程中,IL-35的免疫抑制作用越来越强的过程。3.IL-35有可能可以作为口腔鳞癌判断预后的新的检测指标。
[博士论文] 陈井鑫
外科学(整形) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:舌鳞状细胞癌是常见的口腔恶性肿瘤。临床上通常采用手术为主综合治疗,但死亡率仍然维持在较高水平。从基因水平探索舌鳞癌发生和发展机制,有可能在提高舌鳞癌患者的治愈率、降低死亡率等方面具有十分重要的科学意义。miR-149在多种不同类型的实体恶性肿瘤中具有抑癌基因的功能,SP1在包括胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞中的表达量均异常增高,且SP1高表达的患者其预后情况通常较差,这两者在舌癌中的研究还相对较少,所以希望通过研究miR-149和SP1在舌恶性肿瘤中的表达及及两者关系在舌癌发生和发展过程中的作用,为舌恶性肿瘤的治疗提供一些新的思路。
  目的:
  本研究拟检测miR-149在舌鳞癌患者肿瘤组织中的表达,探讨其与患者临床病例参数的相关性,分析miR-149的表达对舌鳞癌细胞增殖及转移过程可能发生的影响,探究miR-149信号活化对于舌鳞癌细胞中SP1表达的调控作用及对舌鳞癌细胞生物学行为的影响,有利于了解舌鳞癌的发生发展机制,同时为舌鳞癌的临床诊断以及靶向治疗提供依据。
  方法:
  (1)采集2014.1~2014.9期间我院口腔颌面外科舌鳞癌手术患者癌组织样本及相应癌旁组织样本,共62例。荧光定量PCR检测上述组织样本中miR-149的表达并分析其与患者临床参数的相关性。
  (2)构建miR-149mimic质粒并转染Tca8113和CAL-27细胞。荧光定量PCR检测转染后细胞中miR-149的表达。MTT法检测转染后细胞增殖情况,流式细胞术分别检测细胞周期和细胞凋亡情况,Transwell小室法检测细胞侵袭能力。
  (3)采用生物学软件分析miR-149的靶基因并筛选、构建野生型和突变型SP1质粒载体分别与miR-149mimic共转染Tca8113和CAL-27细胞,双荧光素酶检测试剂盒验证miR-149是否靶向调控SP1基因的3'UTR。荧光定量PCR和western blot法检测转染miR-149mimic后Tca8113和CAL-27细胞中SP1mRNA和蛋白的表达。
  结果:
  (1)荧光定量PCR检测结果显示舌鳞癌组织中miR-149的表达量明显低于癌旁相应正常组织(P<0.01)。
  (2)荧光定量PCR检测结果表明,成功构建miR-149过表达Tca8113和CAL-27细胞系。转染miR-149mimic后Tca8113和CAL-27细胞增殖率明显低于相应对照组(P<0.01)、侵袭细胞数量明显低于对照组(P<0.05)、细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。细胞周期检测G1/G0期细胞所占比例明显高于对照组(P<0.05),而S期细胞比例则显著低于对照组(P<0.05)。
  (3)SP1被预测为miR-149的靶基因,其在SP1上所绑定的位置位于miR-149的3'UTR区域。转染miR-149mimic后Tca8113和CAL-27细胞中SP1mRNA的表达量均明显低于对照组(P=0)、SP1蛋白的表达量均明显低于对照组(P<0.05)。
  结论:
  miR-149在舌鳞癌组织中呈低表达,且其表达量与舌鳞癌患者的组织学分级、临床分期以及远处转移密切相关。miR-149能够通过直接抑制SP1蛋白的表达来实现对舌鳞癌细胞增殖、侵袭以及细胞周期调控等一系列生物学过程的影响。
[博士论文] 周瑜
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  口腔黏膜鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,虽然目前采取了综合序列治疗手段,但仍存在着复发率及转移率高,尤其是晚期鳞癌患者,5年生存率仍然较低,预后较差。化疗是目前口腔鳞癌的主要治疗方法之一,但临床上越来越多的化疗药物耐药性的出现也是制约化疗疗效的最大的瓶颈。一些常用的化疗药物包括顺铂等一个重要的作用机制就是诱导肿瘤细胞内活性氧(Reactive oxigenspecies,ROS)的形成,同时,哺乳动物细胞内存在的大量的酶或者非酶类的抗氧化剂以对抗氧化剂包括活性氧的存在。一方面,在生理情况下,细胞内的氧化剂和非氧化剂保持着动态的平衡状态,另一方面,在肿瘤治疗过程中,抗氧化剂也可能对抗ROS的作用而减弱甚至抑制化疗药物的作用。
  谷胱甘肽(GSH)作为最主要的氧化还原调节器,紧密地控制着细胞内的氧化还原平衡,同时也与药物耐药紧密相关。迄今为止,已研究出一些特异性的谷胱甘肽探针,选择性的和定量的检测细胞内谷胱甘肽的变化。然而,就我们所知,目前尚没有任何一种探针被应用于显示通过诱导细胞内氧化还原状态的改变而促进细胞凋亡的过程。这次我们应用了一种新颖的选择性的谷胱甘肽荧光探针来实时检测口腔鳞癌细胞内谷胱甘肽水平的变化,及进一步实时检测在外源性氧化性损害及线粒体内谷胱甘肽清除后引起的氧化性应激及凋亡过程中谷胱甘肽水平的变化。通过本实验进一步了解谷胱甘肽尤其是线粒体内谷胱甘肽水平对细胞氧化性应激及细胞凋亡的影响。
  方法:
  1.检测细胞内GSH浓度变化:
  口腔鳞癌cal-27细胞在100μMH2O2,1 mMNAC及5050μM EA连续作用后,用谷胱甘肽探针显示试验前后谷胱甘肽的水平变化,在共聚焦显微镜下蓝色荧光代表着细胞内谷胱甘肽的水平。
  2.检测治疗前后细胞内GSH及ROS浓度变化:
  口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用GSH探针和DCF-DA探针检测细胞内GSH和ROS的水平变化。在共聚焦显微镜下显示蓝色荧光代表细胞内谷胱甘肽水平,绿色荧光代表细胞内活性氧水平。
  3.检测治疗前后线粒体内GSH及ROS浓度变化:
  口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用Mitotracker RedCM-H2XRos定位细胞线粒体,GSH探针和DCF-DA探针检测线粒体内GSH和ROS的水平变化。在共聚焦显微镜下显示红色荧光代表细胞线粒体,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度,绿色荧光代表ROS浓度。
  4.检测治疗前后细胞GSH浓度变化和细胞凋亡:
  口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用AnnexinⅤ-FITC探针检测细胞凋亡,GSH探针检测细胞内GSH浓度变化。在共聚焦显微镜下显示绿色荧光代表细胞凋亡的发生,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度。
  5.检测线粒体跨膜电位和谷胱甘肽
  口腔鳞癌cal-27细胞在H2O2及EA作用后,应用JC-1探针检测线粒体跨膜电位,GSH探针检测细胞内GSH浓度变化。在共聚焦显微镜下显示红色荧光代表线粒体跨膜电位的发生,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度。
  结果:
  1.药物作用前,细胞显示明亮的蓝色,在100μMH2O2作用半个小时后,蓝色荧光减弱,1mM NAC作用1h后,蓝色荧光增强,紧接着在50μM EA作用30min后,蓝色荧光显著减弱几乎消失。
  2.药物作用前,细胞显示明亮的蓝色荧光和微弱的绿色荧光,在100μMH2O2作用半个小时后,绿色荧光增强同时蓝色荧光减弱,在50μM EA作用30min后,绿色荧光明显增强同时蓝色荧光明显减弱。
  3.细胞显示红色、蓝色和绿色荧光,红色荧光表示细胞线粒体,红色和蓝色荧光合并后为紫色荧光,这是线粒体GSH。红色和绿色荧光合并后为橙色荧光,这是线粒体ROS。药物作用前,细胞发出明亮的紫色荧光和微弱的橙色荧光。在100μM H2O2作用半个小时后,紫色荧光减弱,橙色荧光增强,在50μM EA作用30min后,橙色荧光明显增强同时紫色荧光明显减弱。
  4.药物治疗前细胞显示明亮的蓝色荧光和微弱的绿色荧光,蓝色荧光代表细胞内GSH浓度,绿色荧光代表细胞凋亡。在100μMH2O2作用半个小时后,绿色荧光增强同时蓝色荧光减弱,在50μM EA作用30min后,绿色荧光明显增强,蓝色荧光明显减弱。
  5.药物作用前,细胞显示强烈的蓝色及红色荧光,表示细胞内高浓度的谷胱甘肽及高位的跨膜电位,在100μM H2O2作用半个小时后,蓝色及红色荧光均逐渐减弱,在50μM EA作用30min后,蓝色及红色荧光减低明显,几乎消失。
  结论:
  我们的研究显示,这种特异性的谷胱甘肽探针能够被应用来在口腔黏膜鳞癌细胞在H2O2作用及线粒体谷胱甘肽清除作用后发生的氧化性应激及凋亡过程中实时、定量的显示细胞内谷胱甘肽含量的变化。这种谷胱甘肽探针最大的优势在于我们能够实时地和定量地观察到细胞内GSH的变化过程。最后,我们还能得出结论:清除线粒体内的谷胱甘肽能够促进氧化性应激诱导的口腔黏膜鳞癌细胞cal-27的凋亡。
[博士论文] 林俊达
外科学(整形美容外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景
  口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤和肿瘤相关致死原因之一,每年新增病例约30万,死亡约15万人。尽管目前已经存在成熟的综合治疗手段,OSCC在近20年中的5年生存率仅升高了5%。治疗效果不佳的主要原因之一在于OSCC在疾病早期即容易发生局部浸润和远处转移。因此,调节肿瘤细胞侵袭活性的干预措施将可能为OSCC的治疗带来希望。细胞的运动行为主要依赖于细胞骨架的动态变化,包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架参与细胞运动的整个过程,为细胞运动提供动力,并参与运动调节因子的细胞内运输和分泌。驱动蛋白(kinesin,KIF)家族是一类与细胞骨架关系极为紧密的动力蛋白,与微管结合参与细胞分裂和胞内物质运输过程。许多KIF成员参与微管的组装和分解,从而调节细胞运动活性。我们之前的研究发现KIF家族成员在OSCC肿瘤局部高表达,表达水平与淋巴结转移风险相关。这提示KIF可能是OSCC发展、浸润和远处转移的重要调控因子,但具体的调节机制尚不清楚。
  除肿瘤细胞自身的生物学行为之外,肿瘤发展还受到周围组织的调控。肿瘤浸润免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,其中巨噬细胞所占比例最高。巨噬细胞根据外源性信号的调节可分化为具有抗肿瘤活性的M1型细胞和促进肿瘤的M2型细胞。肿瘤局部巨噬细胞的数量和表型、功能均与OSCC的侵袭转移风险有关。这提示OSCC是一种免疫敏感性肿瘤,靶向巨噬细胞的免疫治疗可能成为OSCC的可能治疗手段。
  褐藻多糖是一种提取白海洋植物褐藻的天然硫酸化多糖类物质,具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种活性,是良好的营养保健品和治疗药物。抗肿瘤是褐藻多糖的主要功能之一。褐藻多糖不仅影响肿瘤细胞的凋亡、迁移、侵袭等生物学行为,还对机体多种免疫细胞活性产生影响。然而,目前尚不清楚褐藻多糖对OSCC的发展是否存在影响。在本研究中,我们检测了褐藻多糖对舌鳞癌细胞系CAL27侵袭活性的影响以及对巨噬细胞募集和驯化的作用,并初步探究了作用机制。我们发现褐藻多糖通过KIF4A/MMP-2的作用通路调节CAL27细胞的侵袭活性,并通过调节CAL27细胞CCL3的分泌调节其对巨噬细胞的募集和驯化作用。
  第一部分褐藻多糖通过KIF4A/MMP-2通路调节口腔癌细胞侵袭活性
  目的
  KIF家族成员在细胞运动中发挥重要作用,但其在OSCC侵袭转移中的作用及调控机制尚未完全阐明。该部分将探究KIF家族成员在OSCC细胞侵袭行为中的影响,以及天然提取物褐藻多糖对OSCC细胞KIF表达及侵袭活性的调控作用。
  方法
  1.不同浓度(0,10,50,100,200μg/ml)的褐藻多糖处理人舌鳞癌细胞系CAL27细胞48h,transwell侵袭实验分析褐藻多糖对CAL27侵袭活性的影响。
  2.CCK-8实验检测100μg/ml褐藻多糖对CAL27细胞增殖活性的影响
  3.利用qRT-PCR技术探究褐藻多糖对CAL27细胞金属基质蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)表达的影响。
  4.利用qRT-PCR技术分析褐藻多糖对CAL27细胞KIF家族成员表达的影响。
  5.向CAL27细胞转染KIF4A siRNA以干扰其表达,利用transwell侵袭实验和qRT-PCR技术分别探究KIF4A敲除对CAL27细胞侵袭活性和MMP-2表达的影响。
  结果
  1.100及200μg/ml的褐藻多糖均显著抑制人舌鳞癌细胞系CAL27细胞的侵袭活性,其中100μg/ml的褐藻多糖对CAL27细胞增殖无明显影响。
  2.100μg/ml的褐藻多糖显著抑制CAL27细胞MMP-2的转录水平,但对MMP-9和MMP-14表达无明显影响。
  3.褐藻多糖显著抑制CAL27细胞KIF4A的转录水平,但对其他KIF家族成员如KIF1B、KIF2A、KIF3A、KIF3B和KIF5B的转录无明显影响。
  4.敲除CAL27细胞KIF4A表达显著抑制其MMP-2转录和侵袭活性。
  结论
  我们的研究首次发现褐藻多糖抑制人舌鳞癌细胞系CAL27的侵袭和MMP-2表达,这一作用可能需要KIF4A的参与。我们的研究结果提示KIF4A可能成为OSCC侵袭行为调节的可能作用靶点。
  第二部分褐藻多糖通过CCL3影响OSCC细胞对巨噬细胞的募集和驯化
  目的
  巨噬细胞影响口腔癌的发展过程,是口腔癌患者免疫治疗的潜在作用靶点。褐藻多糖具有免疫调节活性,之前的研究显示其影响巨噬细胞的迁移活性。然而目前尚不清楚褐藻多糖对口腔癌微环境中浸润的巨噬细胞有何影响。在该部分的研究中,我们探究了褐藻多糖对OSCC细胞对巨噬细胞募集和驯化的影响,并初步探究了作用机制。
  方法
  1.体外诱导生成THP-1来源巨噬细胞。收集褐藻多糖处理后的CAL27细胞上清,利用transwell实验探究褐藻多糖作用上清对THP-1来源巨噬细胞募集的影响。
  2.利用qRT-PCR和ELISA方法探究褐藻多糖对CAL27细胞趋化因子表达的影响。
  3.向有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体,检测CCL3对CAL27细胞募集THP-1来源巨噬细胞的影响。
  4.用有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基处理THP-1来源巨噬细胞。利用qRT-PCR和ELISA技术检测CAL27细胞条件培养基对巨噬细胞促炎及抗炎细胞因子分泌的影响。
  5.向有/无褐藻多糖作用的CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体,之后处理THP-1来源巨噬细胞。利用qRT-PCR和ELISA技术检测CCL3对巨噬细胞细胞因子分泌的影响。
  结果
  1.褐藻多糖处理后的CAL27细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞的募集作用显著增强。
  2.褐藻多糖显著促进CAL27细胞CCL3的转录和分泌,而对其他CCL趋化因子的表达无明显影响,如CCL2,CCL4,CCL5和CCL22等.
  3.加入CCL3中和抗体后,CAL27细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞的募集作用显著减弱。
  4.褐藻多糖处理后的CAL27细胞条件培养基促进THP-1来源巨噬细胞M1型因子IL-1和TNF-α的表达,而抑制M2型因子CCL22的表达。
  5.向CAL27条件培养基中加入CCL3中和抗体显著逆转褐藻多糖对IL-1和TNF-α表达的促进作用。
  结论
  我们的研究发现褐藻多糖促进CAL27细胞对巨噬细胞的募集作用,并驯化巨噬细胞向M1方向分化。这一过程依赖于CCL3的表达。这一研究结果提示褐藻多糖可能影响口腔癌局部的免疫状态,特别是肿瘤浸润巨噬细胞的数量及功能。褐藻多糖可能作为OSCC患者免疫治疗的辅助治疗手段。
[硕士论文] 粟芃芃
生物化学与分子生物学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:NOTCH信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡,在机体发育过程中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明:Notch信号通路在多种恶性肿瘤的发生、发展和预后中扮演重要角色,但其发挥致癌或抑癌作用通常依赖于所处的细胞环境。口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是最常见的人类恶性肿瘤之一,约占头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)的90%以上,其致病机理还不清楚。最新完成的HNSCC大型队列的全基因组研究表明人Notch1基因发生高频突变,提示Notch1基因与OSCC的发生发展关系密切。番荔枝内酯(Annonaceous acetogenins,ACGs)是从番荔枝科植物中提取的一类长链脂肪酸内酯化合物,对人白血病细胞、人肝癌细胞等有很强的抑制作用,具有强效抗肿瘤活性和能逆转多药耐药等特性,使其成为国内外抗肿瘤药研究热点。但其对OSCC的作用和分子机制仍不明确。
  目的:
  1.分析人Notch1基因在OSCC组织样本和细胞中的基因变异和表达差异。
  2.探讨ACGs对OSCC细胞的增殖、凋亡的影响及这些影响是否通过Notch1信号通路实现;在此基础上,上调或下调Notch1信号后,分析ACGs对OSCC细胞增值的影响,为OSCC防治提供研究基础。
  方法:
  1.通过TCGA和USCS数据库分析人Notch1基因在OSCC中的突变、表达差异和5年病人生存率。
  2.从5例OSCC及其癌旁组织中提取RNA,用qRT-PCR检测人Notch1基因的表达水平;通过17例OSCC及其癌旁组织的石蜡切片完成免疫组化,分析Notch1基因的表达差异。分别提取正常口腔上皮细胞和OSCC细胞的RNA和蛋白,qRT-PCR及Western blot检测上述两类细胞系中Notch1及其相关蛋白的表达。
  3.通过MTT实验检测ACGs对OSCC细胞增殖的影响,流式细胞技术检测ACGs对OSCC细胞凋亡的影响,同时分析ACGs作用OSCC细胞后Notch1蛋白及其转录因子RBP-Jκ和下游目标蛋白Hes1的表达。
  4.采用过表达Notch1胞内段(N1ICD)和DAPT抑制Notch1信号通路,进一步验证ACGs通过Notch1信号通路影响OSCC细胞的增殖。
  结果:
  1.TCGA和USCS数据库分析结果显示:人Notch1基因在HNSCC突变率高达20%,生存分析结果显示Notch1表达较高的病人5年生存期较长,值得关注的是大部分病人的癌组织中RBP-Jκ的表达高于癌旁组织。
  2.qRT-PCR结果表明:在5例OSCC病人中3个病人Notch1表达水平高于其配对的癌旁组织;免疫组化结果表明:17例OSCC切片中有11例病人癌组织的Notch1呈阳性,且其中部分病人癌组织分裂期细胞染色较深,显示强阳性结果;qRT-PCR及Western blot结果也显示3种OSCC细胞系中Notch1的表达均高于正常口腔上皮细胞NOK。
  3.MTT实验检测ACGs对OSCC细胞系SCC15和SCC25增殖的影响,结果表明:ACGs对SCC15和SCC25的增殖均有抑制作用,且随着ACGs剂量的升高,细胞凋亡数也增加,呈剂量依赖性。
  4.通过AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式细胞技术发现ACGs诱导SCC15和SCC25细胞发生凋亡,特别是发现SCC15发生晚期凋亡。
  5.Western blot结果表明:在ACGs作用下,SCC15细胞中Notch1、RBP-Jκ和Hes1的表达均随着剂量增加而减少,具有剂量依赖性。
  6.成功构建Notch1胞内段N1ICD真核表达质粒并在SCC15细胞中实现过表达。同未转染N1ICD的SCC15细胞相比,在ACGs作用下,过表达N1ICD的SCC15细胞的增殖明显;同未转染N1ICD的SCC15细胞相比,在ACGs和DAPT的共同作用下,过表达N1ICD的SCC15细胞的增殖能力被明显抑制。
  结论:
  1.人Notch1基因在OSCC中是高频突变基因,其表达水平同OSCC的5年生存时间有关;进一步研究显示人Notch1基因在OSCC组织和细胞水平上有较高的表达,表明人Notch1基因可能与OSCC的发生和发展密切相关。
  2.ACGs对OSCC细胞生长增殖有抑制作用,能抑制OSCC细胞的增殖、诱导细胞凋亡和坏死,ACGs作用于OSCC细胞后,Notch1及RBP-Jκ和Hes1的表达下降。上调和抑制Notch1信号水平影响ACGs对OSCC增殖抑制。
[硕士论文] 刘敏
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:姜黄素(curcumin)是从姜科、天南星科植物根茎中提取的一种天然色素,最早作为食品添加剂用于食品加工行业。近年研究发现,它具备抗癌、抗自由基、消炎、医治耐药性结核病的作用,其防癌抗癌的作用已经引起医学界的广泛兴趣,有研究表明它能参与抑制多种肿瘤细胞的生长,并且具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
  紫杉醇(paclitaxel)目前主要用于乳腺癌、卵巢癌的治疗,关于聚合微管蛋白,紫杉醇有强化作用,可以减弱肿瘤细胞的过度增殖,还可以增强肿瘤的放射敏感度,。越来越多的学者正在广泛研究其对机体多部位癌变的增殖抑制作用。
  本研究拟探讨姜黄素、紫杉醇以及姜黄素联合紫杉醇对离体人口腔鳞癌细胞增殖的抑制作用及细胞调亡作用,探索联合用药对人口腔鳞状细胞癌的叠加治疗效应,从而为姜黄素联合紫杉醇治疗人口腔鳞状细胞癌提供实验依据。
  研究目的
  探索姜黄素联合紫杉醇在抑制人口腔鳞癌细胞增殖和促进人口腔鳞癌细胞凋亡中的叠加效应。
  研究方法
  1.培养CAL27细胞系:复苏人口腔鳞状细胞癌CAL27细胞,进行体外胰酶的消化传代,察看培养后CAL27细胞系的状态和活性,选择处于对数生长期的CAL27细胞作为实验对象。
  2.观察不同浓度姜黄素或紫杉醇或二者联合用药对CAL27细胞增殖的影响。利用有差异浓度和种类的姜黄素、紫杉醇及二者联合用药作用于CAL27细胞,MTT法检测姜黄素、紫杉醇及联合用药对CAL27细胞增殖活性的影响。
  3.观察不同浓度姜黄素、紫杉醇和二者联合用药对CAL27细胞调亡的影响。利用有差异浓度和种类的姜黄素、紫杉醇、及二者联结用药作用于CAL27细胞,TUNEL法检测不同组CAL27细胞调亡情况的差异。
  4.通过Western-blot实验探讨姜黄素、紫杉醇及联合用药对凋亡蛋白分子Bcl-2、Bax和活性caspase-3的表达的影响。
  研究结果
  1.人口腔鳞癌细胞培育增殖稳定,呈贴壁生长,形态正常,肿瘤细胞较快增殖,约在培养第2天时达到对数生长期。姜黄素、紫杉醇单用于CAL27细胞时,药物浓度的提高能够强化对鳞癌细胞的增殖抑制作用,表现为浓度依赖性。
  2.姜黄素或紫杉醇单独作用于CAL27细胞时,细胞的增殖抑制作用随着时间增加而渐进加强,具有一定的时间依赖性。
  3.MTT实验表明在相同作用时间内,同浓度姜黄素联合紫杉醇相比单独用药能显著抑制CAL27细胞的增殖。
  4.TUNEL实验表明在相同作用时间内,同浓度姜黄素联合紫杉醇相比单独用药能显著增加CAL27细胞的凋亡数目。
  5.Western-blot实验表明在相同作用时间内,同浓度姜黄素联合紫杉醇相比单独用药使,Bcl-2蛋白表达明显下调、Bax2蛋白及活性Caspase-3蛋白表达明显上调。
  结论
  1.姜黄素或紫杉醇都有抑制CAL27细胞增殖的效应,联合用药具有叠加效应。
  2.姜黄素或紫杉醇均能诱导CAL27细胞细胞凋亡联合用药具有叠加效应。
  3.姜黄素或紫杉醇均能下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白及活性Caspase-3蛋白的表达,联合用药作用更加显著,并可以降低蛋白Bcl-2/Bax的比率。
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