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[硕士论文] 田永杰
卫生毒理学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:随着工农业社会的发展,各种化学物通过各种途径排入环境中,通过大气循环、水循环和食物链等方式进入人体。但是,当前关于致突变的安全性评价的相关研究课题大多是聚焦于对单一化合物的评价,如何评价两种或两种以上化学物致突变效果,目前研究少。不可回避的问题是在自然环境中是多种污染物共存的,各化学物在生物体内彼此影响,作用方式复杂,产生多种联合作用效应。本研究通过建立一种双信号重组酵母细胞模型,借助响应面分析法对有关实验参数进行回归拟合,结合响应面曲线和等高线的描述分析,可直观的得出各化学诱变原的交互作用结果。
  1.RAD54启动子的选择
  将2种不同长度RAD54启动子调控的yEGFP报告载体(pR1558-yEGFP,pR406-yEGFP)分别转入W303-1A酵母细胞中,构建成2种启动子调控的发光酵母细胞,分别命名为W303-1A/R1558-yEGFP和W303-1A/R406-yEGFP。用不同化学诱变原作用后,用流式细胞仪和多功能发光仪测酵母的发光强度,结果发现2种启动子调控的酵母细胞发光强度均与化学诱变原(甲磺酸甲脂、4-硝基-N氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明显的剂量效应关系,但是W303-1A/R1558-yEGFP剂量效应关系较为明显,产生的最大诱导倍数(5.96、2.19和2.71)明显高于W303-1A/R406-yEGFP所产生的最大诱导倍数(2.53、1.79和1.91),同时发现流式细胞仪测定效果明显优于发光仪。所以用RAD54全启动子调控重组发光酵母细胞进行联合基因毒性研究。
  2.RAD54全启动区调控的双信号发光酵母细胞的构建
  由于细胞的发光除与诱变原的诱导有关外,还受细胞数量和细胞“状态”的影响,利用DsRed-Express2(红色荧光蛋白)作为第二信号,建立R1558启动子调控的红、绿荧光蛋白基因发光酵母细胞。当化学诱变原作用于该重组酵母细胞时,yEGFP/DsRed-Express2(相对发光度)与化学诱变原间具有明显的剂量效应关系。
  3.响应面联合致突变分析方法的建立
  (1)首先对化学诱变原进行单因素基因毒性研究
  首先用化学诱变原对重组基因双信号发光酵母细胞进行单因素实验研究,用多功能发光分析仪分别测yEGFP和DsRed-Express2的发光强度,求其相对发光度。参照Ames实验判断的标准,即受试物作用于重组细胞后产生的相对发光度为对照1.5倍以上,并具有明显的剂量效应关系,则判断为阳性。根据剂量效应关系确定各化学诱变原作用闽浓度。
  (2)选用MMS、瘤可宁和顺铂进行联合基因毒性研究发现,三者交互作用参数(β123,P=0.011)有统计学意义,说明化学物间存在交互作用。进一步分析发现MMS与瘤可宁(β12,P=0.113)、瘤可宁和顺铂(β23,P=0.613)无统计学意义,而MMS和顺铂(β13,P<0.005)交互作用明显。再通过响应面等高线图分析可以看出MMS和顺铂之间不呈线性关系,随着浓度的升高曲线先呈弓弧线向内,再呈现弓弧线向外的趋势,说明两者之间在低浓度时有拮抗作用,高浓度时表现出协同作用。
  (3)选用5-氟尿嘧啶、喜树碱和羟基脲进行联合基因毒性研究发现,三者交互作用参数(β123,P<0.001)有统计学意义,说明三者之间存在交互作用。经过进一步分析发现5-氟尿嘧啶与喜树碱(β12,P=0.008)、5-氟尿嘧啶与羟基脲(β13,P=0.006)、喜树碱与羟基脲(β23,P=0.006),两两间存在不同程度的交互作用。从响应面曲线等高线图中可以看出喜树碱和5-Fu之间不呈线性关系,随着浓度的升高曲线呈现弓弧线向外的趋势,可见两者之间表现出协同作用。
[硕士论文] 张艳
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨亚硫酸钠是否通过脂肪细胞来影响肝脏细胞内甘油三酯(TG)与胆固醇含量,为研究亚硫酸钠的肝毒性作用机制提供参考。
  方法:
  将3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化,成为成熟脂肪细胞,并用油红O染色验证;用不同浓度(0.02、0.1、0.5、2.5 mmol/L)Na2SO3和1 mmol/L油酸(OA)染毒脂肪细胞12 h,收集脂肪细胞上清,再分别用上述收集的各组脂肪细胞上清染毒HepG2细胞24 h,即共培养组。另外再用同上述相同浓度(0.02、0.1、0.5、2.5 mmol/L)Na2SO3和1 mmol/L油酸单独培养HepG2细胞24 h,即单独培养组;采用游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒测定脂肪细胞上清中FFA含量;采用ELISA法测定脂肪细胞上清中脂联素的含量;采用GPO-POD酶法测定脂肪细胞培养上清中的TG含量;采用有机抽提法提取肝细胞内TG、总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC),再用POD酶法测定其含量;采用western blot法检测Na2SO3对单独培养组和共培养组肝细胞内TG代谢相关蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMPKα)、P-AMPKα、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、P-ACC、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FASN)、肉碱酯酰转移酶1(CPT-1)和胆固醇代谢相关蛋白3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)的相对表达水平。
  结果:
  1、与阴性对照相比Na2SO3各处理组脂肪细胞培养上清中FFA和脂联素的含量都明显减少(P<0.05),TG含量无明显变化(P>0.05)。
  2、Na2SO3处理后,单独培养细胞内TG含量无明显变化(P>0.05)。但是2.5 mmol/L亚硫酸钠可引起共培养HepG2细胞内TG的增加(P<0.05)。
  3、Western blot结果显示,Na2SO3处理后,单独培养肝细胞内SREBP-1c、AMPKα、P-ACC、CPT-1无明显变化(P>0.05);2.5 mmol/L Na2SO3组和OA组FASN蛋白表达增高(P<0.05);ACC除0.5 mmol/L Na2SO3变化不明显外,其余各组都升高(P<0.05)。共培养组,P-ACC、SREBP-1c、FASN、CPT-1无明显变化(P>0.05);未检测到P-AMPKα;AMPKα和ACC的蛋白表达均增高(P<0.05)。
  4、Na2SO3处理后,单独培养肝细胞内TC和FC含量的变化不明显(P>0.05);0.5 mmol/L Na2SO3、2.5 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L OA可引起共培养组肝脏细胞内TC降低(P<0.05);而2.5 mmol/L Na2SO3和1 mmol/L OA可引起共培养组肝脏细胞内FC含量增加(P<0.05)。
  5、Western blot结果显示,Na2SO3处理后,单独培养组肝细胞内HMGCR表达无明显变化(P>0.05);ACAT蛋白表达水平均增高(P<0.05);2.5 mmol/L Na2SO3使LDLR表达升高(P<0.05)。共培养组,HMGCR和LDLR蛋白表达无明显变化(P>0.05);ACAT蛋白表达增高(P<0.05)。
  结论:
  暴露在较低剂量的Na2SO3环境下时,不会引起肝脏TG和胆固醇的增加。但暴露于2.5 mmol/L较高浓度的Na2SO3环境下,机体不能代谢解毒Na2SO3,则可能通过脂肪细胞的作用使肝脏中TG和FC明显升高,TC的含量降低,对肝脏脂代谢产生影响。
[硕士论文] 王盼
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  以HepG2细胞作为模型,研究甲醛对肝细胞脂质代谢的影响,包括SREBP-1c-FAS通路(甘油三酯代谢相关)及Insig-1-SCAP-SREBPs通路(胆固醇代谢相关)的影响,从而为甲醛所引起的肝细胞脂质代谢紊乱提供依据。
  方法:
  分别以0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 mmol/L的甲醛(formaldehyde,FA)、完全培养基组(阴性对照)、1 mmol/L油酸(oleic acid,OA)及2.5μg/mL布雷德菌素A(Brefeldin A,BFA)处理人肝癌HepG2细胞24 h和48 h,采用MTT法检测细胞活性。分别以0.004、0.02、0.1 mmol/L的FA处理人肝癌HepG2细胞24 h和48 h,用POD酶法来测定细胞内和培养上清中甘油三酯(TG)、游离胆固醇(FC)的含量;采用Western blot法检测甘油三酯代谢相关腺苷酸活化蛋白激酶?(AMPKα)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶?(p-AMPKα)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC1)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC1)、脂肪酸合酶(FASN)、二酰甘油酰基转移酶1/2(DGAT1/2)、甘油三酯水解酶(CES3)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)以及胆固醇代谢相关固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、胆固醇酰基转移酶(ACAT)、胰岛素诱导基因1(Insig-1)、裂解激活蛋白(SCAP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)的蛋白表达水平;采用ELISA法分别检测细胞内极低密度脂蛋白(VLDL)、载脂蛋白B100(apoB100)、位点1蛋白酶(S1P)及位点2蛋白酶(S2P)的表达水平。
  结果:
  1、甲醛染毒24 h和48 h后,与对照组相比,0.5~12.5 mmol/L FA染毒均可明显降低HepG2细胞活性(P﹤0.05)。
  2、甲醛染毒24 h后,上清中TG水平增加;SREBP-1c、ACC1和FASN蛋白表达在24 h处理后显著增加。DGAT1蛋白表达在0.1 mmol/LFA处理24 h后显著增加,但在其他组表达减少;24 h处理后,CES3蛋白表达显著升高。
  3、甲醛染毒48 h后,细胞内甘油三酯含量明显降低;p-AMPKα蛋白在0.1 mmol/L FA组表达显著增加;SREBP-1c、ACC1和FASN蛋白表达均没有明显的变化;DGAT1蛋白表达降低;ATGL蛋白表达0.004mmol/L FA组表达明显减少。
  4、细胞在染毒处理24 h后,细胞内的游离胆固醇含量升高;HMGCR蛋白在各个处理组表达均明显增加;ACAT蛋白表达在各个处理组均明显降低;SREBP-2蛋白表达在0.1 mmol/LFA及OA组明显降低;Insig-1蛋白在染毒在0.004 mmol/LFA组表达降低,而在其余组表达均明显增加;LDLR蛋白表达在BFA组除外的处理组均明显降低。
  5、细胞在染毒处理48 h后,细胞内游离胆固醇含量明显增加;上清中的游离胆固醇含量在0.004、0.02 mmol/LFA组明显降低;HMGCR蛋白在各个处理组表达均明显增加;ACAT蛋白表达在0.02、0.1 mmol/LFA组有明显的降低;Insig-1蛋白表达水平在0.02、0.1 mmol/LFA组明显降低;LDLR蛋白表达水平在各个处理组均明显降低。
  结论:
  1、高浓度甲醛可明显抑制肝细胞的活性。
  2、甲醛接触可能通过SREBP-1c-FAS通路影响肝细胞甘油三酯的合成及分泌外排。
  3、甲醛接触可能通过Insig-1-SCAP-SREBPs通路影响肝细胞胆固醇的代谢。
  本课题为山西省回国留学人员科研资助项目“亚硫酸盐致肝细胞程序性坏死研究(编号:2014-034)”及山西省留学回国人员科技活动择优资助项目“甲醛对肝脏脂肪代谢的影响及其可能机制(编号:2014-376)”。
[硕士论文] 杨墨
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1、探讨纳米级炭黑颗粒的小鼠亚急性吸入毒性效应,并为纳米级炭黑颗粒的危险性评价提供毒理学数据;
  2、探讨吸入纳米级炭黑气溶胶致小鼠肺组织细胞凋亡损伤机制研究。
  方法:
  1、96只8周龄雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为低剂量组(15mg/m3)、高剂量组(30 mg/m3)和阴性对照组(滤过的洁净空气)。利用气溶胶发生器将纳米级炭黑气溶胶吹入各染毒柜中,每天染毒6 h,连续28 d。染毒期间,实时动态监测染毒柜内炭黑颗粒的粒径分布、空间分布及浓度变化,每周检测一次各组小鼠饲料、水的消耗量及体重的变化情况。末次染毒后24 h,取小鼠静脉血进行血液学及临床生化检查;解剖收集肺、心、肾、脾、肝等脏器,称重计算其脏器系数,并行组织病理学检查;检测肺组织纤维蛋白和细胞凋亡的水平,并应用透射电镜(TEM)观察肺组织的超微结构;支气管肺泡灌洗后,镜下对灌洗液中细胞进行分类计数并测定总蛋白浓度。
  2、15只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为低剂量组(15mg/m3)、高剂量组(30 mg/m3)和对照组,采用全身暴露动式吸入染毒模型连续染毒28 d。末次染毒后24 h,解剖收集小鼠肺脏。肺组织解剖取材后立即剪下适当大小肺组织块,制备成肺组织单细胞悬液,采用DCFH-DA探针标记法检测小鼠肺组织单细胞悬液中活性氧(ROS)的活性;解冻小鼠肺组织后将其制备成10%肺组织匀浆,并在一周内采用酶联免疫吸附法(ELISA)法分别检测肺组织匀浆中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性;分别采用TRIZOL法和RIPA裂解法从小鼠肺组织中提取总mRNA和蛋白,并用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)、免疫印迹(Westen Blot)、及免疫组织化学(IHC)、三种方法检测小鼠肺组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、PARP-1、Fas等凋亡相关蛋白的表达水平。
  结果:
  1、连续染毒28 d后,低剂量组炭黑气溶胶浓度约为(15.31±3.30)mg/m3,高剂量组浓度约为(30.05±14.20)mg/m3。染毒期间各组小鼠饲料、水的消耗量及体重变化均无显著差异。与对照组相比,染毒组小鼠血生化指标未见明显变化,血常规指标中只有红细胞计数、血红蛋白浓度和红细胞比容在染毒组中稍有增加。高剂量组小鼠肺脏器系数明显高于低剂量组和对照组(P=0.016),各剂量组心、肾脏器系数明显降低(P=0.001,P<0.001)。各剂量组小鼠肺组织呈灰黑色,支气管腔、肺泡腔内均可见炭黑颗粒物沉积,肺间质可见吞噬炭黑颗粒的巨噬细胞,且高剂量组炭黑颗粒沉积更多,肺组织纤毛被破坏、肺泡壁结构紊乱、肺间隔增厚、可见充血、炎细胞浸润等病理改变;低、高剂量小鼠肺组织损伤病理评分分别为6.63±1.13和9.8±0.38,明显高于对照组1.66±0.55。高剂量组小鼠脾淋巴细胞略有增多,其余脏器未发现明显异常;纤维蛋白染色可见高剂量组肺间质及支气管外周沉积了大量的纤维蛋白; Tunel细胞凋亡结果可见,各剂量组小鼠肺间质、肺泡腔及支气管腔内均可见棕黄色阳性细胞,高剂量组阳性细胞表达数目更多;透射电镜结果显示,对照组肺组织视野清晰,细胞器完整;低、高剂量组肺组织巨噬细胞内可见吞噬大量炭黑颗粒的囊状物,且初、次级溶酶体增多,肺II型上皮细胞体积增大,线粒体增多。低、高剂量组肺泡灌洗液中总细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数也明显多于对照组。
  2、低、高剂量组肺组织细胞中ROS活性分别是对照组的2.12和3.69倍(P<0.01),而肺组织CAT活性分别比对照组降低了33.66%和30.94%(P<0.01);高剂量组肺组织SOD活性和GSH-px活性明显高于对照组和低剂量组(P<0.05)。小鼠吸入暴露炭黑颗粒28 d后,染毒组小鼠肺组织Bax mRNA的表达水平明显高于对照组(P<0.05),高剂量组Caspase-3、Caspase-7、PARP-1 mRNA的表达水平明显高于对照组和低剂量染毒组(P<0.05),Caspase-8和Caspase-9 mRNA明显高于对照组(P<0.05),各组小鼠Bcl-2和Fas mRNA的表达没有显著差异;各组小鼠肺组织Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP-1蛋白的表达随染毒剂量的增加而呈上升趋势,且染毒组明显高于对照组(P<0.05),Bcl-2蛋白在各组小鼠中的表达无明显变化;免疫组化染色结果显示,各蛋白在染毒组内均有大量阳性细胞表达,明显多于对照组,且多集中在炭黑颗粒沉积的部位。
  结论:
  1、28 d连续吸入染毒纳米级炭黑气溶胶主要引发肺组织损伤,为后续开展纳米级炭黑颗粒肺毒性研究提供较为理想的模型和可靠的分析手段。
  2、长期吸入纳米级炭黑可引起小鼠肺组织氧化损伤和细胞凋亡,氧化应激反应可能是炭黑诱导肺细胞凋亡损伤的机制。内源性线粒体凋亡通路在炭黑颗粒引起的细胞凋亡损伤中扮演着重要的角色。
  本课题为国家自然科学基金“职业暴露柴油机尾气致健康损害生物标志物及其机制研究(编号:81130050)”和“自噬在纳米级碳黑致肺损伤过程中的作用及其机制研究(编号:81502845)”。
[硕士论文] 石磊
卫生毒理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  采用核磁共振技术,研究苯并(a)芘、大气PM2.5染毒大鼠肝和脑的代谢组学变化,分析其所涉及的代谢通路,探讨苯并(a)芘、PM2.5暴露对大鼠肝和脑损伤的可能机制,为寻找可能的早期生物学标志物,有效防控苯并(a)芘与PM2.5对人体的损害提供新的理论依据。
  方法:
  第一部分:选取24只健康雄性 SD大鼠,体重约为180-200g,随机将其分为4组,分别为溶剂对照组(橄榄油)、低剂量组(1mg/kg)、中剂量组(2.5mg/kg)、高剂量组(6.25mg/kg),每组6只;溶剂对照组腹腔注射橄榄油,低、中、高3个剂量组腹腔注射苯并(a)芘,每天1次,每周连续注射5天,染毒3周。腹主动脉采血,取肝和脑做病理检测和代谢组学检测。
  第二部分:利用 TH-1000CⅡ型大流量空气颗粒物采样器进行采样,采暖期将其放置在车流量较大的交通路口,获取大气 PM2.5颗粒物。选取健康雄性 SD大鼠36只,随机分为对照组(生理盐水1.5ml/kg体质量)、PM2.5低剂量组(1.5mg/kg体质量)、PM2.5中剂量组(6mg/kg体质量)、 PM2.5高剂量组(24mg/kg体质量)、PM2.5水溶性成分组(24 mg/kg体质量)和 PM2.5非水溶性成分组(24 mg/kg体质量),每组6只。采用大鼠气溶胶肺部给药套装,经气管雾化隔天染毒共5次。另选取健康雄性 SD大鼠36只,随机分为0天、1天、3天、5天、7天、9天染毒组,每组6只。采用大鼠气溶胶肺部给药套装,经气管雾化隔天染毒,染毒剂量为24mg/kg体质量。腹主动脉采血,取肝和脑进行病理学和代谢组学检测。
  采用 BRUKER AVANCEⅢ核磁共振(氢谱1H)检测平台,对各次所得的肝和脑组织进行代谢组学检测。运用 MestReNova软件、SIMCA-P11.0软件以及SPSS17.0软件进行分析,找出差异代谢物质。采用 MetaboAnalyst3.0(http://metaboanalyst.ca)并结合HMDB(Human Metabolome Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等数据库对涉及的相关代谢通路进行初步分析。
  结果:
  第一部分:苯并(a)芘染毒大鼠肝和脑代谢组学研究
  病理学结果:中剂量组肝细胞脂肪样变,高剂量组肝细胞脂肪样变,汇管区淋巴细胞浸润;各组未见脑组织出现明显病理学改变。
  肝代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为26、28、24种。其中有亮氨酸/异亮氨酸、缬氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、乳酸、甘油磷酸胆碱、精氨酸、糖蛋白随着剂量的升高而升高的趋势,有谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、缬氨酸、精氨酸、3-羟基丁酸显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05);中剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、缬氨酸、甘油磷酸胆碱、肌酸、乳酸、甘油三酯、糖蛋白显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05);高剂量组中亮氨酸/异亮氨酸、丙氨酸、醋酸盐、氧化型谷胱甘肽、甘氨酸、精氨酸、甘油磷酸胆碱显著升高,谷氨酸/谷氨酰胺、甜菜碱、牛磺酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油、马尿酸盐、乙酰乙酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示苯并(a)芘暴露可导致大鼠肝的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,酮体的合成和降解,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的变化。
  脑代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为18、21、19种。其中有2-氨基乙二酸、苹果酸随着剂量的升高而升高的趋势,有亮氨酸/异亮氨酸、乳酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、肌酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇、牛磺酸、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、赖氨酸、琥珀酸随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中丙氨酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、甘油磷酰胆碱显著降低(P<0.05);中剂量组中苹果酸、N-乙酰天冬氨酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、肌酸、磷酸胆碱、肌醇、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、琥珀酸、亮氨酸/异亮氨酸显著降低(P<0.05);高剂量组中2-氨基乙二酸显著升高,脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、甜菜碱、赖氨酸、N-乙酰糖蛋白、糖蛋白、肌酸、磷酸胆碱、肌醇、甘油、谷氨酰胺/谷氨酸盐、琥珀酸、乳酸、牛磺酸、甘油三酯显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示苯并(a)芘暴露可导致大鼠脑的丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖异生,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的变化。
  第二部分:大气PM2.5染毒大鼠肝和脑代谢组学研究
  病理学结果:低剂量组汇管区淋巴细胞浸润,中剂量组肝细胞脂肪样变,高剂量组肝细胞脂肪样变,炎性渗出,水溶性成分组肝细胞脂肪样变,非水溶性成分组汇管区淋巴细胞浸润,肝细胞脂肪样变;各组未见脑组织出现明显病理学改变。
  肝代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为23、25、27种。其中有LDL/VLDL、3-羟基丁酸、醋酸盐、肌酸、甘氨酸、甘油磷酰胆碱随着剂量的升高而升高的趋势,有缬氨酸、谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、糖原、赖氨酸、琥珀酸、谷胱甘肽、蛋氨酸、天冬氨酸、甘油随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中甘氨酸、乳酸显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、琥珀酸显著降低(P<0.05);中剂量组中甘氨酸、乳酸、LDL/VLDL、3-羟基丁酸显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、琥珀酸、谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、赖氨酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、缬氨酸显著降低(P<0.05);高剂量组中LDL/VLDL、3-羟基丁酸、醋酸盐、肌酸、甘油磷酰胆碱显著升高,糖原、蛋氨酸、甘油、乙酰乙酸、LDL/VLDL、3-羟基丁酸显著升高,谷氨酰胺/谷氨酸盐、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、β-葡萄糖、赖氨酸、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  时效关系结果,1、3、5、7、9天组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为25、24、19、21、27种。与0天组相对含量相比,有3-羟基丁酸、磷酸胆碱、亮氨酸/异亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、醋酸盐、丙氨酸、乙酰乙酸、马尿酸盐、肌醇、肌酸显著升高,牛磺酸、甜菜碱、胆碱、谷胱甘肽、天冬氨酸、β-葡萄糖、α-葡萄糖、糖原、乙酰乙酸、蛋氨酸、甘油、谷氨酸盐、乳酸、缬氨酸、琥珀酸、马尿酸盐、氧化谷胱甘肽、肌醇显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  不同组分结果,水溶性成分组、非水溶性成分组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为23、25种。与对照组相对含量相比,水溶性成分组中肌醇显著升高,甜菜碱、牛磺酸、甘油、谷氨酸盐、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖、乳酸、β-葡萄糖显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示水溶性成分可导致大鼠肝的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化;非水溶性成分组中肌醇、亮氨酸/异亮氨酸、3-羟基丁酸、磷酸胆碱、甘氨酸显著升高,甜菜碱、牛磺酸、甘油、谷氨酸盐、谷胱甘肽、天冬氨酸、α-葡萄糖、乙酰乙酸、蛋氨酸、糖原显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示非水溶性成分可导致大鼠肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的变化。
  脑代谢组学结果:低、中、高剂量组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为16、16、13种。其中有乳酸、γ-氨基丁酸、柠檬酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇、牛磺酸随着剂量的升高而降低的趋势(P趋势<0.05)。与对照组相对含量相比,低剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、N-乙酰基-糖蛋白显著降低(P<0.05);中剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、乳酸、磷酸胆碱、甜菜碱、肌醇显著降低(P<0.05);高剂量组中γ-氨基丁酸、牛磺酸、N-乙酰基-糖蛋白、乳酸、柠檬酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化。
  时效关系结果,1、3、5、7、9天组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为14、17、18、17、16种。与0天组相对含量相比,有乳酸、谷氨酸盐、γ-氨基丁酸、丙酮酸、柠檬酸、赖氨酸、甜菜碱、牛磺酸、甘油三酯、肌酸显著降低(P<0.05)。经代谢通路综合分析显示大气PM2.5暴露可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化。
  不同组分结果,水溶性成分组、非水溶性成分组通过检测并鉴定出VIP>1的差异代谢物分别为20、18种。与对照组相对含量相比,水溶性成分组中甜菜碱、γ-氨基丁酸显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示水溶性成分可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的变化;非水溶性成分组中甜菜碱、3-羟基丁酸、乳酸、N-乙酰基-糖蛋白、糖蛋白、氧化谷胱甘肽、脯氨酸、丙酮酸、柠檬酸、肌酸、甘油磷酰胆碱、牛磺酸、赖氨酸、琥珀酸、甘油三酯显著降低(P<0.05),经代谢通路综合分析显示非水溶性成分可导致大鼠脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环这些代谢通路的变化。
  结论:
  1.B(a)P、大气PM2.5短期染毒大鼠后肝和脑出现了小分子代谢谱的改变。
  2.B(a)P短期染毒可引起肝的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,酮体的合成和降解,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的改变,反应了B(a)P引起肝的氨基酸代谢、脂代谢、氧化应激的紊乱;B(a)P短期染毒可引起脑的丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖异生,甘油脂代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢这些代谢通路的改变,反应了B(a)P引起脑的能量代谢、脂代谢、氧化应激的紊乱。这些紊乱可能与大鼠肝、脑损伤的机制有关。
  3.大气PM2.5短期染毒可引起肝的酮体的合成和降解,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的改变,反应了PM2.5引起肝的氨基酸代谢、氧化应激的紊乱,水溶性成分、非水溶性成分可引起肝的丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,谷胱甘肽代谢这些代谢通路的改变,非水溶性成分还可以引起肝的酮体的合成和降解代谢通路的改变,不同组分亦引起氨基酸代谢、氧化应激的紊乱;大气PM2.5短期染毒可引起脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环,糖酵解或糖原异生这些代谢通路的改变,反应了PM2.5引起脑的脂代谢、能量代谢的紊乱,水溶性成分、非水溶性成分可引起脑的甘油脂代谢,丙酮酸代谢,柠檬酸循环这些代谢通路的改变,水溶性成分还可以引起脑的糖酵解或糖原异生代谢通路的改变,不同组分亦引起脂代谢、能量代谢的紊乱。这些紊乱可能与大鼠肝、脑损伤的机制有关。
[硕士论文] 续志斌
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  检测氯乙烯对大鼠DNA损伤作用,测定大鼠的全基因组DNA甲基化水平,检测癌基因KRAS,损伤修复基因CDKN2A、RASSF1A,DNA烷化损伤修复基因MGMT,抑癌基因SYK基因启动子区甲基化水平及mRNA的表达量改变,探讨氯乙烯致癌在遗传机制和表观遗传机制的关系。
  方法:
  选取96只健康大鼠,按体重随机分成4组,每组24只,分别为阴性对照组和低剂量(5mg/kg)、中剂量(25mg/kg)、高剂量(125mg/kg)三个氯乙烯染毒剂量组;腹腔注射,隔日染毒,每周三次。每组大鼠分别于6、8、12周随机处死8只,取其肝脏,应用彗星实验评价肝细胞DNA损伤水平,DNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)检测大鼠肝细胞全基因组甲基化水平,选用甲基化特异性PCR(QMSP)和实时荧光定量PCR(QPCR)分别检测上述基因启动子区甲基化水平及mRNA的表达量。采用SPSS22.0对实验数据进行统计分析,本次实验数据符合正态或近似正态分布,采用单因素方差分析ANOVA进行组间比较,两两比较采用LSD法;相关性分析采用双变量相关分析,选用Pearson相关系数,显著性水平为α=0.05。
  结果:
  1、氯乙烯可诱发大鼠肝脏组织肝细胞坏死,肝脂肪变性,肝硬化等组织病理变化,大鼠肝细胞DNA损伤水平随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长而升高,肝细胞全基因组甲基化水平在染毒组中明显均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.大鼠肝细胞5种基因启动子区甲基化水平的改变:
  2.1.各组别之间比较:氯乙烯染毒6周时,各染毒组大鼠肝细胞MGMT基因启动子区甲基化水平均高于对照组(P<0.05),mRNA的表达量随着剂量的增加而升高;染毒8周时,染毒组KRAS、SYK甲基化水平随着染毒剂量的增加而下降,SYK mRNA的表达量随着染毒剂量的增加而升高;染毒12周时,RASSF1A、MGMT甲基化水平随着染毒剂量的增加而明显升高,RASSF1A mRNA表达量随着染毒剂量的增加而下降。
  2.2.各染毒时间之间比较:对照组中,KRAS、CDKN2A、RASSF1A、MGMT、SYK基因启动子区甲基化水平及mRNA表达量在各染毒时间差异无统计学意义(P>0.05);低剂量组中,MGMT、SYK甲基化水平随着染毒时间的延长而下降,MGMT mRNA表达量随着染毒时间的延长而升高;中剂量组中,KRAS、MGMT、SYK甲基化水平在8周和12周时低于6周(P<0.05),mRNA表达量随着染毒时间的延长而升高;高剂量组中,CDKN2A、RASSF1A基因甲基化水平在6周和8周时低于12周(P<0.05),RASSF1A mRNA表达量在6周和8周明显高于12周(P<0.05)。
  3.大鼠肝细胞DNA损伤和相关基因甲基化相关性分析:大鼠肝细胞DNA损伤与RASSF1A、MGMT基因启动子区甲基化水平呈正相关关系(P<0.05)。
  结论:
  1.氯乙烯可引起大鼠肝细胞DNA损伤增加,全基因组甲基化水平升高。
  2.氯乙烯可引起KRAS和SYK基因启动子区甲基化水平的下降,CDKN2A、MGMT甲基化水平的升高。在短期、低剂量下,氯乙烯可引起RASSF1A启动子区甲基化水平下降,mRNA表达量增加;但当染毒时间延长,染毒剂量增加时,RASS1A启动子区甲基化水平升高,mRNA表达量下降。
  3.氯乙烯引起RASSF1A、MGMT基因启动子区甲基化水平的升高可能影响大鼠肝细胞DNA损伤的修复,使大鼠肝细胞DNA损伤增加。
  本课题为山西省基础研究计划项目(编号:2013011059-1),山西省回国留学人员科研资助项目(编号:2016-056)两项课题资助。
[硕士论文] 康静
卫生毒理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.研究己烯雌酚(DES)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、丙基硫脲嘧啶(PTU)三种类型内分泌干扰物对GT1-7神经细胞增殖的剂量效应关系;
  2.研究DES、DBP、PTU对GT1-7神经细胞分泌GnRH的影响及其联合作用;
  3.研究DES、DBP、PTU联合暴露对GT1-7神经细胞分泌GnRH的可能机制。
  方法:
  1.采用永生化的下丘脑GT1-7神经细胞模型,将三种受试物暴露24h后进行相关实验。选择的受试物及其浓度为:DES为0.1、1、10、100、1000μmol/L, DBP为0.01、1、10、100、1000μmol/L,PTU为0.0001、0.01、1、100、1000μmol/L,联合作用的浓度设计为 DES0.1-1000μmol/L, DBP0.01μmol/L, PTU0.0001μmol/L。
  2. CCK-8法检测三种物质单独暴露和联合暴露的GT1-7细胞存活率。
  3. GnRH放免试剂盒检测单独暴露组及联合暴露组细胞培养液中GnRH的分泌量。
  4. Western Blot检测联合暴露组PLC、GPR54、PKC、GnRH蛋白表达量。
  5. RT-PCR检测暴露组PLC、GPR54、PKC、GnRH基因表达量。
  结果:
  1. GT1-7细胞单独暴露于DES时,各染毒组细胞存活率由110%降至4%左右,暴露于DBP时各组细胞存活率由130%降至60%左右,均表现为随浓度的增大细胞存活率呈现先增加后降低的趋势。细胞单独暴露于PTU时,各组的细胞存活率相比对照组有所增加,但基本维持在一定水平120%-135%左右。DES、DBP、PTU单独作用时,其浓度分别低于10μmol/L、100μmol/L、1000μmol/L时GT1-7细胞存活率在90%以上。而GT1-7细胞单独暴露于此三种物质时对GnRH的分泌量的影响则表现为随DES浓度的增大呈现先增加后降低趋势,对照组2.36μg/ml,染毒组由6.26μg/ml降至2.19μg/ml;随DBP浓度的增大呈降低趋势,由对照组2.60μg/ml降至染毒组1.66μg/ml、1.95μg/ml;随PTU浓度的增大呈先增后降趋势,对照组2.3μg/ml,染毒组由3.01μg/ml降至1.46μg/ml。
  2. DES与PTU、DBP与PTU联合暴露时,细胞存活率随浓度增加表现为先增加后降低。相比DES单独作用体系,0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L PTU同时加入到0-10μmol/L DES后细胞存活率显著增加,约为126%-160%,具有统计学差异。0.01μmol/L DBP和0.0001μmol/L PTU加入DES中后,GnRH的分泌量随DES浓度的增加呈降低趋势,表现为对照组4.23μg/ml,染毒组0.75μg/ml和1.50μg/ml。
  3.联合暴露时,Kisspeptins/GPR54信号通路上的各浓度组PKC蛋白表达量为1.8和1.3,各浓度组PLC蛋白表达量为1.11和1.14,及DES为0.1μmol/L的GPR54组蛋白表达量为1.1,上述这些蛋白表达量相比对照组都有所增加;而各浓度组GnRH蛋白表达量为0.9和0.8,及DES为1μmol/L的GPR54组蛋白表达量为0.7,上述蛋白表达量相比对照组减少。而各浓度PKC基因表达量为3.9和2.8,GPR54基因表达量为2.2和1.0,PLC基因表达量为2.1和1.7,上述基因表达量相比对照组都有所增加,GnRH基因表达量0.8和0.6,相比对照组减少。GPR54、PKC、PLC蛋白和基因表达量基本呈增大趋势,细胞内GnRH蛋白及其基因表达量的变化趋势与培养液内GnRH分泌量的变化趋势基本一致,呈降低趋势,这与信号通路上几种主要蛋白表达量的变化呈相反趋势。
  结论:
  1. DES、DBP、PTU在一定浓度下共同暴露对GT1-7细胞增殖呈现联合作用,根据 DES浓度的不同表现为协同和拮抗效应。当0.01μmol/LDBP、0.0001μmol/L PTU和0-10μmol/L DES联合暴露对GT1-7细胞的增殖表现为协同作用,0.01μmol/L DBP、0.0001μmol/L PTU和100μmol/L DES联合暴露则对GT1-7细胞的增殖表现为协同或相加效应。
  2. DES、DBP、PTU在一定浓度下共同暴露对GT1-7细胞培养液中的GnRH分泌呈现联合作用,表现为拮抗效应。
  3. DES、DBP、PTU联合暴露时可能促进Kisspeptins/GPR54信号通路上GPR54、PKC、PLC蛋白和基因的表达而抑制 GnRH蛋白和基因的表达,表明Kisspeptins/GPR54信号通路虽然参与了调控GnRH分泌的过程,但仍可能还有其他信号通路参与并发挥主要作用,具体调控机制以及其他未知的相关机制还有待于进一步研究。
  本课题为国家自然科学基金“食品中不同类型内分泌干扰物联合作用模式与累积风险评估方法学研究(编号:81273081)”。
[硕士论文] 高豆豆
卫生毒理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.采用核磁共振的技术检测大气 PM2.5染毒大鼠支气管肺泡灌洗液代谢小分子的变化,探索肺损伤的机制。
  2.采用核磁共振的技术检测大气 PM2.5染毒大鼠血清的代谢小分子的变化,并检测血清的心血管损伤指标,探索心血管损伤的机制。
  方法:
  选取36只体重为180-200g的健康雄性SD大鼠,随机分为对照组(无菌生理盐水)、PM2.5低剂量组(1.5 mg/kg·bw)、PM2.5中剂量组(6mg/kg·bw)、PM2.5高剂量组(24mg/kg·bw)、PM2.5水溶性成分组(24mg/kg·bw)和 PM2.5非水溶性成分组(24 mg/kg·bw),用气溶胶肺部给药套装对大鼠进行气管雾化隔天染毒5次。另取36只体重为为180-200g的健康雄性SD大鼠,随机分为6组,分别为0天组、1天组、3天组、5天组、7天组和9天组,每组6只,隔天染毒,染毒剂量均为24mg/kg·bw。染毒结束后,乌拉坦麻醉大鼠,腹主动脉采血并对大鼠右肺用生理盐水进行灌洗收集灌洗液。采用核磁共振谱仪对支气管肺泡灌洗液和血清进行检测,用试剂盒分别检测支气管肺泡灌洗液的SOD、MDA、LDH和血清的心血管损伤指标。用MestReNove软件解谱,SMICA11.0分析积分值矩阵,找出差异代谢物,用MetPA3.0分析差异代谢物找出靶代谢途径,用SPSS13.0对BALF的SOD、MDA、LDH和差异代谢物进行组间单因素方差分析,且对大鼠血清的差异代谢物和血清心血管损伤也进行组间单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,检验水准均为0.05。
  结果:
  1.大气PM2.5染毒大鼠肺损伤的机制研究
  病理学结果:随着剂量的增加和染毒时间的延长,肺部会相继出现淋巴细胞浸润、炎性渗出、肺泡腔皱缩最后闭合,水溶性成分组出现淋巴细胞浸润,非水溶性成分组呈现炎性渗出。
  BALF的LDH、MDA和SOD结果:随着PM2.5染毒剂量的升高和染毒时间的延长,大鼠 BALF的 LDH活性和 MDA含量均呈升高趋势、SOD活性呈下降趋势(P<0.05);与对照组相比,低剂量组LDH和SOD活性以及MDA含量无显著差异(P>0.05),中剂量组LDH的活性显著升高(P<0.05),高剂量组LDH活性和MDA含量显著升高、SOD活性显著降低(P<0.05);与0天组相比,1天组、3天组、5天组和7天组LDH和SOD活性以及MDA含量均无显著差异(P>0.05),9天组LDH活性和MDA含量显著升高、SOD活性显著降低(P<0.05)。PM2.5水溶性成分组各指标含量与对照组相比无显著差异(P>0.05),PM2.5非水溶性成分组 MDA含量与对照组相比显著升高(P<0.05)。
  代谢组学分析:低、中、高剂量组分别鉴定出VIP>1的差异代谢物7种、10种和11种,其中低剂量组各差异代谢物相对含量与对照组相比无显著差异(P>0.05);中剂量组乳酸、丙氨酸、N-乙酰基糖蛋白、O-乙酰基糖蛋白相对含量与对照组相比显著升高,胆碱、甜菜碱、牛磺酸和α葡萄糖相对含量与对照组相比显著降低(P<0.05);高剂量组丙氨酸、N-乙酰基糖蛋白、甘油磷酰胆碱和甘氨酸相对含量与对照组相比显著升高,胆碱、甜菜碱、牛磺酸和α葡萄糖相对含量与对照组相比显著降低(P<0.05)。1、3、5、7和9天组分别鉴定出VIP>1的差异代谢物9种、10种、11种、11种和11种,1天组丙氨酸相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05);3天组乳酸和丙氨酸相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05);5天组乳酸、丙氨酸、琥珀酸、甘油磷酰胆碱和甘氨酸相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05);7天组乳酸、丙氨酸、N-乙酰基糖蛋白、琥珀酸甘油磷酰胆碱和甘氨酸相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05);9天组丙氨酸、琥珀酸、甘油磷酰胆碱和甘氨酸相对含量与0天组相比显著升高,且胆碱和甜菜碱相对含量与0天组相比显著降低(P<0.05)。水溶性和非水溶性成分组分别鉴定出VIP>1的差异代谢物10种和11种,其中水溶性成分组胆碱、甜菜碱、牛磺酸和α葡萄糖相对含量与对照组相比显著降低(P<0.05);非水溶性成分组丙氨酸相对含量与对照组相比显著升高(P<0.05)。由富集分析和拓扑分析可知:各剂量组涉及到响应值大于0.1的代谢通路是牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,而1天和3天组只涉及到牛磺酸和亚牛磺酸代谢,5、7和9天组涉及到牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,水溶性成分组也会出现牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢紊乱,而非水溶性成分组只会涉及到牛磺酸和亚牛磺酸代谢。
  2.PM2.5染毒大鼠心血管损伤的机制研究
  血清心血管损伤指标分析:随着染毒剂量的升高和染毒时间的延长,血清 LDH和CKMB活性以及MDA、BNP、CRP、ET-1和TF含量均有升高的趋势(P<0.05)。与对照组相比,低剂量组LDH活性显著升高(P<0.05);中剂量组LDH和CKMB活性以及BNP和CRP含量显著升高(P<0.05);高剂量组LDH和CKMB活性以及MDA、BNP、CRP、ET-1和TF含量显著升高(P<0.05),且CKMB活性和TF含量与低剂量组和中剂量组相比也显著升高(P<0.05)。与0天组相比,1天组大鼠血清各指标无显著差异(P>0.05);3天组大鼠血清BNP含量和CKMB活性显著升高(P<0.05);5天组LDH和CKMB活性以及BNP含量显著升高(P<0.05);7天组LDH和CKMB活性以及BNP、ET-1和TF含量显著升高(P<0.05),且CKMB活性和BNP含量与1天组相比也显著升高(P<0.05);9天组LDH和CKMB活性以及MDA、BNP、ET-1和TF含量与0天组和1天组相比显著升高(P<0.05),且CKMB活性和TF含量与3天组和5天组相比也会显著升高(P<0.05)。水溶性成分组LDH活性和BNP含量显著升高(P<0.05);非水溶性成分组CKMB活性和MDA含量显著升高(P<0.05)。
  代谢组学分析:低、中、高剂量组分别可以鉴别出VIP>1的差异代谢物10、10和11种,其中,低剂量组各差异代谢物相对含量与对照组相比无显著差异(P>0.05);中剂量组甘油三酯相对含量与对照组相比显著升高(P<0.05);高剂量组β羟丁酸、丙酮和甘油三酯相对含量与对照组相比显著升高(P<0.05),牛磺酸、谷胱甘肽、甜菜碱和α葡萄糖相对含量与对照组相比显著降低(P<0.05)。1、3、5、7、9天组分别可以鉴别出VIP>1的差异代谢物11、10、10、13和12种,其中,与0天组相比,1天组和3天组各差异代谢物相对含量与0天组相比无显著差异(P>0.05);5天组牛磺酸和甜菜碱相对含量与0天组相比显著降低(P<0.05);7天组β羟丁酸和丙酮相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05),牛磺酸、谷胱甘肽、甜菜碱和α葡萄糖相对含量与0天组相比显著降低(P<0.05);9天组β羟丁酸、丙酮和甘油三酯相对含量与0天组相比显著升高(P<0.05),牛磺酸、谷胱甘肽、甜菜碱和α葡萄糖相对含量与0天组相比显著降低(P<0.05)。水溶性成分组和非水溶性成分组分别可以鉴别出VIP>1的差异代谢物10和13种,且水溶性成分组和非水溶性成分组各差异代谢物相对含量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
  结论:
  1. PM2.5染毒可导致大鼠肺组织的损伤、支气管肺泡灌液小分子代谢谱的改变,引起牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路的紊乱,可能与胆碱、甜菜碱、牛磺酸相对含量的减少和甘氨酸相对含量的升高有关;水溶性成分可能会导致大鼠肺组织牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的紊乱,而非水溶性成分仅会引起牛磺酸和亚牛磺酸代谢的变化,但无显著差异。
  2. PM2.5染毒可导致大鼠机体氧化损伤、炎症反应、内皮功能损伤、凝血功能障碍、心功能下降和心肌细胞损伤,引起心血管系统的损伤,并可导致血清中小分子代谢谱的改变,引起牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路、甘油酯代谢通路、谷胱甘肽代谢通路的紊乱,可能与牛磺酸、谷胱甘肽、甜菜碱相对含量的减少和甘油三酯相对含量的升高有关;水溶性成分和非水溶性成分对各代谢通路的影响无显著差异。
[硕士论文] 杨天
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  红细胞表面表达多种黏附分子,包括CD44、CD58。红细胞黏附分子CD44参与淋巴细胞的活化、再循环以及归巢,造血,肿瘤细胞转移和炎症细胞趋化等作用。CD44与配体结合增强T细胞与单核细胞的黏附作用,诱导单核细胞表达IL-1β,促使T细胞活化并释放IL-2。红细胞黏附分子CD58与淋巴细胞表面的CD2结合能促进淋巴细胞合成分泌IL-8,并间接促进T细胞的增殖和分化,改变细胞周期,从而间接调控免疫应答。CD58能刺激单核细胞分泌IL-2,支持T细胞的生长、分化,并广泛参与对免疫应答水平的调节。红细胞CD44和CD58在免疫细胞功能的发挥中起着重要作用。研究表明,铅、镉和持久性有机污染物暴露均对机体免疫系统产生毒性作用。铅暴露通过抑制免疫细胞的活化、增殖和免疫分子的表达,铅中毒后,使红细胞中的氨基乙酰丙酸脱水酶减少,而尿液中5-氨基酮戊酸增多,从而使氧化产生的自由基增多,引起DNA损伤。镉暴露能引起细胞周期阻滞、基因突变和基因组的不稳定性,从而引起细胞凋亡和细胞癌变。研究表明肿瘤患者红细胞免疫黏附肿瘤细胞的能力显著下降,红细胞黏附分子CD44、CD58水平变化与肿瘤的转移和恶化程度有关。本课题组通过对电子垃圾拆解区新生儿脐带血、胎盘组织、儿童外周血中的铅和学龄前儿童尿液中镉的检测显示,血铅和尿镉浓度处于较高水平,学龄前儿童外周血中T细胞水平显著低于参照组,且外周血清中细胞因子的表达水平也存在差异。这提示电子垃圾拆解区儿童的免疫细胞和免疫分子受到了影响,而这些影响可能与红细胞免疫功能的变化有关。因此,研究非正式电子垃圾拆解区铅、镉暴露儿童外周血红细胞CD44、CD58的表达和相关功能,以明确铅镉暴露对当地儿童红细胞的免疫毒性影响具有重要的现实意义。
  目的:
  通过检测儿童血铅和尿镉水平,并检测儿童红细胞CD44、CD58的表达水平及淋巴细胞、单核细胞水平和相关细胞因子浓度,分析重金属铅、镉对红细胞免疫功能的影响,探讨重金属铅镉暴露与红细胞免疫之间的关系。
  方法:
  于2015年11月,募集267名2~7岁学龄前儿童,其中暴露组132名(男性78名,女性54名,平均年龄4.53±0.93岁),参照组135名(男性83名,女性52名,平均年龄4.21±1.09岁)。采用流行病学问卷调查方式收集相关人口学特征、健康信息、儿童体格指标,以及暴露相关因素;采集儿童肘静脉血6 mL,收集儿童空腹晨尿;石墨炉原子分光光度计检测血铅浓度和尿镉水平;采用碱性苦味酸法检测尿肌酐含量;流式细胞术检测红细胞CD44、CD58表达水平;全自动血细胞分析仪检测淋巴细胞、单核细胞数目;Luminex MAGPIX多功能流式点阵仪检测血清中细胞因子的水平。运用 SPSS22.0统计软件,进行两独立样本和配对样本的t检验,两变量间相关性用Spearman法分析,变量间相互依赖的定量关系用线性回归分析;采用GraphPad Prism5.0软件制图。
  结果:
  暴露组儿童红细胞CD44和CD58表达水平低于参照组(68.08±10.73%vs.76.15±9.45%,P<0.01;40.77±7.07%vs.46.32±7.26%,P<0.01)。暴露组儿童的血铅水平明显高于参照组(中位数:6.51μg/dL vs.4.41μg/dL,P<0.01);两组儿童尿肌酐校正前后的尿镉水平差异均无统计学意义。暴露组儿童的LMR比值低于参照组(8.08±3.00 vs.9.02±2.80,P<0.01)。红细胞CD44和CD58表达水平与血铅水平都呈负相关,LMR比值也与血铅水平呈负相关;红细胞CD44和CD58与校正后的尿镉水平都无显著相关性。暴露组儿童血清中IL-1β和IL-8水平高于参照组(中位数:0.49 pg/mL vs.0.25 pg/mL,P<0.01;中位数:3.41 pg/mL vs.2.63 pg/mL,P<0.01),而IL-2水平低于参照组(中位数:4.82 pg/mL vs.8.16 pg/mL,P<0.01)。
  结论:
  环境重金属铅暴露对儿童红细胞 CD44、CD58的表达水平及相关功能产生影响,干扰儿童红细胞免疫功能的发挥,造成儿童免疫功能的损伤。
[硕士论文] 陈彦融
免疫学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  环境污染物对人体的危害主要体现在重要靶器官如肝肾等器官的损害,目前国内外的有关报道也证实一些重金属的环境暴露与动物的转氨酶的变化有一定的相关性。广东贵屿镇是“世界电子垃圾终点站”之一,有着三十多年的电子垃圾作坊拆解历史。我们以往的研究发现贵屿地区儿童血铅、镉等水平明显高于周围其它地区。但迄今为止,电子垃圾回收拆解区人群血液中重金属水平及其肝脏健康效应的相关研究还较少。环境中铅、镉这两种重金属对暴露人群的危害不容小觑,它们对人体的许多器官产生一定的毒性作用,尤其对肝脏代谢等功能产生干扰。铅主要通过消化道,其次是呼吸道及皮肤接触进入人体,可引起肝损害,如肝肿大、黄疸甚至肝硬化或肝坏死。铅可直接损害肝功能;肝内小动脉痉挛引起局部缺血。镉通过富集作用经过消化道进入人体内最后沉积在肝脏和肾脏中,对器官造成严重的损伤。随着铅、镉含量在人体内的蓄积,加剧肝脏细胞受损的程度,因此我们开展本研究来探讨人体内的血铅、血镉水平和血液中肝功能指标的关系。研究目的:通过对电子垃圾拆解区住院患者血铅、镉暴露水平与谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)的活性以及总胆红素(TBIL)等肝功能指标间的相关分析,探讨电子垃圾拆解区铅、镉暴露对当地人群肝功能的影响,为人体肝脏健康提供了科学依据。
  方法:
  于2015年1月至2015年3月,募集267名住院病人,其中暴露组为汕头地区贵屿镇158人(男86人,女72人,平均年龄43.7±21.3岁),参照组为汕头市金平区109人(男61人,女48人,平均年龄47.5±19.4岁);采集肘静脉血2 mL(EDTA-K2抗凝真空采血管),静脉血3mL(无添加剂干燥管)。采用Jena Zeenit650型原子吸收分光光度计,检测外周血中铅、镉的水平;美国贝克曼AU5800全自动生化分析仪,检测肝功能指标;统计学软件SPSS19.0进行分析,显著性水平设为双侧0.05。
  结果:
  1.暴露组一般患者血铅水平高于参照地区(中位数9.7μg/dLvs7.0μg/dL;P<0.01);2.暴露组肝炎患者的血铅水平高于非肝炎患者(中位数10.8μg/dLvs8.1μg/dL;P<0.05);3.两组患者谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶、乳酸脱氢酶和总胆红素进行两两比较,发现暴露组血清γ-谷氨酰转移酶活性高于参照地区(中位数68.0 U/L vs26.0 U/L, P<0.005),暴露组患者总胆红素高于参照地区(中位数15.4μmol/L vs13.3μmol/L,P<0.001)。4. Spearman两因素相关分析发现,暴露组患者外周血铅水平与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶均呈正相关,血镉水平与谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶均呈正相关。
  结论:
  铅、镉暴露对肝脏功能指标具有一定的毒性效应,可能是危害或加重肝炎患者肝功能紊乱的有害因素。
[硕士论文] 刘云
微生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌自诱导分子(AI)介导的信号系统。是细菌之间特定的交流方式,即细菌产生信号分子,并将信号分子释放到环境中去,当这些分子的浓度达到与高细胞密度或群体相一致的临界值时,该细菌群体便开始一些特定基因的协调表达,从而使细菌在群体规模上展现出新的行为特征,如生物发光功能、毒力因子的分泌调控、芽孢的形成或生物被膜的形成。关于群体感应系统,以前的研究集中在细菌分泌的信号分子对自身或其他种类细菌的调控,本研究则进一步瞄准在细菌群体信号分子对宿主细胞的影响。旨在通过研究细菌群体感应信号分子3OC12-HSL对宿主细胞的直接作用,进一步揭示群体感应系统在细菌与宿主细胞互作中的功能。本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2作为模型细胞进行了如下研究:
  1.基于RNA-Seq筛选细菌群体感应信号分子3OC12-HSL刺激仔猪小肠上皮细胞差异表达基因
  细菌通过群体感应信号分子的合成与吸收,在种群规模进行特定交流,从而调控多种生物学功能;为进一步探寻细菌群体感应信号分子是否不仅作用于细菌,而对宿主真核细胞同样存在直接刺激功能,本研究选用仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2,采用终浓度为100μM的Autoinducer-2(AI-2)、N-Hexanoyl-Homoserine Lactone(C6-HSL),和N-3-oxododecanoylhomoserine lactone(3OC12-HSL)三种来源于不同细菌的重要群体感应信号分子对细胞进行刺激,并以高通量RNA-Seq技术筛选肠道细胞经细菌群体感应分子刺激后的差异表达基因;AI-2组上调1个、下调7个基因;C6-HSL组上调2个、下调8个基因;3OC12-HSL组上调20个、下调15个基因。3OC12-HSL组差异表达基因数最多,故后续分析集中在3OC12-HSL组展开。对差异表达基因进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析,3OC12-HSL组的GO功能分类结果显示,这些基因主要涉及到免疫系统、结构分子活性及细胞连接等功能;KEGG分析表明这些差异表达基因参与细胞骨架、致病性大肠杆菌感染、细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质外受体的相互作用等信号通路。选择8个差异表达基因(其中7个与细胞骨架/细胞连接相关)进行荧光定量PCR验证,各基因的表达变化趋势与转录组学测序结果一致。本研究为进一步研究细菌群体感应分子在病原菌与宿主互作、直接刺激宿主肠道细胞的作用及其相关机制研究奠定了基础。
  2.细菌群体感应分子3OC12-HSL对仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2的影响
  肠道上皮细胞间通过细胞连接的交流调控细胞内稳态,并维持肠上皮细胞防御能力。群体感应系统信号分子不仅可调控细菌毒力,同时参与调控宿主细胞,协助病原菌致病机制,整个过程即跨种间信号传导(interkingdom signaling)。3OC12-HSL对IPEC-J2细胞形态具有明显影响; MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)结果显示,3OC12-HSL对IPEC-J2细胞活性无影响,显示细胞形态变化并非来自与信号分子毒性;利用不同浓度的3OC12-HSL作用IPEC-J2不同时间,结果显示细胞形态变化与浓度及作用时间正相关;低至25μM即可引起细胞形态的明显变化,验证了细胞对与群体信号分子的敏感性;细菌黏附试验结果显示,3OC12-HSL能增强肠致病性大肠杆菌对宿主细胞IPEC-J2的黏附;而细菌侵袭试验结果显示F18ab大肠杆菌对宿主细胞侵袭下降;荧光定量PCR与Western blot结果揭示紧密连接、而不是间隙连接,与群体信号刺激肠上皮细胞机制有关,紧密连接ZO-1蛋白的表达显著增加。
[硕士论文] 何胜男
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究主要探讨铅诱导体外培养PC12细胞损伤、凋亡相关基因与蛋白表达的影响,以及对氨基水杨酸钠(PAS-Na)的干预作用效果。
  方法:PC12细胞经过对数代培养,分别(1)经0、1、10、100、1000μmol·L-l五个浓度梯度的醋酸铅单独作用24h,(2)单独给予0、5、50、100、500μmol·L-1五个浓度梯度的PAS-Na作用24h,用倒置相差显微镜观察PC12细胞的形态,使用MTT法测定各个组的细胞存活率。(3) PC12细胞被随机分为正常对照组、铅模型组、醋酸铅+ PAS-Na20,100和500μmol·L-1剂量干预组。正常对照组和正常+PAS-Na500μmol·L-1组细胞于正常培养液中培养24 h后弃培养液,前者加入正常培养液、后者加入PAS-Na继续培养24 h。醋酸铅模型组及醋酸铅+PAS-Na20,100和500μmol·L-1组先与醋酸铅(终浓度10μmol·L-1)共培养24 h后弃培养液,再加入相应浓度PAS-Na继续培养24 h。用MTT法测定细胞存活率,试剂盒方法测定细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量,Hoechst33342荧光染色及Annexin V/PI双染流式细胞术检测PC12细胞早期凋亡率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定P53、Caspase-3、Caspase-9和MAPK14 mRNA表达量,蛋白免疫印迹法(WB)测定P53、Bax、Bcl-2、Capsase-3、Caspase-9及MAPK通路的T-/P-JNK、T-/P-ERK、T-/P-P38蛋白表达。
  结果:
  (1)铅可引起PC12细胞的形态损伤及存活率呈剂量-反应性下降。
  (2)高浓度(5000μmol·L-1)PAS-Na可使PC12细胞存活率降低,其它剂量组的存活率与对照组无差异。
  (3)铅模型组PC12细胞皱缩、突起稀少。与正常对照组比较,醋酸铅模型组细胞存活率降低,细胞凋亡形态变化典型、细胞凋亡率增高、细胞内GSH含量降低,P53、Caspase-3、Caspase-9和MAPK14 mRNA表达均升高,差异有统计学差异,P53、Bax、activated Capsase-3、activated Caspase-9和p-JNK蛋白表达均升高,p-ERK和Bcl-2表达下降;正常+PAS-Na500μmol·L-1组上述指标未见明显变化。
  (4)与醋酸铅模型组比较,醋酸铅+PAS-Na100和500μmol-L-1组PC12细胞存活率增高和细胞凋亡率降低,各PAS-Na干预组细胞内GSH含量增高,PAS-Na干预或治疗对上述铅诱导改变的基因均有不同程度的下调,其中醋酸铅+PAS-Na100和500μmol·L-1组P53、Caspase-3、Caspase-9和MAPK14 mRNA表达改变下调较为明显。PAS-Na干预可不同程度的上调p-ERK和Bcl-2表达、下调P53、Bax、activated Capsase-3、和p-JNK蛋白表达白水平,但对activated Caspase-9和P38蛋白的表达影响不大。
  结论:
  (1)铅暴露引起PC12细胞存活率和凋亡率降低,PAS-NA对铅致PC12细胞存活率下降和细胞凋亡增加有一定的保护作用。
  (2)铅暴露会降低PC12细胞内GSH含量,PAS-Na对铅致PC12细胞内GSH含量降低具有一定的拮抗作用。
  (3)铅暴露引起PC12细胞P53、Caspase-3、Caspase-9和MAPK14mRNA表达水平升高。PAS-Na对铅致P53、Caspase-3、Caspase-9和MAPK14mRNA表达水平升高有一定的治疗性干预作用。
  (4)铅可能通过MAPK通路中的JNK、ERK途径参与细胞凋亡,以激活JNK磷酸化并降低ERK活性;铅也可通过上调P53、降低Bax/Bcl-2比率,并且激活Caspase-9和Caspase-3,从而导致细胞凋亡。PAS-Na干预对MAPK通路和凋亡相关蛋白改变有一定的拮抗作用。
[硕士论文] 张海莉
兽医学;临床兽医学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:汞(Hg)是全球范围内的重金属污染物之一,可在环境中逐步累积,直接或间接地引发动物和人的各种疾病。Hg毒性从50年代在日本和70年代在伊拉克大范围爆发后,直到现在仍是一个全球性的问题。每年约有100吨有机汞和无机汞排放到自然界中,其主要来源包括:农业中的杀虫剂、工业冶炼、汽车尾气的排放和化妆品等。Hg是一种高毒性的金属物质,可在生物体内生物转化为高毒性代谢物,从而引起生化改变和氧化应激。肝脏是主要的“解毒器官”,受到的损伤尤为严重。木犀草素(Luteolin,Lut)是一种天然黄酮类化合物,存在于多种植物中,拥有抗氧化、抗炎和抗凋亡等功能。本研究旨在探讨在大鼠体内Lut对HgCl2诱导的肝损伤的生物学效应。
  在体内实验中,选用6-8周龄、体重在110-130g之间的Wistar大鼠28只,随机平均分为4组,Control组,Lut参照组,HgCl2中毒组和HgCl2+Lut解毒组(每组7只),实验周期共为30天。Control组大鼠自由饮水,每天灌服用于溶解Lut的1% DMSO(1 mL/kg); Lut组大鼠自由饮水,每天灌服80mg/kg Lut溶液;HgCl2组大鼠饮水中添加80 mg/L HgCl2,每天灌服1% DMSO; HgCl2+Lut组大鼠饮水中添加80 mg/L HgCl2,每天灌服1% DMSO,最后两周每天灌服80 mg/kgLut溶液。饲养结束后,对实验动物的血液和组织进行样品的采集。肝损伤指标:丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(Aspartatetransaminase,AST)的活性,丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量,肝脏组织的病理学变化,使用原位末端标记(Terminal Deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick-End Labeling,TUNEL)的方法,检测了肝脏中细胞凋亡率。此外,运用基因检测(RT-PCR)和蛋白检测(Western blot)技术对Nrf2/NF-κB/P53通路及其相关因子进行检测。
  在体外实验中,开展了肝脏细胞的原代培养,分别进行HgCl2和Lut添加,分组如下:Control组、Lut组(20μM)、HgCl2组(5μM)和HgCl2(5μM)+Lut(20μM)组,首先添加Lut孵育2h后再加入HgCl2孵育24 h。然后严格遵照说明书提供的方法,对肝细胞进行了检测,其中包括:反映肝细胞活率的CCK-8试验和反映肝细胞活性氧水平的试验。
  结果表明:(1) Lut能够降低Hg在体内的蓄积。(2)血液指标中,HgCl2组红细胞和血小板减少、白细胞增多;肝酶AST和ALT检测中,HgCl2组均升高;病理切片井镜下观察,HgCl2组肝脏组织发生明显的病变,这些均表明HgCl2引起了严重的肝损伤,而在HgCl2+Lut组,这些改变均得到了明显的缓解,表明Lut能够减轻HgCl2诱导的肝损伤。(3) HgCl2+Lut组,MDA、ROS和TUNEL降低,GSH、GSH/GSSG和CCK-8升高,这些结果表明Lut减弱了HgCl2诱导的氧化应激和细胞凋亡。(4) HgCl2+Lut组Nrf2通路相关蛋白Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达显著高于HgCl2组。与HgCl2组比较,Lut降低了Bax、NF-κB、P53的蛋白表达,且增加了Bcl-xl、Bcl-2蛋白表达。
  综上所述,减少氧化应激是Lut减轻HgCl2诱导的肝损伤的重要机制。Lut通过调节Nrf2/NF-κB/P53信号通路在大鼠中具有预防或治疗无机汞诱导的肝损伤的功效。
[硕士论文] 熊枫
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:检测原代海马神经元经不同浓度锰染毒后其lncRNA及mRNA的表达情况,通过生物信息学的方法分析、预测并初步验证由哪些基因、lncRNA以及microRNA可能形成ceRNA调控模型通路,为进一步研究lncRNA在锰致神经毒性中的可能作用提供线索。
  方法:培养SD大鼠的原代海马神经元随机分成4组,至第4天分别以0、100、400、800μ M浓度的氯化锰溶液染毒24小时,芯片检测海马神经元中lncRNA以及mRNA的表达情况,使用从聚法分析不同浓度染锰后原代海马神经元中mRNA和lncRNA的总体表达谱;火山图用于表示筛选出统计学差异大于等于2倍和p小于等于0.05的mRNA和lncRNA差异表达情况;GO分析用于将差异表达的mRNA进行功能归类注释;Pathway分析用于研究差异表达mRNA的代谢通路;交叉分析用于找出锰暴露后海马神经元中共同上调或下调的mRNA和lncRNA;利用lncRNA与mRNA的共表达网络并通过target scan、blast比对等工具预测可能的ceRNA通路,并通过Q-PCR检测相应基因、lncRNA及microRNA在不同浓度染锰后的大鼠神经元中的表达水平。
  结果:
  (1)芯片测试结果表明,100μ M组与0μM组相比,表达差异的mRNA共1848个,其中972个上调,876个下调;表达差异的lncRNA共566个,其中337个上调,229个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。400μ M组与0μ M组相比,表达差异的mRNA共3328个,其中1435个上调,1793个下调;表达差异的lncRNA共1161个,其中589个上调,572个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。800μM组与0μM组相比,表达差异的mRNA共4022个,其中1828个上调,2194个下调;表达差异的lncRNA共1474个,其中839个上调,635个下调(差异均大于2倍且P<0.05)。
  (2) GO分析结果表明,差异表达的mRNA参与到生物途径、细胞定位以及分子功能中;pathway分析结果表明,100μ M组与0μM组相比,最富集的信号通路是胰岛素分泌和细胞周期;400μ M组与0μ M组相比,最富集的信号通路是类风湿性关节炎和DNA复制;800μ M组与0μ M组相比,最富集的信号通路是胰岛素分泌和DNA复制。
  (3)交叉分析结果表明,和0μM组相比,100、400、800μM组海马神经元中共同上调的有135个lncRNA和373个mRNA,共同下调的有150个lncRNA和560个mRNA。
  (4) lncRNA与mRNA共表达分析结果表明,Pearson相关系数达98%以上的共表达相关组合共9个,选取基因Arsi并使用target scan检索到与其一致性分值最高的microRNA-125b,通过blast比对及预测工具发现基因Arsi,microRNA-125b,lncRNA-BC089928三者可能形成ceRNA调控通路。
  (5) Q-PCR验证结果表明,随着染锰浓度的升高,基因Arsi与lncRNA-BC089928的表达显著下调,而microRNA-125b的表达则显著上调,三者很可能形成ceRNA调控模型。
  结论:不同浓度染锰后的海马神经元中存在不同数量表达差异的mRNA和lncRNA,并存在一定数量共同上调或下调的mRNA和lncRNA,且lncRNA-BC089928可能通过与microRNA-125b共同调控基因Arsi形成ceRNA调控通路,提示lncRNA可能在锰致海马神经元神经毒性中发挥了重要作用。
[硕士论文] 罗旖旎
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:[目的]研究锰对大鼠原代小胶质细胞氧化损伤和炎症因子白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、前列腺素2(PGE2)表达的影响,探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对锰导致的小胶质细胞损伤的干预作用。
  [方法]
  (1)原代培养的小胶质细胞经过分离提纯和鉴定后,①锰毒性试验:种于96孔板中的细胞分别给予0、200、300、400、500μmol/L浓度MnCl2处理24h。②PAS-Na无毒筛选试验:孔接种于96孔板中的细胞分别给予0、50、150、450μmol/L浓度PAS-Na处理24h。③PAS-Na干预试验:小胶质细胞被随机分为对照组、染锰组、PAS对照组、50、150、450-PAS干预组,其中对照组、染锰组、PAS对照组给予正常DMEM完全培养基,50、150、450-PAS干预组给予400μmol/L浓度MnCl2处理24h后,对照组给予正常DMEM完全培养基换液,染锰组给予400μmol/L浓度MnCl2处理24h,PAS对照组给予450μmol/L浓度PAS-Na处理24h,50、150、450-PAS干预组分别加入50、150、450μmol/L浓度PAS-Na处理24h。
  (2)用MTT试剂测定小胶质细胞存活率,DCFH-DA探针标记小胶质细胞氧化损伤情况,酶联免疫吸附法测定细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2炎症因子含量,荧光定量PCR检测小胶质细胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达。
  [结果]细胞存活率检测:低浓度的MnCl2能刺激原代小胶质细胞的增殖存活率增加,高浓度MnCl2对小胶质细胞有一定的细胞毒性,MnCl2处理24h后小胶质细胞存活率在400μmol/L和500μmol/L组比对照组低。PAS-Na处理24h后,与对照组比较,各剂量处理组细胞形态和存活率没有明显变化。染Mn24h,50、150、450μmol/L浓度PAS干预24h后,染Mn组细胞存活率比对照组低。与染Mn组比较,50、150、450-PAS干预组小胶质细胞存活率升高,差异有统计学差异。细胞内活性氧DCFH-DA标记检验:发现Mn处理可以显著增加细胞活性氧的生成,50、150、450-PAS干预组细胞活性氧生成比染Mn组少。细胞上清炎症因子:与对照组相比,MnCl2使小胶质细胞上清液中IL-1、TNFα分泌增加,差异有统计学意义。50、150、450-PAS干预组细胞TNFα表达低于染Mn组。小胶质细胞IL-1β、TNF-α mRNA表达:与对照组相比,染Mn组IL-1β、TNFα mRNA表达量增加,差异有统计学意义。50、150、450-PAS干预组小胶质细胞IL-1β mRNA表达低于染Mn组。150、450-PAS干预组小胶质细胞TNF-α mRNA表达低于染Mn组。
  [结论]
  (1)过量锰暴露会对原代小胶质细胞造成损伤,导致细胞内活性氧生成,IL-1β、TNF-α mRNA表达量升高,其对应的炎症因子IL-1β、TNF-α分泌增加。
  (2) PAS-Na对锰导致的小胶质细胞损伤具有一定的干预作用,这可能与PAS-Na的抗氧化和抗炎作用有关。
[硕士论文] 马逸飞
卫生毒理学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:本课题旨在调查广西壮族自治区某企业的在职男性工人主动和被动吸烟的现状,同时测定其体内的多环芳烃代谢物1-羟基芘的含量,并通过睡眠质量量表调查工人的睡眠质量,从而比较主动及被动吸烟对其睡眠质量的影响。为改善该企业在职男性工人的睡眠状况并提高其生活质量提供参考,同时为制定控制吸烟法律措施提供科学依据。
  对象和方法:本研究采用的是整群抽样方法,于2015年7月期间在广西某市进行现场调查研究。研究招募到1906名男性工人参与者,调查后,最终得到有效问卷1787份。参与者被收集吸烟情况和被动吸烟情况和人口统计学信息。通过匹兹堡睡眠质量指数表(PSQI)、心理健康状况量表(GHQ-12)与家庭关怀指数量表(Family APGAR index)信息分析参与者的睡眠质量、一般心理健康情况以及家庭功能障碍情况,并用高效液相色谱法测定参与者尿中1-羟基芘的浓度。
  结果:该企业男性工人主动吸烟率为51.37%,被动吸烟率为31.45%。PSQI总分最高是的主动吸烟组,其次是被动吸烟组。从PSQI单个成分来看,主动吸烟组的工人的睡眠质量、入睡时间、睡眠时间、日间功能障碍的得分均高于其他两组(主动吸烟者>被动吸烟>非吸烟者)。主动吸烟组和被动吸烟组的工人都能通过入睡时间、睡眠时间、日间功能障碍这三个成分增加工人患睡眠障碍的风险。其中,风险最高的是睡眠时间,被动吸烟组较不吸烟组的风险为1.92倍(OR=1.9295% CI1.02-3.63),而主动吸烟组的患病风险高达2.64倍(OR=2.6495% CI1.46-4.79)。在纳入二元logistic回归分析模型,调整民族、文化程度、住宅人口、住宅面积、饮酒情况、饮酒频率、锻炼情况、午睡频率、轮班制度、上班天数、上班时间、上班活动、舒张压、心理状况和家庭关怀之后,结果显示,主动吸烟组的睡眠质量风险仍然比不吸烟组的工人风险高出1.41倍(OR=1.4195% CI1.05-1.88),被动吸烟组的工人风险高出1.34倍(OR=1.3495%CI1.00-1.79)。主动吸烟组尿中的1-OHPyr浓度要高于不吸烟组以及被动吸烟组,其中主动吸烟组尿中1-OHPyr浓度约为不吸烟工人的1.4倍(P=0.007)。此外,尿中高浓度的1-OHPyr与总的睡眠质量呈正相关。
  结论:本研究发现主动和被动吸烟均能影响男性工人的睡眠质量,其中主动吸烟对男性工人的睡眠质量影响更大。吸烟会导致工人尿中1-OHPyr浓度升高,高浓度的1-OHPyr与总的睡眠质量相关。
[硕士论文] 李丽
营养与食品卫生学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)作为一种新型环境有机污染物受到了研究者的广泛关注,其生产量和使用量一直处于较高水平且呈现逐年增加的趋势。TDCIPP作为添加剂应用于纺织、家具、电子产品、婴幼儿产品等各行各业中,可经过一系列的转化过程逐渐渗入到环境介质中。环境及生物监测研究发现,在水、室内外空气、土壤、灰尘等环境介质中,甚至鱼类、鸟类等生物体内均检测到不同浓度范围的TDCIPP,有些样本中的含量甚至超越了溴代联苯醚的水平。人类可通过摄食、吸入及皮肤吸收等多种途径暴露TDCIPP,目前已经在人类的尿液、乳汁以及胎盘中都检测到TDCIPP及其代谢产物的存在。因此,评价TDCIPP潜在的毒性以及对环境健康的影响已经刻不容缓。已有研究表明,TDCIPP能够对哺乳类动物产生甲状腺内分泌干扰毒性以及潜在的神经毒性。本研究以多巴胺能神经元模型(PC12细胞)为受试对象,初步探讨TDCIPP的毒性效应以及可能的分子机制。
  目的:
  建立有机磷酸酯阻燃剂TDCIPP致PC12细胞损伤模型,并观察TDCIPP暴露产生的毒性效应;应用数字基因表达谱(DGE)测序技术筛选TDCIPP暴露致PC12细胞损伤的差异表达基因并加以验证,进而探讨TDCIPP致PC12细胞损伤的毒性作用机制。为评价TDCIPP毒理学机制提供数据支持。
  方法
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:
  1.1、实验分组及处理:分化的 PC12细胞分为5组:
  ①正常对照组(Control组):含有细胞的培养液;
  ②TDCIPP暴露组,暴露剂量为7.5,15,30,60μM,共4组。每组设置3-6个复孔。
  1.2、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:培养PC12细胞并刺激分化为多巴胺能神经元细胞,按实验分组分别暴露TDCIPP24 h和72 h,采用CCK-8法检测TDCIPP暴露对PC12细胞生存率的影响,并确定TDCIPP的暴露时间;
  1.3、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP72 h,采用分子探针DCFH-DA试剂盒,以流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)的含量;采用酶联免疫吸附法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。
  1.4、TDCIPP对 PC12细胞凋亡的影响:分化的 PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP72 h,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒,以流式细胞仪检测细胞凋亡率;并利用Western blot技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达量。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:
  2.1、实验分组及处理:用于DGE测序分析的实验分组为:正常对照组(C组)以及60?M TDCIPP暴露组(H组);用于qRT-PCR以及Western blot检测的实验分组同1.1小节;暴露时间均为72 h,每个实验均设置3个复孔。
  2.2、分化的PC12细胞按实验分组暴露TDCIPP后,运用DGE测序技术检测PC12细胞mRNA表达情况,筛选出差异表达的基因,并通过GO富集和KEGG富集寻找可能的代谢通路产生的影响;
  2.3、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,选取6个显著表达的差异基因(Myc、p21、Lamb3, col1a1,THBS和CREB),运用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证DGE测序数据的准确性;
  2.4、分化的PC12细胞按实验分组进行TDCIPP暴露处理,采用Western blot技术检测PC12细胞中磷酸化PI3K/Akt及非磷酸化PI3K/Akt/Myc/p21蛋白的表达量。
  结果:
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:
  1.1、TDCIPP对PC12细胞生存率的影响:不同剂量的TDCIPP暴露PC12细胞24 h、72 h后,细胞的生存率均随暴露剂量的升高而降低,呈现剂量效应关系;在相同的暴露剂量下,72 h暴露所致细胞生存率的降低程度高于24 h暴露;当TDCIPP剂量为60μM、暴露72 h时,细胞存活率为(58.15±0.78)%,接近半数致死浓度,故选取72 h作为暴露时间;
  1.2、TDCIPP对PC12细胞氧化应激的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞内ROS的含量呈上升趋势,且在30,60μM剂量时具有显著性差异(P<0.01);SOD与GSH的含量随TDCIPP暴露剂量的升高而降低;MDA含量则呈现升高的趋势;
  1.3、TDCIPP对PC12细胞凋亡的影响:与对照组相比,TDCIPP暴露组细胞凋亡率明显升高,呈现剂量依赖的关系,在15,30,60μM暴露组所致细胞凋亡率的增加具有统计学意义(P<0.01),且在最高暴露剂量60μM时,细胞的凋亡率增加了5.7倍;抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,而促凋亡蛋白Bax表达升高,Bcl-2/Bax的相对比值则随着TDCIPP暴露浓度的增加呈现下降的趋势,且各暴露组与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:
  2.1、DGE测序数据显示:每个样本的数据量均大于3.27G,满足生物信息分析的需要;每个样本的数据与参考基因比对结果均在85%以上,说明测序深度和广度很好;共筛选出161个差异表达的基因,其中49个基因上调,112个基因下调。GO富集和KEGG富集分析结果显示,TDCIPP暴露于PC12细胞后,差异基因多涉及羧酸代谢、氨基酸代谢、PI3K/Akt信号通路及细胞外基质受体等调控通路;
  2.2、所选取的6个基因的mRNA相对表达量,与DGE测序结果变化趋势相一致;将选取的6个基因的qRT-PCR结果与DGE测序结果进行皮尔逊相关性检验以及简单线性回归分析,结果显示:皮尔逊相关系数为0.801,且P值小于0.01,两者结果呈现显著的正相关性;决定系数R2=0.642,这表明DGE测序结果能较好的代表qRT-PCR检测结果。以上结果表明DGE测序得到的差异表达基因结果可信,能够很好的体现TDCIPP暴露后,对PC12细胞基因的变化情况,以及随之可能引起的毒性效应;
  2.3、TDCIPP暴露PC12细胞后,PI3K/Akt的磷酸化水平呈现浓度依赖性的降低,非磷酸化水平在各剂量的暴露下均无统计学改变;Myc mRNA与蛋白表达水平降低;p21 mRNA与蛋白表达水平呈现剂量依赖性的上调表达。
  结论:
  1、TDCIPP暴露对PC12细胞产生的毒性效应评估:TDCIPP暴露能够降低PC12细胞的生存率;破坏氧化、抗氧化系统的稳定性,使PC12细胞产生氧化应激反应,ROS含量增多,SOD和GSH的含量降低,脂质过氧化产物增多;促使PC12细胞凋亡的产生,从而造成细胞的损伤。
  2、TDCIPP暴露对PC12细胞毒性作用机制的研究:利用DGE技术发现,TDCIPP暴露致使PC12细胞产生毒性效应可能归因于抑制了PI3K/Akt信号通路的激活,PI3K/Akt的磷酸化水平降低;Myc mRNA与蛋白水平降低,p21 mRNA与蛋白水平呈现剂量依赖性的上调表达,从而引起PC12细胞凋亡率的增加,造成细胞的损伤。
[硕士论文] 陈易斯
劳动卫生与环境卫生学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是工业生产中广泛使用的有机磷化合物。人类暴露TOCP可导致一种迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy,OPIDN)的发生,到目前为止其确切发生机制尚不清楚。以前的研究显示OPIDN中神经轴突的病理变化与物理截断引起的轴突wallerian变性相似,即神经轴突自末端向胞体进行性地变性、解体。自噬是真核细胞中负责蛋白质和细胞器清除的主要机制,对于神经元维持自身稳态具有重要作用。众多研究证明神经元自噬异常和轴突变性有关。在本研究中,我们利用自噬相关基因Atg7敲除的自噬缺陷N2a细胞建立中毒模型,研究自噬在TOCP诱导的Neuro-2a(N2a)轴突损伤中的作用,探索TOCP诱导迟发性神经病的发生机制。
  方法:
  1.细胞毒性实验:CCK8方法测试不同浓度TOCP对N2a细胞增殖的影响,确定OPIDN细胞模型中TOCP染毒剂量。
  2.细胞分化实验:培养野生型和Atg7基因敲除的自噬缺陷型N2a细胞,分别使用低血清和视黄酸(Retinoic acid, RA)两种方法诱导野生型N2a细胞(Atg7+/+N2a)和自噬缺陷N2a细胞(Atg7-/-N2a),分化24h、48h,直至呈现典型的神经元形态。
  3.细胞分化能力和轴突损伤情况检测实验:利用0、1.25、2.5、5、10、20μMTOCP处理Atg7+/+N2a细胞,观察毒物对细胞分化能力的影响。在此基础上,以0、5、10μM浓度的TOCP染毒低血清和视黄酸两种方法诱导分化的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞,观察比较两种N2a细胞轴突变化情况。
  4.细胞免疫荧光实验:使用免疫荧光法检测0、5、10μM TOCP处理后的Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中轴突转运蛋白dynaction和自噬标志蛋白LC3B的变化水平。
  5.蛋白免疫印迹实验:Western blotting检测Atg7+/+N2a细胞和Atg7-/-N2a细胞中LC3、p62、p-p62、beclin-1、Ub、k48-Ub、k63-Ub等自噬相关蛋白,kinesin、dynactin等轴浆运输马达蛋白,以及促进轴突损伤相关蛋白SARM1的表达和MAPK信号通路关键分子的磷酸化水平的变化。
  6.实时荧光PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)实验:使用Q-PCR检测细胞自噬相关基因LC3B、beclin1和转录因子EB的mRNA表达情况,以及轴突变性相关的关键分子calpain-1、calpain-2、nmnat-2、sarm1、DLK和scg10等基因的mRNA表达水平。
  结果:
  1.CCK8法检测结果显示,TOCP染毒剂量超过20μM后,随着剂量的增加,对细胞增殖抑制作用越来越明显,直至超过1000μM后细胞活性为零。
  2.低血清和RA两种方法诱导48h之后均可使两种N2a细胞分化成功,即突起长度超过胞体两倍。其中,RA诱导分化的细胞轴突分化长度更明显。
  3.①Atg7+/+N2a细胞染毒TOCP之后,明显影响了其分化能力,且随着剂量的增加,抑制分化能力越明显。②使用TOCP染毒后,两种细胞轴突长度明显缩短,且随着TOCP染毒剂量增加,轴突损伤逐渐加重。同一剂量下,Atg7-/-N2a细胞轴突缩短程度相较于野生型的小。
  4.免疫荧光结果显示,随着TOCP染毒剂量的增加,两种细胞中轴突微管马达蛋白Dynactin表达下降,标记自噬泡绿色荧光亮点增多。两种细胞间无显著性差异。
  5.Western blotting实验结果显示:Atg7+/+N2a细胞中beclin-1含量减少,LC3-Ⅱ含量明显增加,Atg7-/-N2a细胞中beclin-1同样呈现下降趋势,LC3-Ⅱ不表达。两种细胞中p-p62水平上调,Atg7-/-N2a细胞中p-p62表达量更高。高剂量组两种细胞中轴突运输马达蛋白dynactin和kinesin表达均减少。两种细胞中K48-位点泛素蛋白水平增加,Atg7-/-N2a细胞表达量更高。Atg7+/+N2a细胞中对轴突损伤具有促进性作用的激酶p-p38、p-p42/p44磷酸化水平上升,p-jnk表达下调,蛋白SARM1表达增加,而Atg7-/-N2a细胞中除激酶p-p38呈现上升趋势外,其余均无显著性差异,p-p42/p44在两种细胞间变化具有统计学差异,Atg7+/+N2a细胞磷酸化水平更高。
  6.荧光定量PCR检测发现:自噬相关基因LC3B、beclin1、转录因子EB的mRNA水平在两种细胞中随着药物剂量的增加而逐步上升。calpain-1在高剂量染毒的Atg7+/+N2a细胞中激活,而在Atg7-/-N2a细胞中calpain-1、 calpain-2均被激活。对轴突损伤起保护作用nmnat2基因表达情况是:Atg7+/+N2a细胞逐步上升,而Atg7-/-N2a细胞呈下降趋势,0、5μMTOCP处理组中Atg7-/-N2a细胞表达量更高。同轴突损伤相关的sarm1在高剂量染毒的两种细胞中显著性增加。高剂量组Atg7+/+N2a细胞中DLK含量上升,而Atg7-/-N2a细胞却呈现相反趋势。
  结论:
  1.TOCP染毒影响了Atg7+/+N2a和Atg7-/-N2a细胞的分化能力,并能引起已分化的N2a细胞的轴突损伤,其中Atg7+/+N2a细胞的损伤程度比Atg7-/-N2a细胞更加严重。
  2.TOCP染毒引起N2a细胞自噬激活,而Atg7-/-N2a基因敲除导致细胞自噬活性丧失,同时影响了细胞中促轴突存活和促细胞死亡信号关键因子NMNAT2、Sarm1、DLK和MAPK激酶等。
  3.自噬基因Atg7敲除能减轻三邻甲苯磷酸酯对Neuro-2a细胞轴突的损伤。
[硕士论文] 孔正桥
卫生检验学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:[研究目的]:
  反式脂肪酸(trans-fatty acids,TFA)是在反式构型中具有至少一个非共轭双键的不饱和脂肪酸[1]。因可长期保存及其理化性质的稳定性和半溶性,反式脂肪酸被广泛应用于食品加工行业,如各类油炸食品,甜点等。大量研究证实,反式脂肪酸的过量摄入会影响人体的生长发育;此外,反式脂肪酸的过量摄入与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、冠心病(coronary heart disease,CHD)、2型糖尿病及癌症等疾病相关。有研究表明,反式脂肪酸具有一定的神经毒性,可穿过血脑屏障,在额叶皮层、海马、纹状体等处的神经细胞内沉积,并与以渐进性记忆障碍、认知功能障碍为特征的阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)表现出一定的相关性。然而,反式脂肪酸是否导致认知功能障碍及其相关机制并不明确。
  因此,我们采用反式脂肪酸灌胃12周,通过Morris水迷宫实验,观察反式脂肪酸对小鼠学习记忆的影响;通过苏木素-伊红染色观察反式脂肪酸对小鼠海马形态学的影响;采用生物化学实验检测反式脂肪酸染毒小鼠大脑皮层超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的活力以及脂质过氧化蛋白加合物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化;检测反式脂肪酸染毒小鼠脑组织Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶、乙酰胆碱酯酶(acetylocholinesterase,AchE)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活力值;采用高效液相色谱法检测氨基酸类神经递质:谷氨酸(glutamic acid,Glu)、甘氨酸(glycine,Gly)、天门冬氨酸(aspartic acid,Asp)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)及牛磺酸(taurine,Tau)的含量。探讨反式脂肪酸对小鼠认知功能的影响,及其与大脑氧化应激和氨基酸类神经递质的关系。
  [研究方法]:
  1.实验动物分组及处理:选取SPF级雄性昆明小鼠56只,体重(18-22)g,分笼饲养,进食饮水自由。适应性饲养1周后,随机分为4组并均衡体重,分别为对照组和低、中、高剂量反式脂肪酸染毒组,每组14只。各剂量反式脂肪酸染毒组动物分别给予25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg反式脂肪酸,对照组给予等体积的玉米油。所有实验动物均采用灌胃方式进行染毒,染毒容量均为0.1 ml/10g,每周6次,连续染毒12周。每周称量并记录小鼠体重,以调整灌胃剂量。
  2.小鼠认知功能测定:反式脂肪酸灌胃结束后,每组随机选取12只小鼠进行连续6天的Morris水迷宫测试(第一天为训练,不记录数据)。通过定位航行实验和空间探索实验对小鼠的认知功能进行综合评价。其中,定位航行实验通过测定小鼠的逃避潜伏期和游泳总路程反应实验小鼠的学习能力;空间探索实验通过测定穿越平台次数反映小鼠的记忆能力。
  3.小鼠脑组织损伤病理形态学观察:制备小鼠大脑的石蜡切片,采用苏木素-伊红(H&E)染色法检测小鼠海马的形态学变化。
  4.小鼠大脑氧化应激指标检测:按照相关试剂盒的说明测定脑组织中SOD、GSH-Px、CAT的活力值以及MDA的含量。
  5.小鼠脑组织ATP酶活力检测:按照相关试剂盒说明检测Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值。
  6.小鼠脑组织AchE、NOS活力检测:制备小鼠大脑组织匀浆,按照相关试剂盒说明,检测小鼠脑组织AchE和NOS活力值的变化。
  7.小鼠脑组织氨基酸类神经递质检测:采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测小鼠脑组织中Glu、Gly、Asp、GABA、Tau的含量。
  [结果]:
  1.反式脂肪酸染毒对小鼠一般生长发育的影响
  对照组及各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠一般状况良好,小鼠体重随实验进行缓慢增加,各组体重增量差异无统计学意义(p>0.05)。
  2.反式脂肪酸对小鼠学习记忆功能的影响
  Morris水迷宫数据显示:随训练时间的延长,各实验组小鼠逃避潜伏期及游泳总路程均呈下降趋势,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠与对照组相比逃避潜伏期、游泳总路程、平均游泳速度、穿越平台次数等各指标差异均无统计学意义(p>0.05)。
  3.反式脂肪酸染毒对小鼠海马结构影响的形态学观察
  海马形态学观察显示:与对照组相比,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠海马组织中,组成海马外形的神经细胞线变得细且模糊。高倍镜显示,海马CA2、CA3区神经细胞数不同程度减少,排列疏松。
  4.反式脂肪酸染毒对小鼠大脑皮层SOD、GSH-Px、CAT活力及脂质过氧化蛋白加合物MDA含量的影响
  与对照组相比,各剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活力均降低(p<0.05),而脂质过氧化蛋白加合物MDA含量明显升高(p<0.05)。反式脂肪酸各剂量组间各酶活力及MDA含量差异无统计学意义(p>0.05)。
  5.反式脂肪酸染毒对小鼠脑组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值的影响
  与对照组相比,低、中、高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织Na+/K+-ATP和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力值降低(p<0.05)。
  6.反式脂肪酸对小鼠脑组织AchE和NOS活力值的影响
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织AchE活力值降低(p<0.05)。
  小鼠脑组织中,高剂量反式脂肪酸染毒组NOS活力值与对照组相比显著升高(p<0.05)。低、中剂量反式脂肪酸染毒组NOS活力值与对照组相比呈增高趋势,但无统计学差异(p>0.05)。
  7.反式脂肪酸对小鼠脑组织氨基酸类神经递质含量的影响
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中Glu,Gly,Asp,GABA,Tau含量升高(p<0.05);高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中Glu,Gly,Asp,GABA,Tau含量也呈升高趋势(p>0.05)。
  与对照组相比,低、中剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中谷氨酸与γ-氨基丁酸的比值增加(p<0.05);高剂量反式脂肪酸染毒组小鼠脑组织中谷氨酸与γ-氨基丁酸的比值增加(p>0.05)。
  [结论]:
  1.大脑是反式脂肪酸毒作用的敏感靶器官,反式脂肪酸暴露可导致小鼠海马形态发生变化。
  2.反式脂肪酸可导致小鼠脑组织抗氧化系统损伤。
  3.反式脂肪酸可以影响小鼠脑组织AchE和NOS活力。
  4.反式脂肪酸具有兴奋性神经毒性,并且能够影响ATP酶。
[硕士论文] 王苗苗
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  丙烯酰胺(acrylamide/acrylic amide,ACR)是一种水溶性的、乙烯基白色晶体,应用广泛。研究表明,ACR引起以共济失调、骨骼肌无力、震颤为主的周围神经退行性变。蛋白激酶A(Protein KinaseA,PKA)、蛋白激酶C(Protein KinaseC,PKC)、周期素依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5,Cdk5)可磷酸化富含丝氨酸/苏氨酸的神经丝(neurofilament,NFs)蛋白,使NFs结构功能发生改变,影响细胞骨架形成。钙蛋白水解酶(calpain)依赖Ca2+激活,可改变PKA、PKC、Cdk5等含量。我们推测,ACR可能通过Ca活化calpain,以激活PKA、PKC、Cdk5,改变NFs磷酸化状态,最终致ACR神经病。本实验建立大鼠ACR亚慢性中毒模型及钙蛋白酶抑制剂calpeptin(CP)干预模型,观察神经行为学及病理形态,检测Ca2+浓度、PKA、PKC、Cdk5含量,探讨CP拮抗丙烯酰胺中毒大鼠神经丝磷酸化相关激酶的机制。
  方法:
  1.模型建立:成年雌性60只Wistar大鼠随机分为四组,即空白对照组、CP对照组、ACR模型组、ACR+CP干预组。ACR模型组和ACR+CP干预组按30mg/kg·bw腹腔注射ACR染毒3次/周,空白对照组给予等体积生理盐水;CP对照组与ACR+CP干预组给予200ug/kg· bw CP,6次/周,连续四周。染毒终止,分离脊髓与坐骨神经备用。染毒期间每周进行体重称量、步态评分和后肢抓力的测定。
  2.钙离子:分离脊髓,钙离子荧光探针(Fura-2/AM)负载法测定钙离子浓度。
  3.蛋白含量:使用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot法对脊髓和坐骨神经组织中PKA、PKC、Cdk5含量分析。
  4.NFs磷酸化:常规免疫组化法(SP法),观察脊髓与坐骨神经内NFs磷酸化水平。
  5.形态学:HE和甲苯胺蓝染色观察脊髓与坐骨神经病理形态;透射电镜观察坐骨神经组织内有髓神经纤维以及g-Ratio变化。
  结果:
  1.体重
  自染毒第二周起,与空白对照组相比,CP对照组无明显差异(P>0.05),ACR模型组同期体重明显低于空白对照组(P<0.05);与ACR模型组相比,ACR+CP干预组同期体重明显高于ACR模型组(P<0.05)。
  2.神经行为学
  (1)步态评分:自染毒第二周起,与空白对照组比,CP对照组无明显差异(P>0.05),ACR模型组得分同期明显升高(P<0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组同期得分明显降低(P<0.05)。
  (2)后肢抓力:自染毒第二周起,与空白对照组比,CP对照组无明显差异(P>0.05),ACR模型组同期抓力明显降低(P<0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组同期抓力明显升高(P<0.05)。
  3.脊髓Ca2+含量
  与空白对照组比,CP对照组的Ca2+浓度无显著变化(P>0.05),ACR模型组的Ca2+浓度显著升高(P<0.05);与ACR组比,ACR+CP干预组的Ca2+浓度显著降低(P<0.05)。
  4.NFs磷酸化相关激酶
  与空白对照组比,ACR模型组脊髓组织中PKA含量略有降低(P>0.05),PKC含量显著升高(P<0.05),坐骨神经组织中PKA、PKC和Cdk5含量均显著升高(P<0.05);与ACR模型组比,ACR+CP干预组脊髓组织中PKA明显升高(P<0.05),PKC含量显著下降(P<0.05),坐骨神经组织中PKA、PKC和Cdk5含量均显著下降(P<0.05)。
  5.脊髓及坐骨神经NFs磷酸化
  ACR模型组大鼠磷酸化的NFs较空白对照组染色深,而ACR+CP干预组大鼠染色较ACR模型组染色浅;ACR模型组非磷酸化的NFs较空白对照组染色浅;ACR+CP干预组较ACR模型组染色深。
  6.组织形态学
  (1)脊髓:与空白对照组比,ACR模型组运动神经元减少,核固缩、核膜核仁溶解或消失,尼氏体分布降低;与ACR模型组比,ACR+CP干预组运动神经元较正常、数量略有增加,尼氏体增加。
  (2)坐骨神经:与空白对照组比,ACR模型组的坐骨神经截面破损,细胞稀松,髓鞘排列松散,髓鞘板层断裂和/或向内挤压轴浆,g-Ratio显著下降(P<0.05);与ACR模型组相比,ACR+CP干预组髓鞘损伤得到缓解,g-Ratio显著上升(P<0.05)。
  结论:
  1.CP能够拮抗ACR中毒引起的大鼠异常神经行为功能改变以及脊髓和坐骨神经病理形态学改变。
  2.CP能够拮抗ACR引起的钙离子、神经丝磷酸化激酶以及NFs磷酸化水平的改变。
  3.CP可能通过抑制Ca2+-Calpain-激酶-NFs通路中Ca2+及NF磷酸化相关激酶拮抗ACR中毒。
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