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[博士论文] 雷卫强
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。
  RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。
  (一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析
  本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的cDNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的gDNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。
  (二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析
  体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。
  (三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析
  预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过dsRNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。
  本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
[硕士论文] 张丽红
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病寄生虫,能够感染包括人在内的所有温血动物,在世界范围内广泛分布,可以引起严重的弓形虫脑病、眼病、流产、死胎等症状。弓形虫在中间宿主体内分为急性感染和慢性感染,急性感染阶段以速殖子形式快速繁殖,但在免疫力正常的宿主体内,速殖子可转化为缓殖子形式,形成组织包囊长期存在于宿主机体内造成慢性感染,目前没有任何慢性弓形虫病的治疗手段。一旦机体免疫力下降,包囊内的缓殖子会再活化为速殖子,再次造成宿主急性感染而导致严重的机体损伤甚至死亡。弓形虫速殖子与缓殖子相互转化是弓形虫传播与致病的关键所在,对弓形虫缓殖子形成的机制的研究将有助于阐明弓形虫生长发育的分子调控机理,为弓形虫药物和疫苗的设计提供理论依据。
  本研究对已被报道发现的两个在缓殖子期特异表达的基因三十四肽重复结构域蛋白DnaK-TPR及乳酸脱氢酶LDH2进行功能分析及调控机制研究,以解析弓形虫缓殖子分化发育的分子机制。对DnaK-TPR进行基因敲除并进行功能验证;确定LDH2启动子中的顺式调控元件及转录因子,探究其在缓殖子期表达的分子调控机制,并对新发现的转录因子进行基因敲除及功能验证。具体工作包括以下几个方面:
  (1)DnaK-TPR敲除株的构建及功能研究
  利用CRISPR/CAS9基因编辑技术对在缓殖子期高表达的一个三十四肽重复结构域蛋白DnaK-TPR进行基因敲除,成功获得敲除株后进行表型试验,通过空斑试验证明敲除株与野生株的生长没有明显差异;通过复制试验,证明敲除株的复制能力没有明显缺陷;通过缓殖子分化率试验证明DnaK-TPR敲除后并不影响缓殖子分化;通过小鼠毒力试验证明敲除DnaK-TPR后与野生株相比毒力有所下降;通过对感染敲除株及野生株存活小鼠的脑包囊进行统计分析发现DnaK-TPR敲除株与野生型相比小鼠的脑包囊形成没有明显差异。因此我们猜测,DnaK-TP虽然在缓殖子期大量表达,但可能该基因只是缓殖子分化发育调控机制中的一个非意向性靶标,它只是响应缓殖子分化发育调控机制,但并不是直接参与缓殖子的分化发育过程中的靶基因。
  (2)LDH2基因在缓殖子期特异表达的调控机制研究
  构建LDH2启动子不同截短序列驱动EGFP表达的报告系统,通过检测报告基因表达效率确定了LDH2启动子中使其在缓殖子期表达的核心区域,并发现了其中一个GTGTGT重复结构域是LDH2启动子中的一个关键调控元件,并通过Co-IP试验在体外验证了LDH2启动子序列可以与AP2XI-4蛋白发生特异性结合,说明AP2XI-4可能是参与调控LDH2基因在缓殖子期表达的一个转录因子。
  为找到更多参与调控缓殖子分化发育的基因,我们通过蛋白组学分析了速殖子核蛋白与缓殖子核蛋白间的差异核蛋白,筛选到一个在缓殖子期表达上调的转录因子AP2XII-5。通过CRISPR/Cas9系统对AP2XII-5基因进行敲除,成功获得了AP2XII-5基因缺失株,并对缺失株进行表型分析,结果证明,敲除AP2XII-5后并不影响弓形虫的复制、缓殖子分化及脑包囊形成,但敲除株的毒力却显著下降,不能导致感染小鼠死亡。定量RT-PCR结果显示敲除AP2XII-5后BAG1、LDH2及ENO1的表达水平在缓殖子期下调,证明TgAP2XII-5可能参与一些与缓殖子分化发育相关基因的调控。说明AP2XII-5是调控弓形虫毒力的一个转录因子,且参与LDH2等缓殖子相关基因的表达调控。
[硕士论文] 胡锦阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。
  起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(gRNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也己应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:
  (1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型
  本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的iL3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。
  (2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究
  以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒pAJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。
  (3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用
  本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对CeCas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512bp大小的序列作为gRNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条gRNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条gRNA是否具有良好的打靶效率,做了spCas9/gRNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的SsCas9和gRNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将pAJ50-Cas9质粒和pXL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到SsCas9和gRNA片段,说明SsCas9和gRNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将pAJ50-Cas9分别与pXL-BACII-gRNA4、pXL-BACII-gRNA7和pXL-BACII-gRNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。
  本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 何勉
病原生物学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:通过对华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CsCysP38.3)功能和特性的研究,分析其在虫体与宿主之间所起作用,评价CsCysP38.3作为候选诊断抗原的价值和候选疫苗分子的可能性。
  方法:根据GenBank上华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶基因(DQ902586.1)序列设计合成2对特异引物,提取华支睾吸虫成虫总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的基因(CsCysP38.3);将目的基因与原核表达质粒pET-28a连接,构建重组质粒pET-28a-CsCysP38.3,将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中进行目的蛋白表达,并对获得重组蛋白CsCysP38.3(rCsCysP38.3)进行纯化和复性。荧光免疫组化方法观察CsCysP38.3在华支睾吸虫成虫、后尾蚴和囊蚴阶段的组织定位。以rCsCysP38.3作为抗原,ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清中特异IgG亚类和IgE,检测IgG1和IgG4检出率及交叉反应。用rCsCysP38.3免疫SD大鼠,在特异抗体滴度最高时进行囊蚴感染,通过计数大鼠粪便中虫卵数及成虫数来评价免疫保护作用。
  结果:成功构建了pET-28a-CsCysP38.3重组质粒,原核表达产物rCsCysP38.3经纯化、复性后获得浓度为750μg/mL可溶性蛋白。荧光免疫组化结果显示CsCysP38.3在成虫定位于肠支,在后尾蚴定位于肠道、皮层和皮层细胞,在囊蚴定位于皮层和皮层细胞。rCsCysP38.3检测华支睾吸虫病人血清以IgG1和IgG4为主,特异IgG1检出率为33.3%(8/24例),IgG4检出率为58.3%(14/24例),主要与血吸虫和肺吸虫有交叉反应。rCsCysP38.3免疫大鼠后特异性IgG水平显著升高,至初次免疫后6周达高峰,效价高达1∶1638400;在囊蚴感染后,免疫组与对照组的EPG(每克粪便虫卵计数)和寄生胆管成虫数经统计学处理无显著性差异,显示经rCsCysP38.3免疫后无明显抗虫感染的免疫保护作用。
  结论:1.CsCysP38.3在成虫、后尾蚴定位显示该半胱氨酸蛋白酶可能参与了营养代谢功能,在囊蚴的定位提示可能与成囊和脱囊有关。2.rCsCysP38.3检测华支睾吸虫病人血清中特异IgG4效果尚可,可作为候选诊断抗原。3.rCsCysP38.3对囊蚴感染的免疫保护作用不明显。4.rCsCysP38.3具有较好的抗原性和免疫原性。
[硕士论文] 李亚雯
病原生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:外泌体(exosomes)是由细胞内的多囊泡体与细胞膜相融合,从而释放到细胞外的双层膜性纳米小囊泡。exosomes能够在细胞间传递生物活性物质,发挥重要的细胞间信息交流的作用。目前已有相关研究报道,原虫可以分泌exosomes,且在宿主与寄生虫间的信息交流方面发挥着重要作用。迄今,一些寄生虫,如日本血吸虫、布氏锥虫、克氏锥虫和新孢子虫,均被证实可以分泌exosomes。弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,具有生活史复杂且感染率高等特点,严重危害着人们的健康与畜牧业的发展。因此,探索有效预防或治疗手段来抵抗弓形虫感染刻不容缓。目前关于弓形虫来源的exosomes的相关研究仍较为有限。
  目的:分离、纯化和鉴定弓形虫ME49虫株来源的exosomes,并对弓形虫exosomes中非编码RNA进行分析,预测相关miRNA的宿主靶基因和靶定信号通路。进一步探究MAPK信号通路在弓形虫exosomes对宿主免疫应答的调控机制中的作用。
  方法:首先利用差速离心、超滤浓缩以及试剂盒提取相结合的方法,对弓形虫exosomes进行分离提取。并通过电子显微镜、纳米粒径分析仪(NTA)以及Western blotting等方法对所提取的囊泡结构进行鉴定。分析弓形虫exosomal非编码RNA的组分,利用二代高通量测序的方法对miRNA进行测序分析,并通过GO以及KEGG聚类分析预测宿主细胞靶基因及相关靶标信号通路。关于MAPK信号通路的探究,构建MAPK相关siRNA及选择合适MAPK抑制剂进行作用,通过实时定量PCR、Western blotting以及免疫荧光等方法检测磷酸化蛋白的表达水平,采用ELISA方法检测促炎性细胞因子的产生情况。
  结果:我们成功分离鉴定了弓形虫来源的exosomes。电镜结果显示所得为圆形囊状结构,直径范围约50-100nm。纳米粒径分析结果表明其粒径分布范围是50-150nm,平均粒径大小为88.7nm,与经典的exosomes特征相吻合。Western blotting结果成功验证了exosomes的标记蛋白Hsp70、CD63以及弓形虫标记蛋白P30。我们对弓形虫exosomes所包含的small RNA的成分进行了测定,在miRNA的高通量测序分析中,并找到潜在的与MAPK信号通路相关靶基因。在MAPK信号通路调控实验中,我们发现弓形虫exosomes能够通过活化JNK信号通路引起促炎性免疫应答,并能够产生高表达的促炎性细胞因子,而该调控机制与磷酸化JNK蛋白迁移入核现象具有相关性。
  结论:我们的研究结果清楚的展示了弓形虫exosomes能够介导磷酸化JNK蛋白的核转位现象。这些结果有利的支持了我们的假设,即弓形虫能够通过exosomes递呈信号分子给宿主细胞,可导致JNK信号通路的活化和磷酸化JNK蛋白迁移入核发挥其生物学作用。因此,弓形虫exosomes可作为宿主-病原体的相互作用中的关键调控因子。
[硕士论文] 解锐历
公共卫生 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着蚊媒染病的不断扩散,蚊媒防治己成为公共卫生领域的热点问题。化学防制是目前防蚊控蚊的主要策略。随着化学杀虫剂的频繁使用,蚊虫抗药性呈不断增强的趋势。目前,研究发现:在蚊虫抗性产生机制中代谢抗性与靶标抗性的作用机理与氨基酸水平的改变具有潜在相关性。本课题组前期工作发现:实验室抗性品系与敏感品系幼虫体内代谢物存在显著差异,多种氨基酸差异可能与抗性的产生相关。本研究利用液相色谱-串联质谱建立白纹伊蚊幼虫氨基酸代谢物的检测方法,探索白纹伊蚊幼虫体内与溴氰菊酯抗性形成及毒性相关的氨基酸标志物。
  研究目的:
  1.建立白纹伊蚊氨基酸的液相色谱串联质谱联用检测方法;
  2.比较溴氰菊酯抗性品系与敏感品系白纹伊蚊幼虫氨基酸的水平差异,为白纹伊蚊溴氰菊酯抗性标志物筛选提供参考;
  3.观察溴氰菊酯暴露前后抗性白纹伊蚊幼虫氨基酸水平差异,探索溴氰菊酯毒性相关氨基酸标志物。
  研究方法:
  1.液相色谱串联质谱联用检测方法的建立
  参考文献建立液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)检测方法,通过预实验进行参数校正。加入内标控制系统误差,设置6个平行样品控制随机误差,采用6种质控标准浓度氨基酸检测样本回收率。
  2.种群抗性测定
  采用WHO推荐的幼虫浸溃法检测白纹伊蚊种群的半数致死浓度(lethal concentration50,LC50),根据待测样本与实验室敏感品系样本LC50的比值计算出抗性倍数确定抗性程度。
  3.野外蚊虫的采集与饲养
  根据文献报道及课题组现场检测,分别从广州市城区和郊区采集不同抗性程度的白纹伊蚊幼虫,带回实验室饲养至F1代供实验用。
  4.抗性种群药物暴露实验
  参照WHO推荐的幼虫浸渍法,对确定为抗性种群的F1代白纹伊蚊幼虫进行溴氰菊酯暴露实验,分为药物暴露组、丙酮暴露组和空白对照组;暴露24h后回收各组幼虫样本,用于氨基酸检测。
  5.幼虫氨基酸水平的检测
  利用LC-MS/MS检测白纹伊蚊幼虫氨基酸信号,将信号峰导入Chemview软件进行定量分析,得到各组幼虫体内17种氨基酸浓度水平。
  6.统计分析与作图
  利用SPSS19.0进行统计分析,不同组别的氨基酸水平比较采用单因素方差分析,以p<0.05作为统计学差异的判断标准,作图采用R、Graphpad5.01软件。
  研究结果:
  1.实验室抗性品系白纹伊蚊瓜氨酸与脯氨酸这2种氨基酸浓度水平明显高于实验室敏感品系(p<0.05);
  2.野生抗性品系与实验室敏感品系相比,有7种氨基酸水平出现差异(p<0.05),其中,抗性品系中的丙氨酸、瓜氨酸和脯氨酸高于敏感品系,谷氨酸、组氨酸和缬氨酸低于敏感品系;
  3.药物组幼虫体内12种氨基酸(丙氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)与空白对照组出现差异(p<0.05),其中11种氨基酸水平在暴露后降低,而组氨酸水平在暴露后升高;药物组与丙酮暴露组幼虫体内的丙氨酸、瓜氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的变化出现统计学差异(p<0.05)。
  研究结论:
  1.LC-MS/MS用于检测白纹伊蚊幼虫氨基酸水平检测,具有快速、简便、准确的特点;
  2.丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸7种氨基酸可能与溴氰菊酯抗性相关;
  3.溴氰菊酯丙酮溶液暴露可导致抗性白纹伊蚊幼虫体内12种氨基酸水平发生改变,其中丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和瓜氨酸仅与溴氰菊酯暴露有关,其余7种氨基酸水平的改变与丙酮溶液相关。
[博士论文] 王方方
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜱是一种吸血的媒介节肢动物,在人和动物疾病防治领域中具有重要价值。RH36是上海兽医研究所从镰形扇头蜱唾液腺分离鉴定的一个具有免疫调节作用的蛋白,抑制宿主免疫应答反应;基因干扰实验和重组蛋白免疫实验不但发现RH36影响蜱的叮咬吸血过程,还意外发现其严重影响蜱的生殖产卵。鉴于蜱的生殖过程在蜱防控中的核心作用,因此,本研究将围绕RH36影响蜱生殖产卵的作用,探索这一功能的分子机制,为寻找蜱的防治关键靶标提供基础。
  一、RH36分子的表达特征与蜱生殖发育时序的关系。
  分析RH136分子结构并预测其抗原表位,利用多肽制备RH36抗体。应用RT-qPCR和Western Blot方法,研究了RH36分子在蜱吸血过程中的表达特征,发现(1)RH36在吸血蜱的唾液腺中表达,在血淋巴、脂肪体和卵巢等器官没有表达,具有器官特异性表达的特点。(2)在吸血前和吸血后的不同时间,随着吸血时间延长,蛋白表达量逐渐上升,蜱饱血时表达量达到高峰,表明RH36在蜱的吸血后期作用特征,与蜱的卵巢发育时间高度吻合。
  二、RH36基因沉默对蜱卵巢发育形态学和卵黄发生的影响。
  通过RNA干扰实验比较观察了RH36基因沉默后蜱的生殖系统的形态学变化,发现RH36基因敲除后卵巢发育不成熟且输卵管中成熟卵细胞量较少,导致了干扰组蜱的产卵率显著下降。分离纯化镰形扇头蜱卵黄蛋白,并制备了单克隆抗体,用于检测RH36基因敲除后蜱卵巢中卵黄蛋白的表达量,结果显示RH36基因沉默后显著抑制卵巢中卵黄蛋白的表达量;免疫荧光分析发现,RH36基因沉默组卵细胞内卵黄蛋白的储存量比对照组显著减少。这些结果显示,RH36对生殖产卵的作用,与卵巢发育和卵黄发生过程密切相关。
  三、RH36基因沉默后蜱卵巢蛋白组学分析。
  RH36基因沉默后,进行了蜱卵巢差异蛋白质组学分析。发现吸血第5d卵巢蛋白质组中上调蛋白数是25个,下调蛋白数是19个;饱血后第10d卵巢蛋白质组中上调蛋白数是74个,下调蛋白数是134个。通过对差异蛋白的GO功能注释和KEGG分析,发现HSP70、内吞途径和焦点黏连相关蛋白受RH36基因沉默的影响较显著,提示了RH36作用的可能途径。
  四、RH36通过热激蛋白HSP70影响蜱吸血生殖的研究。
  克隆HSP70家族基因,并与其它蜱种及人类热激蛋白序列比对分析发现相似性很高,说明HSP70家族基因在进化上高度保守。HSP70-5分布广泛,在吸血期和饱血期的脂肪体、血淋巴、卵巢和唾液腺中高表达;RH36基因沉默显著下调HSP70-5在吸血期和饱血期的表达。RNA干扰实验发现,HSP70-5基因沉默不仅抑制蜱的饱血,而且下调表达卵黄蛋白原和RH36蛋白。结果表明,RH36与HSP70蛋白在分子水平上相互作用,RH36可通过HSP70蛋白影响卵黄蛋白原的产生,从而影响蜱产卵。
  五、RH36通过焦点黏连相关蛋白影响蜱生殖产卵的研究。
  在非肌细胞中,actinin、paxillin和parvin相互作用调节细胞的黏附运动和细胞增殖。RH36基因沉默显著下调焦点黏连相关蛋白parvin、paxillin和actinin基因在饱血后卵巢中的转录水平,这与蛋白质组结果一致,说明RH36确实影响卵细胞的焦点黏连作用。RNA干扰实验发现,尽管paxillin基因沉默后对蜱的吸血和生殖性状无显著影响,但parvin和actinin基因沉默后不仅抑制蜱的饱血率、产卵率和饱血体重,而且显著阻碍饱血后期卵巢的发育成熟。同时也发现,焦点黏连相关蛋白parvin、paxillin和actinin基因沉默后,均影响RH36基因的转录,表明RH36分子与焦点黏连分子间存在相互作用。这些结果说明了RH36可能通过影响卵巢中焦点黏连相关蛋白parvin和actinin,影响卵巢的发育成熟和卵黄蛋白的表达,进而影响蜱的生殖。
  六、RH36通过内吞途径影响蜱生殖产卵的研究。
  RNA干扰实验发现,卵黄蛋白原受体(VgR)基因沉默后显著降低蜱的产卵率,显微解剖发现显著抑制蜱卵巢的发育成熟,而且显著下调卵黄蛋白原Vg基因的转录,证实了VgR介导的内吞途径在卵黄发生过程中的重要作用。在RH36基因沉默蜱的卵巢中,液泡蛋白分选蛋白VPS24和VPS37的蛋白质表达均显著下降。进一步RNA干扰实验发现,VPS24沉默后下调卵巢组织中卵黄蛋白原Vg基因的转录水平,而VPS37基因沉默后主要下调非卵巢组织中Vg基因的转录水平。同时,VPS24、VPS37和VgR基因沉默后均下调RH36基因的转录水平。这些结果说明蜱RH36与VgR介导的内吞途径关系密切,主要通过影响VPS24和VPS37分子在内吞途径中作用而影响蜱卵巢的发育成熟和产卵。
  综上所述,本研究对镰形扇头蜱RH36分子在蜱的生殖产卵中作用及其分子机制进行了研究,发现RH36分子的表达特征与蜱的卵巢发育时间高度吻合。RH36基因沉默可导致蜱卵巢不正常发育和减少卵黄蛋白的表达。卵巢差异蛋白组学发现HSP70、内吞途径和焦点黏连相关蛋白受RH36基因沉默的影响显著。RH36可通过HSP70分子、焦点黏连相关Parvin和Actinin分子,以及内吞途径相关VPS24和VPS37分子,影响蜱的生殖发育和产卵。这一机制的解析,将有利于RH36分子在抗蜱疫苗和蜱传病防治上的开发应用。
[博士论文] 施维
预防兽医学 广西大学 2017(学位年度)
摘要:片形吸虫的两个致病种大片形吸虫和肝片形吸虫均能感染人和哺乳动物引起片形吸虫病,不同宿主的易感性不同,这与片形吸虫对宿主免疫应答的调控或逃避有关。肝片形吸虫及其ESP已被证实能诱导小鼠和牛巨噬细胞的M2型极化,而大片形吸虫在宿主中能否引起相似的免疫反应尚无明确的结论。本研究旨在通过体内外试验探讨大片形吸虫及其ESP在不同宿主引起的巨噬细胞极化和固有免疫反应的差异及其免疫机制,并将淋巴插管模型应用于片形吸虫ESP对宿主免疫细胞的作用研究,以探明片形吸虫及其ESP对宿主免疫应答的调控机制,为理解大片形吸虫与宿主免疫系统的相互作用提供可靠的理论基础。本研究取得以下成果:
  1.用大片形吸虫囊蚴感染水牛、昆明小鼠(KM)和C57BL/6Nju小鼠(B6),分别于水牛感染后4周、10周、14周和小鼠感染后3周、4周、7或8周处死。通过肝组织切片观察到水牛和小鼠肝脏均能从炎症浸润向结缔组织增生转归,水牛感染14周可见肝内肉芽组织和成虫形成。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞(巨噬细胞)分子标志和细胞因子mRNA表达量,并用ELISA检测血清IFN-γ和IL-4,结果显示:随着感染病程的加剧水牛枯否细胞表型从M2型极化向M1、M2型共上调的趋势转变,KM小鼠枯否细胞表型则由前期的M1+M2混合型向M0型转归,而B6小鼠则表现为更明显的M2型极化。结果表明:大片形吸虫感染水牛和小鼠可诱导肝脏KC表型和细胞因子的表达变化存在较大宿主差异,这些变化的宿主差异是与不同宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力、病变程度以及虫体在宿主体内移行、发育密切相关的。
  2.用大片形吸虫分泌排泄产物200μg FgESP腹腔注射KM小鼠和B6小鼠,4天、7天隔日注射作为短期试验组,14周每周注射作为长期试验组,注射PBS为对照。通过肝组织切片观察到FgESP腹腔短期注射不会引起小鼠肝脏明显的组织学变化,而长期注射会导致细胞膜通透性增加、结缔组织增生和纤维化趋势。实时荧光定量PCR检测肝脏枯否细胞(巨噬细胞)分子标志和细胞因子mRNA表达量,结果显示:KM小鼠短期注射FgESP会引起肝组织iNOS mRNA表达下调,但B6小鼠CD206、Arg-2、YM-1的表达上调,两种小鼠枯否细胞均表现出M2型极化优势;两种小鼠长期注射FgESP则引起完全不同的KCs表型趋势,其中KM小鼠表现为M1和M2型同时上调的混合型,B6则表现为M1和M2均没变化的M0型。
  3.用200μg/mL大片形吸虫分泌排泄产物FgESP体外刺激水牛原代BLMΦ和B6小鼠来源的传代iPMΦ(野生型)两类MΦ48小时。实时荧光定量PCR测定两类巨噬细胞表面分子标志和细胞因子mRNA表达量,化学法测定细胞Arg-1,Griess法测定细胞上清NO浓度,ELISA测定上清IFN-γ、IL-4浓度,结果显示:水牛BLMΦCD68基因表达下调、Arg-2基因表达上调,Arg-1、NO的合成增加,上清中的IFN-γ浓度下降、IL-4没有明显变化,提示可能存在M2型极化和细胞激活的抑制或凋亡的发生;小鼠野生型iPMΦArg-1合成增加,上清中的IL-4浓度显著升高,而IFN-γ、NO浓度没有变化,也提示M2型极化。结果表明:FgESP体外刺激不同宿主MΦ均能诱导M2型极化。
  4.用200μg/mL FgESP分别体外刺激B6小鼠来源的基因敲除iPMΦ(MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-、TLR-2/4-/-),测定上清NO、IFN-γ、IL-4浓度和细胞裂解物的Arg-1含量,并与野生型iPMΦ进行比较,结果显示:MyD88的缺失导致IL-4的分泌与对照组无差异,而MyD88、TRIF同时缺失导致IL-4的分泌减少,两者均低于野生型iPMΦ;无论是MyD88-/-、MyD88/TRIF-/-还是TLR-2/4-/-iPMΦ,FgESP体外刺激诱导的Arg-1产量均与对照组无差异。结果表明:FgESP体外刺激小鼠传代巨噬细胞能诱导依赖于MyD88及其相关通路的M2型激活,促进Th2型细胞因子分泌,促进Arg-1合成和NO分泌抑制,而TRIF和TLR2、TLR4也有可能以某种方式发挥作用。
  5.通过外科手术成功构建绵羊的股骨前伪输入淋巴插管、肝脏输入淋巴插管,成功率分别为约70%和33%左右。
  6.将200μg荧光标记的肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP于绵羊股骨前区域多点皮下注射(OVA设为对照抗原),并通过股骨前伪输入淋巴插管收集0~7天不同时间点的淋巴液并分离免疫细胞,流式细胞术分析免疫细胞种类和抗原吞噬细胞的比例,荧光实时定量PCR测定巨噬细胞表面分子标志mRNA表达量,ELISA测定淋巴液的IFN-γ和IL-4,结果显示:FhESP注射刺激能使股骨前输入淋巴中的中性粒细胞、单核细胞的比例分别在注射后4~8小时和8~12小时特异性升高,淋巴细胞的比例在注射后4~8小时特异性降低,DCs的比例在注射后4~8小时升高但与OVA对照抗原相比缺乏统计学差异,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞样细胞的比例在各时间点无明显改变;抗原吞噬细胞的数量在注射后4~12h的短暂提高,其中,嗜酸性粒细胞、单核细胞和树突状细胞对FhESP的早期吞噬具有特异性,但DCs的两个亚群的比例变化不具抗原特异性;FhESP刺激能导致淋巴液分离到的细胞M2型分子标志CD206、Arg-2和YM-1的表达均在刺激后24小时内特异性上调,淋巴液IL-4在0~8h特异性升高,IFN-γ、IL-10、IL-12的含量没有特异性变化。结果表明:绵羊股骨前伪输入淋巴插管操作简单,成功率高,适用于免疫反应动力学试验,通过该模型我们发现FhESP能在绵羊体内促进单核细胞和中性粒细胞的快速招募,提高吞噬细胞抗原吞噬能力,特异性诱导巨噬细胞M2型极化和Th2细胞因子分泌。
  综上所述,本文认为大片形吸虫感染导致肝脏枯否细胞表型极化趋势和细胞免疫应答趋势存在较大的宿主差异,主要取决于宿主肝脏的载虫能力、损伤修复能力和病变进程。大片形吸虫分泌排泄产物FgESP则能在体、内外诱导动物宿主巨噬细胞依赖于MyD88信号通路的M2型极化,并刺激分泌Th2型细胞因子,通过上调Arg-1抑制NO分泌降低巨噬细胞清除病原的能力,可能是大片形吸虫逃避巨噬细胞免疫杀伤的策略。此外,在绵羊身上成功构建并应用伪输入淋巴插管模型研究肝片形吸虫分泌排泄产物FhESP对宿主免疫细胞的作用,发现FhESP具有早期招募中性粒细胞和单核细胞、提高吞噬细胞早期抗原吞噬、诱导M2型巨噬细胞和Th2型细胞免疫的能力。
[博士论文] 王铭
兽医学;预防兽医学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种原虫,属专性细胞内寄生的顶复门,可以引起严重的人畜共患弓形虫病。弓形虫病在全球范围内流行与分布,2013年在美国CDC发表的数据显示弓形虫在美国的感染率达到22.5%,全球的约33%的人类患有弓形虫病。中国各地均有人体弓形虫感染的报告,感染率约为5%~10%。虽然弓形虫感染的患者多呈现轻微类似流感样症状,但对于免疫缺陷的患者却是十分危险的隐患。关于移动联结成员AMA1、RON2、5、8的功能的研究已有报道,然而在对于弓形虫和疟原虫中,无法通过基因敲除的手段获得RON4的基因缺失虫株,RON4一直以来被猜测为弓形虫、疟原虫入侵宿主细胞所必须的基因,但并没有直接的证据对这个猜测进行佐证,因此,RON4基因的功能一直以来都是未知的。
  本研究根据弓形虫基因组数据库ToxoDB和NCBI基因组数据库Genebank中TgRON4(登陆号:TGGT1_229010)和TgRON5(登陆号:583.m00636)的基因序列,对两基因的信号肽及跨膜域、亲水性进行了初步分析。截取部分序列,设计引物对两基因进行截短扩增,并通过限制性内切酶B amHI和xhoI克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中。对融合GST标签的目标蛋白进行原核表达和纯化。经SDS-PAGE鉴定,分别获得约30kDa和70kDa的两蛋白,且重组蛋白的浓度较高、纯度较好。将TgRON4t和TgRON5t蛋白按照100μg/只的剂量腹腔免疫小鼠,获得多克隆抗体。利用Western blot方法鉴定本研究中制备的多克隆抗体的抗原性,结果显示,本研究中所获得的anti-TgRON4和anti-RON5多克隆抗体均能够识别虫体裂解蛋白中的内源性TgRON4和TgRON5蛋白,大小分别为130kDa和110kDa,与预期相符。利用制备的anti-TgRON4和anti-TgRON5抗体对弓形虫速殖子中TgRON4和TgRON5蛋白进行定位分析,结果显示,两种多克隆抗体均能够与识别内源性的TgRON4和TgRON5蛋白,并且正确定位于速殖子顶端的棒状体部位。证明本研究中所制备的多克隆抗体具有良好的抗原性。
  本研究利用CRISPR-Cas9技术对弓形虫速殖子MJ成员RON4进行基因敲除。首先设计目标gRNA,通过overlap PCR将目标gRNA序列扩增出来,采用pmeI限制性酶切位点克隆到敲除载体中,经过鉴定,本研究成功构建TgRON4基因敲除质粒。将敲除质粒通过电穿孔的方式转染入弓形虫速殖子中,经过药物筛选和有限稀释法分选到两株单克隆虫株——△TgRON4-2D10和△TgRON4-2Gg。设计一系列引物对两单克隆虫株基因组gRNA位点发生的突变情况进行了鉴定,结果表明,在弓形虫RON4基因组中一个gRNA PAM序列前插入了一段约5700bp的片段,在另一个gRNA PAM序列前缺失了5bp碱基,两虫株在RON4基因位点均发生了基因编辑。随后利用本研究制备的多克隆抗体anti-TgRON4,通过Western blot在蛋白表达水平鉴定了RON4基因敲除的情况,结果显示,在△TgRON4-2D10和△TgRON4-2G8虫株均未能检测到目标蛋白的存在,通过间接免疫荧光分析也得到了相似的结果,在△TgRON4-2D10和△TgRON4-2G8虫株中并未检测到TgRON4蛋白的表达和定位。本研究成功利用CRISPR-Cas9技术获得弓形虫速殖子的TgRON4基因的稳定缺失虫株。
  在弓形虫RON4缺失虫株中(△TgRON4-2D10和△TgRON4-2G8)对MJ关键成员TgRON5的定位情况及蛋白表达水平进行了分析。通过间接免疫荧光试验在缺失虫株中对RON5的定位进行分析,结果显示,在TgRON4基因缺失虫株中,RON5可以定位于棒状体颈部的位置。然而western blot检测RON5蛋白的表达水平显示,TgRON4基因缺失虫株与Cas9对照虫株相比,RON5的蛋白表达水平显著下降。表明RON4的缺失影响了RON5蛋白的表达或者稳定性。
  为探究弓形虫RON4基因在虫体入侵等方面发挥的功能,对缺失虫株的黏附、入侵、胞内生长复制、逸出等方面的影响进行了探究。通过流式细胞仪对三株虫株入侵情况进行计数分析,发现基因缺失虫株△TgRON4-2D10和△TgRON4-2G8对于宿主细胞入侵的能力显著低于Cas9对照组。进一步的红绿黏附入侵试验分析,通过间接免疫荧光试验,结果显示RON4的缺失并不影响虫体对于宿主细胞的黏附作用,而只对侵入过程具有影响。另一方面,对感染24h的几组虫株每个纳虫空泡内的弓形虫数进行计数分析,结果显示基因缺失组与Cas9对照组差异不显著。最后,利用A23187钙离子载体对三组虫株进行诱导逸出,再进行间接免疫荧光试验,结果发现RON4基因的缺失并不影响虫体从宿主细胞中逸出的能力。
  最后,对TgRON4基因全长进行克隆,并在目标gRNA序列中进行同义突变。将同义突变TgRON4基因(synoTgRON4)克隆到pBluescript载体中,获得的质粒pBluescript-synoTgRON4-HA质粒转染入△TgRON4-2G8虫株中,经过药物筛选和限制性稀释获得补偿表达单克隆虫株。对synoTgRON4补偿表达虫株、Cas9对照虫株以及△TgRON4-2G8基因缺失虫株的黏附入侵能力进行评价,结果表明,在基因缺失虫株中补偿表达TgRON4之后,虫体的入侵能力有所提高,并恢复至Cas9对照组的水平。
  本研究通过对TgRON4基因功能的剖析,完善了弓形虫入侵宿主细胞形成的MJ分子机制,为继续研究阻断弓形虫,乃至整个顶复门原虫入侵宿主细胞提供可靠的理论依据。
[硕士论文] 肖聪
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:布氏锥虫是一种原生寄生生物,通过采采蝇在哺乳动物间传播,在撒哈拉以南的非洲地区引起人的嗜睡症和牛的那加那病,对人的健康和经济发展带来巨大危害,目前还没有针对锥虫病的有效药物。本论文研究的主要对象是布氏锥虫未知蛋白Q38FZ4和Alba,希望通过对它们结构和功能的研究来为治疗锥虫病开辟新的道路。
  Q38FZ4是布氏锥虫中一个由85个氨基酸残基构成的可溶蛋白,对血液型和前循环型的锥体虫都十分重要。Q38FZ4与哺乳动物中蛋白的序列同源性非常低,而在动基体目寄生生物中该蛋白具有高度的保守性,是抗锥虫药物的潜在靶点。我们用核磁共振技术解析了Q38FZ4的溶液结构,Q38FZ4蛋白具有一个由3个平行/反平行的β折叠片组成的β折叠片层,和1个斜跨该β片层的长螺旋以及分布在四周的4个小螺旋。我们通过RNA干扰对Q38FZ4进行敲除后,布氏锥虫细胞的生长受到抑制,说明它对布氏锥虫的生长十分重要。在荧光显微镜下,我们观察到带eYFP标签的Q38FZ4蛋白仅在细胞分裂间期定位于溶酶体上。在对带不同标签的Q38FZ4蛋白进行串联亲和纯化实验中,多种溶酶体蛋白和微管相关蛋白被分别纯化出来,说明Q38FZ4参与溶酶体中的物质运输过程。
  Alba家族蛋白是一类广泛分布在古细菌和众多真核生物中的以二聚体形式存在的核酸结合蛋白。这些蛋白能与核糖体亚基、翻译因子、其他RNA结合蛋白相互作用,通过控制基因的表达来参与各种调节通路。布氏锥虫中鉴定出了4种Alba蛋白,它们是TbAlba1-4。我们得到了TbAlba1的晶体,并收集到了一套分辨率为2.7 A的衍射数据。我们通过GST pull down和ITC实验确定了布氏锥虫Alba蛋白间的相互作用及竞争结合关系。我们还发现TbAlba3和TbAlba4能结合布氏锥虫中特定分子量大小的RNA,而TbAlba1和TbAlba2却无法结合RNA,由此推测TbAlba3-4结合RNA的能力与它们C端的RGG重复序列有关。此外,它们在与TbAlba1或TbAlba2形成异二聚体后结合RNA的范围得到提高。我们用EMSA证实了TbAlba能结合非特异的双链DNA和DNA的G四联体结构,并用ITC测得TbAlba3与DNA的G四联体有较强的结合力,说明TbAlba参与的生物过程不仅只与RNA有关,还涉及到DNA。
[博士论文] 刘耀宝
病原生物学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:间日疱原虫(Plasmodium vivax)是全球地理分布最为广泛的人体疱原虫种,也曾是我国疟疾流行区的主要疟原虫种。由于间日疟原虫具有独特的生物学特性,间日疟的控制和消除比恶性疟难度更大,在大多数恶性疟和间日疟混合流行地区,常发现在疟疾控制取得成效,疟疾发病率下降的同时,间日疟所占的比例却在增加,一些国家在恶性疟得到有效控制或消除后的几年甚至几十年内仍存在间日疟的流行。当前我国已进入消除疟疾阶段,虽然除云南边境地区外,我国大部分原疟疾流行地区已无本地感染疟疾病例,但我国每年由境外输入的疟疾病例超过3000例,其中输入性间日疟约占20%-25%。世界卫生组织消除疟疾的考核评估判定标准之一是“连续3年没有本地蚊媒传播的疟疾病例”,由于我国原主要疟疾流行区的媒介按蚊均能传播间日疟,因此在发现间日疟病例后,不仅需要判定其是否为输入性病例,还需要评估是否存在输入再传播风险的可能。目前,在我国消除疟疾行动计划中,输入性疟疾病例的判定仍依赖于个案流行病学调查,所有存在媒介按蚊地区发现的输入性间日疟疫点均认为有再传播风险,需要采取包括媒介控制在内的疫点处置措施。因此,探索研究判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别技术和境外输入性疟原虫株与本地疟疾传播媒介之间的适配性(易感性),并评估输入性疟疾病例引起本地继发传播的风险,对消除疟疾和消除后的防止输入再传播均具有重要意义。
  本研究结合我国消除疟疾阶段的实际需求,第一部分采用微卫星分子标记对我国中部和南部地区的间日疟原虫株进行了基因多态性和群体遗传学分析,并对我国与其它国家间日疟原虫株的基因型数据进行了比较分析,探索判定间日疟原虫感染来源的分子鉴别方法;第二部分通过对我国不同地区间日疟原虫株的Pvs47基因多态性和群体遗传学研究以及与东亚、东南亚和南美地区间日疟原虫株Pvs47基因序列的比较分析,为输入性间日疟引起本地传播风险评估提供科学依据。
  第一部分基于微卫星标记的间日疟原虫基因多态性和群体遗传学研究
  一、中国中部和南部地区间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构分析
  目的:
  对我国中部地区和南部地区间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行分析,为建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术提供依据。
  方法:收集2007-2012年我国中部和南部间日疟流行区的间日疟原虫样本(n=236),采用9个微卫星分子标记和毛细管电泳技术进行基因分型,利用亚太地区消除疱疾组织(AsiaPacificMalariaEliminationNetwork, APMEN)间日疱原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN)进行数据处理,对间日疟原虫的多克隆感染情况、群体基因多态性、连锁不平衡水平和群体遗传结构进行分析。
  结果:
  1.南部地区间日疟原虫株多克隆感染比例(70.4%,38/54)高于中部地区(51.4%,93/181),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株的平均期望杂合度(丑e=0.85±0.07)高于中部地区(丑e=0.73±0.13),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株等位基因丰度(处=11.89)高于中部地区间日疟原虫株等位基因丰度(於=8.17),差异具有统计学意义(P<0.01);南部地区间日疟原虫株各微卫星位点的平均等位基因数和特有等位基因数均多于中部地区。
  2.中部地区间日疟原虫株(/aS=0.147,P<0.01)和南部地区间日疟原虫株(TaS=0.136,P<0.01)均存在明显的连锁不平衡,且中部地区高于南部地区。中部地区不同年份的间日疟原虫株也具有明显的连锁不平衡,且连锁不平衡水平从2008年(/aS=0.137,P<0.01)、2009年(TaS=0.190,P<0.01)到2010年(TaS=0.264, P<0.01)有逐年增加的趋势。
  3. STRUCTURE分析结果显示中部地区和南部地区的间日疟原虫株可分为多个遗传亚群。K=4时,JK值最大,中部地区群体遗传结构复杂,南部地区群体遗传结构较为单一。K=2时,南部地区92.59%(50/54)的虫株来源于遗传亚群2 ipop2),1.85%(1/54)的虫株来源于遗传亚群1 ipopl、,5.56%(3/54)的虫株为混合来源;中部地区43.09%(78/181)的虫株来源于遗传亚群l(pop7),34.81%(63/181)的虫株来源于遗传亚群1 Qpop2、,22.1%(40/181)的虫株为混合来源。
  4.中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化(Fst=0.0696, P=0.00007)。中部地区2008年与2010年之间的间日疟原虫株群体遗传分化最大(八了=0.0389,P=0.012),2008与2009年(八了=-0.0001,P=0.422),2009与2010^(Fst=0.034, P=0.034)之间的遗传分化较小。
  5.进化树和主成份分析均显示中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉。Mantel检验分析显示,中部地区间日疟原虫株的遗传距离与地理距离之间具有一定的相关性(r=0.08,P=0.036),遗传距离与样本采集时间之间也具有一定的相关性(r=0.05, P=0.01)。
  结论:
  1.我国南部地区间日疟原虫株的基因多态性在个体水平(多克隆感染)和群体水平(期望杂合度)上均显著高于我国中部地区,与我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区的情况较为吻合。
  2.我国中部地区和南部地区的间日疟原虫株均具有明显的连锁不平衡,且南部地区的连锁不平衡水平低于中部地区,同样提示我国南部地区间日疟的流行强度高于中部地区。
  3.我国中部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为复杂,南部地区间日疟原虫株的群体遗传结构较为单一;中部地区和南部地区之间的间日疟原虫株具有一定的群体遗传分化;中部地区和南部地区间日疟原虫株在遗传地位上有交叉;中部地区间日疟原虫株之间的遗传距离具有一定的时空相关性。
  4.建立了我国中部地区和南部地区间日疟株微卫星基因型数据库,并纳入了亚太地区消除疟疾组织(A P M E N)间日疟原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN),为进一步开展间日疟原虫感染来源分子鉴别技术的研究打下了基础。
  二、我国与其它国家间日疟原虫基因多态性和群体遗传结构比较分析
  目的:
  对我国与其它国家间日疟原虫株的基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,探索建立间日疟原虫感染来源分子鉴别技术。
  方法:通过国际合作,利用APM EN间日疟原虫基因型数据共享平台(VivaxGEN),对埃塞俄比亚、伊朗、不丹、马来西亚、印度尼西亚、韩国、中国南部地区以及中国中部地区的间日疟原虫株进行基因多态性和群体遗传结构进行比较分析,并基于STRUCTURE和Weka软件对境外输入性间日疟病例进行感染来源分析。
  结果:
  1.不同国家之间的间日疟原虫株多克隆感染比例差异较大(4.2%-97.2%),伊朗间日疟原虫株的多克隆感染比例最高(97.2%),韩国间日疟原虫株的多克隆感染比例最低(4.2%)。中国中部地区和南部地区间日疟原虫株的多克隆感染比例均较高,分别为51.4%和70.4%。
  2.共发现78个特有等位基因,其中特有等位基因个数最多的为印度尼西亚(25个),最少的为韩国(0个),中国中部地区发现7个特有等位基因,中国南部地区发现10个特有等位基因。微卫星位点M S20的短片段等位基因(150bp)仅在中国和韩国的间日疟原虫样本中发现,其在韩国、中国中部地区和中国南部地区的等位基因频率分别为98.8%、60.9%和22.4%。
  3.群体遗传结构STRUCTURE分析结果显示,K=2时,间日疟原虫株的2个遗传亚群与间日疟原虫热带株和温带株的地理分布相吻合;K=4时,非洲虫株主要属于popl,伊朗虫株主要属于p o p2,不丹、马来西亚、印度尼西亚以及中国南部地区虫株主要属于pop3,中国中部地区和韩国的虫株主要属于pop4' K=6时,中国中部地区和韩国的间日疟原虫株也出现了遗传结构分化。进化树和主成份分析均发现,中国中部地区间日疟原虫株与韩国株的遗传距离相近,可聚为一类,但与非洲和东南亚的间日疟原虫株的遗传距离较远;我国南部地区间日疟原虫株与东南亚国家的间日疟原虫株之间的遗传距离较为接近。
  4.基于STRUCTURE分析,对30例输入性间日疟病例感染来源判定的平均符合率为85%。我国中部地区的间日疟原虫株与埃塞俄比亚间日疟原虫株可分为2个遗传亚群(popl和pop2、,埃塞俄比亚间日疟原虫株98.20%的遗传信息来自popl,而中国中部地区间日疟原虫株的96.3%遗传信息来自pop2,5例有埃塞俄比亚旅行史间日疟病例均可判定为popl来源。中国中部地区间日疟原虫株和东南亚(马来西亚和印度尼西亚)间日疟原虫株也可分为2个遗传亚群ipopl和pop2、,东南亚间日疟原虫株97.50%的遗传信息来自popA中国中部地区间日疟原虫株94.20%的遗传信息来自pop2,10例有东南亚旅行史的间日疟病例中,9例可判定为pop2来源,判定准确率为90%。
  5.基于Weka分析,采用4个微卫星位点(MS8,MS10,MS16,MS20)对来自非洲、中东、南亚/东南亚和东亚4个地区的493例间日疟病例感染来源分类的符合率为90.47%,对中国中部地区和埃塞俄比亚的172例间日疟样本感染来源分类的符合率达99.42%;采用2个微卫星位点组合(MS8,MS20)对中国中部地区和东南亚的235例间日疟样本来源分类的符合率达98.70%。
  结论:
  1.首次发现我国中部地区存在间日疟原虫微卫星M S20位点短片段(150bp)等位基因,该间日疟原虫地理株特有等位基因可作为我国中部地区本地和输入性间日疟鉴别的分子标记。
  2.初步建立了以微卫星位点为基础的不同感染来源间日疟原虫分子鉴别技术。采用4个微卫星位点(MS8,MS10,MS16,MS20)对中国中部地区和非洲间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达99.42%;采用2个微卫星位点(MS8,MS20)对中国中部地区和东南亚国家间日疟原虫感染来源鉴别的准确率达98.70%。
  第二部分间日疟原虫Pvs47基因多态性和群体遗传学研究
  目的:
  研究不同地区间日疟原虫株Pvs47基因多态性和群体遗传学特征,为输入性间日疟病例本地传播风险评估提供科学依据。
  方法:
  对我国中部地区、南部地区以及部分从东南亚国家输入的间日疟原虫株(n=212)进行Pvs47基因测序,与Genbank(n=76)和PlasmoDB(n=68)数据库中已报道的间日疟原虫株Pvs47基因序列一起构建数据库,并进行基因多态性和群体遗传学分析。
  结果:
  1.对356例间日疟原虫株的Pvs47基因序列进行分析,共发现34个单核苷酸多态性位点。Pvs47平均核苷酸多样性指数n为0.0039,其中东南亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最高(n=0.00424),东亚间日疟原虫株Pvs47的基因多态性最低(兀=0.00029),我国中部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(n=0.00091)略高于东亚地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(n=0.00029),但明显低于我国南部地区间日疟原虫株Pvs47的基因多态性水平(n=0.00253)。
  2.东亚与南美间日疱原虫种群之间的遗传分化最大(Fst=0.92,Gst=0.60),我国中部地区与东亚间日疱原虫种群之间的遗传分化最小(八1=0.06,Gst=0.04)。我国南部地区与东南亚间日疱原虫种群之间的遗传分化较小(Fst=0.08,Gst=0.03),但我国中部地区与东南亚间日疟原虫种群之间的遗传分化较大(Fst=0.37,Gst=0.20)o
  3.共发现52个Pvs47DNA单体型和47个Pvs47氨基酸单体型。47个氨基酸单体型中,东南亚的单体型最多(28个),东亚的单体型最少(3个),中国中部和南部地区的单体型分别为12个和11个。每个间日疟原虫种群均存在特有氨基酸单体型(1-21个),在频率大于1%的特有单体型中,东南亚1个(Hap—aa40),我国南部地区1个(Hap—a a8),南美2个(Hap—aa1和Hap—aa45)。Hap—aa2是我国中部地区和东亚的优势氨基酸单体型,分别占我国中部地区间日疟原虫株的80%(112/140)和东亚间日疟原虫株的95.1%(39/41),而东南亚地区Hap—aa2仅占3.0%(2/67),我国南部地区Hap—aa2占28.9%(13/45),南美未发现Hap—aa2。Hap—aa1是南美的优势单体型,占南美间日疟原虫株的74.6%(47/63),其它地区均未发现Hap—aa1。
  4.遗传进化树分析显示,47个氨基酸单体型可分为2个主要的遗传进化枝。其中,进化枝1中的10个单体型主要在我国中部地区流行,进化枝2中的23个单体型主要在东南亚地区流行。7个在我国南部地区流行的单体型在2个进化枝中均有发现,1个东亚特有单体型与我国中部地区的单体型聚为一枝,4个南美特有单体型均位于进化枝2,且遗传地位相近。
  5.Network分析显示,Pvs47DNA单体型分布具有明显的地理来源聚集性。我国中部地区和东亚的单体型聚为一类,我国南部地区和东南亚的单体型聚为一类,南美的单体型聚为一类。
  结论:
  1.首次发现不同地区间日疟原虫株Pvs47基因的基因多态性和群体遗传结构存在明显差异,P训47单体型具有地理来源特异性。
  2.我国南部地区间日疟原虫株与东南亚间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位相近,单体型聚为一类,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性强,近距离输入病例引发本地传播的风险较大。
  3.我国中部地区间日疟原虫株与东南亚等地区间日疟原虫株的Pvs47基因遗传地位较远,单体型具有地理来源特异性,提示输入性间日疟原虫株与当地媒介的适配性较差,远距离输入病例引发本地传播的风险较小,这可能是由东南亚国家和非洲输入的间日疟病例尚未在我国中部地区引起输入再传播的重要分子机制之一。
[硕士论文] 邓连康
应用数学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:本文依据舌状绦虫疾病的传播过程,构建了两个动力学模型,并对其性态加以分析.
  第一章,介绍了舌状绦虫病的生物背景和传播机制,以及寄生虫感染食饵一捕食者系统的动力学模型研究进展.
  第二章,建立了具有双线性功能反应函数的动力学模型.首先,证明了模型解的正性和有界性,其次,计算出了模型基本再生数和讨论了模型平衡点的存在性,接着,分析了平衡点的局部稳定性.最后,分析了部分平衡点的全局稳定性.
  第三章,建立了具有第II类功能性反应函数的动力学模型.首先,证明了模型解的正性和有界性.其次,给出基本再生数和讨论了平衡点的存在性.最后,分析了模型平衡点的存在性及局部稳定性.
  第四章,简要回顾了本文的主要工作,介绍了模型的实际意义,并对本文工作的不足之处及进一步研究方向进行了讨论.
[博士论文] 王软林
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质的合成是所有生物体中的基本生命过程。核糖体维持正确的读框对于蛋白质的合成至关重要,一旦发生移码,将会导致截短的或无义蛋白的生成,从而造成翻译能量的损耗,加重细胞清除及质控机制的负担。然而,在某些特殊情况下,翻译中的核糖体能够在mRNA的特定位置,从起始的0读框转换到-1或+1读框,然后继续进行翻译,这一过程被称作编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)。PRF现象首次在病毒中发现,随后越来越多的证据表明该现象普遍存在于从细菌到真核生物等生命进化的各个分支。前期基于单个基因的研究显示游仆虫中具有高频率的+1PRF现象。本研究对八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)的大核基因组及转录组进行了测序分析,从基因组水平对这一特殊现象及其分子机制进行了深入探讨。此外,还通过质谱分析对预测的PRF基因加以验证。所得结果如下:
  1.利用Illumina测序平台对八肋游仆虫大核基因组进行测序,共得到约11Gb原始数据;将低质量reads过滤后,采用meta-assembly的拼接策略进行基因组组装,将组装结果中来自于细菌基因组及线粒体基因组的污染DNA去除后,最终得到41,980条Contigs,其N50为2,947bp,其中包含双端端粒的Contigs有29,413条;随后采用三种方法对拼接结果的完整性进行评估,结果表明拼接结果基本完整,八肋游仆虫大核基因组能够编码细胞营养生长阶段所需的全部基因;最后,利用AUGUSTUS软件对大核基因组中的non-PRF Contigs进行基因的从头预测,共预测出29,076个完整基因,其中90%的基因有RNA-Seq数据的支持。对每条微染色体所包含的基因个数进行了统计,结果显示约83%的微染色体仅编码一个基因;与其他纤毛虫一样,八肋游仆虫非编码区的AT含量比编码区高。
  2.利用二代测序技术,对生长阶段的八肋游仆虫转录组进行测序,共得到4.9Gb数据。采用两种方法对转录组数据进行组装,比较后选择Tophat&Cufflinks的组装结果进行后续分析,该方法共拼接出32,353条转录本,平均长度为1,300bp;基于转录组数据,采用相似性搜索的策略,最终共预测出4,690个移码位点,分布于3,866个编程性核糖体移码基因中,其中+1PRF基因3,700个,+2/-1PRF基因166个。随后通过跟其他游仆虫进行同源序列比对,共鉴定出5个-1PRF基因;对移码基因进行了Pfam结构域注释,KEGG信号通路注释及GO功能注释,注释结果显示游仆虫中PRF基因功能多样,分布于多个信号通路及生物过程;利用GO信息,对移码基因进行了功能富集分析,结果表明移码基因显著富集于多个生物过程,主要涉及到磷酸化、去磷酸化及依赖泛素的蛋白降解等过程。
  3.对八肋游仆虫的总蛋白进行了大规模质谱分析,最终得到2,853种蛋白的肽段信息,其中253种为PRF蛋白;移码位点被肽段覆盖的基因有7个,全部为+1PRF基因,其中CUFF.27536.1的两个+1位移码位点均有肽段覆盖。根据移码位点肽段的氨基酸序列信息,确定了游仆虫中+1PRF基因的移码发生在滑动序列中终止密码子TAR(R=A or G)的T处;此外还有89个PRF基因的移码位点上下游均有肽段覆盖,包括82个+1PRF基因以及7个+2PRF基因,这些肽段为证明游仆虫中的PRF现象提供了间接的蛋白证据;根据肽段信息,结合多序列比对结果,我们推测八肋游仆虫的+2位移码过程中,核糖体跳过了滑动序列中终止密码子TAR的TA两个核苷酸。
  4.对所有PRF基因移码位点上下游30bp的序列进行保守序列模体的分析,结果发现除滑动序列外,无其他保守序列元件;对滑动序列的分析结果显示,约92%的移码位点由AAA密码子和紧随其后的终止密码子组成,其余8%由其他密码子和终止密码子构成,移码位点共包含47种有义密码子;在+1PRF基因的滑动序列中XXX(三个核苷酸相同)类型的密码子最多(97%),而在+2PRF基因的滑动序列中XTA(X代表任意核苷酸)类型的密码子最多(73%),5个-1PRF基因中,有3个基因的滑动序列为AAG TAA,其余两个分别为TCT TAA和TTT TAA,其滑动序列下游未检测到假结或茎环等刺激结构;此外,对八肋游仆虫中正常翻译终止位点及移码位点中终止密码子及四核苷酸序列的使用频率进行了比较,结果显示UAA和UAA-A在正常翻译终止位点和移码位点中都是优先使用的,但移码位点中UAA及UAA-A的使用频率要显著高于正常翻译终止位点。这些结果说明在游仆虫中,终止密码子UAA及四核苷酸序列UAA-A可能更有利于移码的发生。八肋游仆虫大核基因组中含有12种反密码子环扩大的特殊tRNAs,对其核酸序列进行分析结果表明这些tRNAs含有保守的基因内启动子,TATA-box以及终止信号。随后对八肋游仆虫的small RNA进行了高通量测序,结果表明除Contig34792外,其他特殊tRNAs均具有转录活性。
  5.基于核酸序列信息,共鉴定出23个包含读框内终止密码子的基因。对其中编码组织蛋白酶B的基因进行了序列分析及同源序列比对,结果显示,在八肋游仆虫中,UAA和UAG既可作为终止密码子,又可以编码氨基酸;质谱分析检测到AMP结合酶家族蛋白的三条肽段,证明在八肋游仆虫体内,含有读框内终止密码子的基因能够翻译出有功能的蛋白产物。
  6.建立了八肋游仆虫基因组数据库(Euplotes octocarinatus Genome Database,EOGD,http://ciliates.ihb.ac.cn/database/species/eo),该数据库整合了本研究测得的八肋游仆虫大核基因组数据、转录组数据、预测基因的注释信息以及关于八肋游仆虫分类和形态的描述信息。该数据库设计了多种简单易用的搜索方式,包括Gene ID、scaffold ID、关键词、基因的序列及位置信息等,使研究人员能够轻松获取游仆虫基因组及转录组数据。EOGD的建立为在游仆虫中开展相关研究提供了极大的便利。
[硕士论文] 朱慧子
人文地理学 江西师范大学 2017(学位年度)
摘要:钉螺作为血吸虫的唯一中间宿主,是血吸虫病疫情极为重要的指示,是影响血吸虫病传播与防控的重要风险因素。钉螺的识别、调查、消灭,血吸虫病疫区的划定与判别,血防资源的使用等,都与钉螺的空间分布与和抽样研究这个基础性的问题密切相关,只有对钉螺在疫区的空间分布以及实地调查时如何进行抽样有足够的了解,血防工作才能科学合理、卓有成效。
  本研究于2013年11月在属于湖沼型血吸虫病疫区的鄱阳湖沿岸区域,经过综合考虑,于湖岸草洲上划定一块50m×50m的正方形有螺样地为调查点,具体位置点定在江西省南昌市新建区恒湖农场茶叶港草洲。选定样地后,采用推扫式的查螺方法对试验样地内所有抽样框(尺寸大小标准是1/3m×1/3m≈0.11m2,与血防部门目前采用的标准框一致)内的钉螺进行仔细调查,捡获所有抽样框内连续覆盖的钉螺,并统计钉螺数目。得到钉螺数据后,借鉴昆虫种群生态学中序贯分析思想与理论,在此基础上运用数理统计法,研究在不同尺度抽样单元下钉螺种群的空间分布型,获得了研究区域钉螺种群空间分布型的相关信息;在研究了钉螺种群空间分布型的基础上,对钉螺个体群的基本情况进了分析;系统地将目前国内外序贯抽样的技术方法借鉴到钉螺调查抽样实践中来,比较了各序贯抽样方法,探索了最适序贯抽样模型。研究结论如下:
  (1)采用了12种种群聚集度指标和8个种群空间格局回归模型对钉螺的空间分布型进行研究。结果表明:在所有聚集度指标下,试验样地内的钉螺种群在所有尺度(17/3m×17/3m以内)的抽样单元下,其空间分布型均为聚集分布;在8个回归模型分析中,除了La-m幂回归模型外,在其余的7个回归模型中,试验样地内的钉螺种群在所有尺度(17/3m×17/3m以内)的抽样单元下,其空间分布型均为聚集分布;对于La-m幂回归模型而言,其在抽样单元尺度为1/3m×1/3m到尺度10/3m×10/3m上,钉螺种群空间空间分布型表现为聚集分布,在抽样单元尺度为11/3m×11/3m到尺度17/3m×17/3m上,钉螺种群空间分布型表现为均匀分布。
  (2)分析了钉螺个体群的基本情况。在研究得出试验样地内钉螺种群的空间分布型为聚集分的基础上:采用Blacktich种群聚集均数λ分析了钉螺种群聚集的原因可能是由于钉螺栖息环境因素的异质性和自身的聚集习性的共同作用或其中一个因素作用所导致的;用Sylvesetr-cox零频率模型公式估算了钉螺的平均密度是4.2348个/0.11m2,此估算结果与实际调查所得结果4.9465个/0.11m2存在14.3893%的相对误差,认为不适合用该模型来估计研究区内钉螺的平均密度;研究了不同尺度抽样单元下钉螺平均个体群大小,通过回归分析,认为可以通过平均密度来估算钉螺平均个体群的大小;结合有关聚集度指标和La-m幂回归模型的分析,得出试验地的最优尺度介于3m×3m与10/3m×10/m之间。
  (3)研究了调查区域钉螺种群序贯抽样的最适模型。在研究得出试验样地内钉螺种群的空间分布型为聚集分的基础上:通过7个回归模型的序贯分析比较,得出基于Taylor s2-m回归模型的序贯抽样分析所需要的最大样本量是所有回归模型序贯抽样方法中最少的,符合序贯抽样分析在既定概率保证和抽样误差控制的基础上,尽可能减少抽样数量的核心思想,是试验样地钉螺序贯抽样分析最适合的模型。
[硕士论文] 郭利萍
病原生物学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:背景:新疆位于中国西北边陲,陆地边境线5600多公里,约占全国陆地边境线的四分之一,周边与蒙古国等八国相邻。新疆在历史上是古丝绸之路的重要通道,是我国倡导的“一带一路”北线通往中亚乃至欧洲的重要陆地门户纽带。而蜱传立克次体可通过国际间家畜交易、候鸟及野生动物迁徙而散播,造成人畜立克次体病的感染。本研究旨在对新疆边境线地区蜱类进行蜱种的鉴定以及分析蜱传立克次体的分布规律和分子特征进行探究,为我国蜱传病原“外来入侵”监测及国际间疫病“联防联控”提供科学依据。
  方法:(1)2014年3月-2016年6月采集新疆边境地区14个县市家畜体表寄生蜱,对采集到的蜱进行形态学鉴定以及线粒体16S rRNA、COI、12S rRNA基因分子生物学鉴定,并进行系统发育分析。(2)采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)方法对新疆边境地区采集的蜱分别进行17kDa蛋白抗原(17kDa),外膜蛋白 A、B(ompA、ompB),柠檬酸合成酶基因(gltA),细胞表面抗原1、4基因(sca1、sca4)以及16S rRNA原核基因(rrs)共7个基因8个片段的聚合酶链式反应(PCR)检测立克次体核酸。对立克次体阳性样本进行测序和序列分析,并对阳性结果进行统计学分析。建立多基因系统进化树确定其遗传关系。
  结果:(1)新疆边境地区14个县市共采集到1279只寄生蜱。经蜱的形态学和分子生物学鉴定,本研究寄生蜱隶属三属五种,分别为:血蜱属Haemaphysalis(2种):刻点血蜱(H. punctata),短垫血蜱(H. erinacei)。革蜱属 Dermacentor(2种):草原革蜱(D. nuttalli),边缘革蜱(D. marginatus)。扇头蜱属Rhipicephalus(1种):图兰扇头蜱(R. turanicus)。(2)新疆边境地区14个县市采集的1279只蜱中共检出立克次体528份,平均感染率为41.28%。(3)边疆地区蜱中存在饶氏立克次体(Rickettsia raoultii)、马赛立克次体(R. massiliae)、埃氏立克次体(R. aeschlimannii)、斯洛伐克立克次体(R. slovaca)、西伯利亚立克次体(R. sibirica)、康氏立克次体印度亚种(R. conorii subsp. indica)和暂定巴布瑞立克次体(Candidatus R. barbariae)共7种立克次体感染,各边境县市立克次体携带率在6.25-77.92%之间,各蜱种立克次体携带率为6.25-46.10%。
  结论:(1)图兰扇头蜱是新疆边境地区优势蜱种,遍布几乎整个南边境线以及部分北边境地区;短垫血蜱为稀缺蜱种,仅分布在中-哈边境。(2)新疆边境地区呈现蜱内斑点热群立克次体高携带率,且南边境线阳性率显著高于北边境线地区。(3)首次在稀有野生动物虎鼬体表的短垫血蜱内检测到饶氏立克次体核酸。(4)首次在新疆边境地区检测到4种中国新的立克次体核酸,分别为埃氏立克次体(R. aeschlimannii)、马赛立克次体(R. massiliae)、康氏立克次体印度亚种(R. conorii subsp. indica)和暂定巴布瑞立克次体(Candidatus R. barbariae),将中国蜱传立克次体种类从六种扩大到了十种。(5)发现西伯利亚立克次体以及埃氏立克次体变异株,暂分别命名为西伯利亚新疆株(R. sibirica strain Xinjiang)和埃氏立克次体中国株(R. aeschlimannii strain China)。(6)本调查贯穿了新疆由北至南整条边境线,覆盖了新疆几乎所有边境县市,既为我国内陆地区疫病预警体系的提供了科学构架,又为国际间数据共享提供了基本信息,更为预防和控制生物恐怖引起的各种疾病及其对社会的影响提供了帮助。未来应对中-亚、中-欧边境地区国际贸易(特别是畜种引进、皮张等畜产品引进)、候鸟及野生动物蜱传立克次体进行定期监测与边境虫媒病预警体系的建立与完善。
[硕士论文] 赵姗姗
病原生物学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:目的:对新疆北疆边境地区蚤类(包括部分南疆蚤类)进行鉴定和病原检测,为新疆蚤传病的发生做出风险评估以及蚤传病的预防奠定基础。除此以外,对温泉县鼠疫疫源地所收集的样本及所有蚤类进行鼠疫筛查与分型,为追溯鼠疫的主要宿主、媒介及其生态地理景观的生物学类型提供科学依据。
  方法:1.2015-2016年在新疆北疆边境地区(布尔津县、阿拉山口市、温泉县、精河县、霍城县、察布查尔锡伯自治县和新源县)及和田地区民丰县收集哺乳动物体表寄生蚤;通过形态学及分子生物学(18S rDNA,28S rDNA,EF1-a,COII和COI),对所收集的蚤进行蚤种鉴定并进行基因系统发育分析。2.选取阿拉山口地区的长吻角头蚤、臀突客蚤、叶状切唇蚤突高亚种、后弯怪蚤及秃病蚤指名亚种组织 DNA送至北京诺禾致远生物信息科技有限公司,对细菌16S rDNA基因序列中的V3-V4可变区进行测序,分析其细菌的群落结构、种群多样性及丰富度。3.结合宏细菌数据,对所采集蚤类样本进行立克次体(MLST)、沃尔巴克体(wsp和16S rRNA)以及巴通体(glta、ITS和 ribC)的筛查,阳性片段进行克隆测序分析并构建遗传进化树,进行系统发育分析。4.收集温泉县动物血清、组织样本以及采集点的蚤类样本,采用间接血凝法对血清样本进行鼠疫血清学F1抗体监测,采用PCR检测技术对组织样本进行鼠疫(caf1和pla)筛查并且对阳性样本进行MLVA基因型的分析。
  结果:1.2015-2016年共收集蚤类样本5699匹,隶属于7科16属19种,分别为:长吻角头蚤、人蚤、同型客蚤指名亚种、臀突客蚤、印鼠客蚤、猫栉首蚤指名亚种、叶状切唇蚤突高亚种、宽新蚤、修长栉眼蚤指名亚种、宽臂纤蚤、八栉蝠蚤、林野细蚤、真凶中蚤精河亚种、似升额蚤指名亚种、后弯怪蚤、谢氏山蚤、方形黄鼠蚤七河亚种、秃病蚤指名亚种和花蠕形蚤;阿拉山口地区鼠体外寄生蚤季节变化显示,蚤类除1-2月份蚤指数低,其余10个月蚤指数较高且呈现一定的波动性。2.阿拉山口地区5种蚤中共测得726626条Tags被分成5447个OTUs,分析发现绝大多数的细菌分属于4个细菌门:放线菌、拟杆菌、厚壁菌和变形菌,丰度呈现明显差异性。3.立克次体:民丰县的花蠕形蚤中检测到暂定的巴贝瑞立克次体(Candidatus Rickettsia barbariae);阿拉山口地区的臀突客蚤、长吻角头蚤和后弯怪蚤中检测到与贝利立克次体(R. bellii)亲缘性较高的立克次体,在宽臂纤蚤和秃病蚤指名亚种检测到更为古老的立克次体。沃尔巴克体:在人蚤、客蚤、猫栉首蚤指名亚种、似升额蚤、后弯怪蚤、谢氏山蚤、方形黄鼠蚤七河亚种和秃病蚤指名亚种中均检测到,分子学分析显示该内共生体与以往在蚤内报道存在较大差异性。巴通体:在阿拉山口地区的5种及温泉与精河地区的3种蚤类中检测到巴通体:1)臀突客蚤和同型客蚤指名亚种中检测到Bartonella rochalimae;2)在臀突客蚤中检测到格拉范姆(B. grahamii);3)叶状切唇蚤突高亚种、后弯怪蚤和秃病蚤指名亚种检测到伊丽莎白(B. elizabethae);4)来自温泉县与精河县长尾黄鼠体外的似升额蚤和方形黄鼠蚤七河亚种中BZ01与来自温泉县旱獭体外的谢氏山蚤中的巴通体BZ02聚为一支且都与B. washoensis聚为一大支。4.2015年温泉县收集的血清学阳性率分别为灰旱獭2.1%(1/47)、牧羊犬6.7%(2/30)、长尾黄鼠0.7%(1/134);分子学检测发现仅在温泉县的谢氏山蚤及灰旱獭脏器中检测到鼠疫核酸阳性,且MLVA类型均为MT86(2-2-2-4-6-8-7-5-2-7-3-3-2-5)。
  结论:1.采集的19种蚤,叶状切唇蚤突高亚种、修长栉眼蚤指名亚种、宽臂纤蚤、八栉蝠蚤、真凶中蚤精河亚种、似升额蚤指名亚种、后弯怪蚤、谢氏山蚤、方形黄鼠蚤七河亚种和花蠕形蚤5对基因信息及长吻角头蚤(28S rDNA,COII,EF1-a,COI)、臀突客蚤(18S rDNA,28S rDNA和EF1-a)和秃病蚤指名亚种(18S rDNA,28S rDNA和COI)均为首次上传GenBank,丰富了数据库的信息并为以后的研究提供便利。2.宏细菌研究发现蚤类菌群中存在大量致病菌和条件致病菌属,提示我们在后续的研究调查中,有针对地筛查该地区的致病性病原,为该地区风险作出评估与预警。3.在蚤种和地区上,蚤类的立克次体、沃尔巴克体和巴通体的检测均为首次发现,并且巴通体均为致病性,提示在这些地区和蚤种中应引起高度重视。4.在阿拉套山和别珍套山又发现了2个新的鼠疫阳性监测点,显示该区鼠疫疫情仍在活跃,其范围有扩大的趋势,应高度警惕其向人间的传播。
[硕士论文] 廖德君
病原生物学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨碘染色法与改良培养法在人芽囊原虫(B.h)检出中的应用,并以此获得虫株后建立B.h纯培养体系,进而采用纯培养虫株建立SD大鼠感染模型,动态研究B.h感染大鼠的Th1/Th2平衡调节。
  方法:比较普通培养法和改良培养法的最低检出限、生长曲线及厌氧环境形成时间;从广西医科大学附属肿瘤医院门诊检验科收取397份粪便样本,采用碘染色法和改良培养法对样本进行检测,对阳性标本采用碘染色法和三色染色法进行染色观察,比较阳性检出率,以改良培养法为金标准,计算碘染色法的灵敏度、特异度、一致率和kappa值,采用PCR方法进行基因分型;采用LES培养基进行带菌培养,联合使用青霉素(1000U/ml)、链霉素(1000ug/ml)、两性霉素B(2.5 ug/ml)、磷霉素(20ug/ml)、阿莫西林-克拉维酸钾混悬液(31.25ug/ml)、氯霉素(20ug/ml)等6种抗生素进行无菌纯培养,使用鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板,进行单克隆试验;获取纯培养虫株后,取30只SD大鼠,分5组,每组6只,经地塞米松免疫抑制后,实验组经口感染107/只,对照组经口灌食等量灭菌PBS,分别于0d、3d、6d、9d和14d处死大鼠取材,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平,比色法检测结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的含量,HE染色观察结肠组织病理损伤,荧光定量PCR检测结肠中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10 mRNA的表达水平。
  结果:改良培养法的最低检出限低于普通培养法,改良培养法在B.h的密度在前3天高于普通培养法;在粪便及短期培养的标本中,可观察到空泡型和颗粒型,在粪便标本中可以观察到包囊;碘染色法的阳性率为1.01%,改良培养法的阳性率为5.54%,两者的阳性率差别有统计学意义;以改良培养法结果为金标准,碘染色法的灵敏度为18.18%,特异度为100%,一致率为95.47%,kappa值为29.57%;带菌培养和纯培养的B.h均以空泡型为主,带菌培养和纯培养的密度到达峰值的时间基本相同,但是带菌培养的密度下降很快,纯培养的密度下降缓慢,维持较高的密度;在鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板表面可观察到“菌落状”白色圆点,倒置显微镜下可看到大量空泡型虫体;感染大鼠与对照组的结肠病理评分为0分,感染大鼠结肠的MPO含量与对照组相比无显著改变;感染大鼠血清中IFN-γ和IL-4的表达水平与对照组相比无显著改变,14d组大鼠血清中TNF-α与对照组相比较有显著改变,3d组(P=0.003)、6d组(P=0.013)、9d组(P=0.004)、14d组(P=0.000)大鼠血清中的IL-10与对照组相比较均有统计学意义;各组结肠中细胞因子IFN-γ mRNA表达比较具有统计学差异,其中3d组、6d组和14d组与对照组相比较均具有统计学意义;各组大鼠结肠中的TNF-αmRNA比较具有统计学意义,但组间两两比较均无统计学意义;各组结肠中细胞因子IL-4 mRNA表达比较具有统计学差异,其中6d组和9d组与对照组相比较均有显著改变;各组大鼠结肠中的IL-10 mRNA比较具有统计学意义,其中6d组与对照组相比较有显著改变。
  结论:改良培养法的灵敏度高于碘染色法,可用于B.h的实验室诊断;联合大剂量使用抗生素可以获得纯培养的虫株并用固体培养基实现B.h的单克隆,且体外纯培养的B.h虫株可成功感染SD大鼠;ST3型B.h感染可影响大鼠Th1/Th2的平衡调节。
[硕士论文] 林万里
病理学与病理生理学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  AMA1和EAB-175是恶性疟原虫入侵红细胞的两个关键蛋白,同时也是当前研制疟疾疫苗的主要靶点。由于两个抗原均具有高度的多态性,研究非洲不同地区恶性疟原虫(Pf)的裂殖子顶端膜抗原1(apical membrane antigen-1, AMA-1)Ⅰ区基因序列特征,初步探讨其多态性形成的原因和机制,为进一步了解Pf AMA1基因多态性的分布情况并为疟疾疫苗的研制提供了一定的分子基础。了解该地区恶性疟原虫红细胞结合抗原175(erythrocyte binding antigen-175)Ⅲ区中F片段和C片段出现的频率(在单个疟原虫中有且仅有一个F片段或C片段会出现),以探讨不同虫株感染与宿主体内虫密度之间的关联性。
  方法:
  使用免疫胶体金法试剂盒和显微镜镜检(WHO规定确诊疟原虫的标准方法)及荧光定量PCR进行了虫种鉴定,筛选确诊为恶性疟原虫感染的病例。征得患者同意后,收集患者手指末梢血2-3滴,滴于滤纸上,待滤纸干燥后,编码并记载各个病人病案记录后收入塑料密封袋中制备干血片,室温下干燥后置于-80℃冰箱冻存。采用Chelex-100提取滤纸血样中的DNA,制备实验样本。巢式PCR扩增Pf AMA1Ⅰ区(498bp)和恶性疟原虫EBA175Ⅲ区(F片段和C片段,长度分别为795bp和714bp)。凝胶电泳鉴定扩增产物,将扩增产物纯化并测序。使用 DnaSP5.10、MEGA5.0等在线生物软件将测序结果进行分析并讨论。
  结果:
  Bioko岛51例恶性疟原虫样本中有41种AMA1单倍型(H=41),其中有24种单倍型在基因库中无100%吻合序列,多态位点(S)为45个,核苷酸多样度(π)为0.028±0.001;在41例非洲大陆国家样本中有31种AMA1单倍型(H=31),其中有9种单倍型在基因库中无100%吻合序列,多态位点(s)为40个,核苷酸多样度(π)为0.027±0.001。两组样本中性检验结果中除了MK检验有统计学意义,其他均无统计学意义;两组样本连锁不平衡指数R2随着核苷酸遗传距离增加出现下降趋势。
  对Bioko岛样本的EBA-175Ⅲ区F/C片段进行测序,测序成功的样本为134个。将样本数按F片段感染、C片段感染以及F/C混合感染分为3组,分别为110例(82.1%),15例(11.2%)和9例(6.7%)。使用单因素方差分析检验3组样本的疟原虫密度是否有差异,结果显示混合感染组虫密度分别与另外两组虫密度之间差异具有统计学意义,而F片段感染与C片段感染病例之间的虫密度差异无统计学意义。使用秩和检验对不同年龄段患者虫密度进行统计分析,发现不同年龄段患者之间虫密度无统计学差异。
  结论:
  恶性疟原虫样本顶端膜抗原1(AMA-1)Ⅰ区具有较高的核苷酸多态性和单倍型多态性,可作为恶性疟原虫研究的靶向分子,对了解恶性疟原虫的遗传特征有一定的参考意义。Pf AMA-1Ⅰ区基因多态性的产生可能是自然选择和基因内重组共同作用的结果。研究结果为进一步了解疟疾流行特征及疟疾疫苗的研制提供了分子基础。EBA-175Ⅲ区F/C片段混合感染的患者体内虫密度高于两者单独感染的患者,这为制定疟疾的临床治疗方案提供了分子基础,可在一定程度上,避免因过度治疗或治疗力度不够而形成疟疾耐药。
[博士论文] 石清明
病原生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:登革热是由登革病毒引起的一种重要虫媒传染病,近年来,全球登革热发病率急剧上升,有100多个国家呈地方性流行,其中东南亚是受侵袭最严重的地区之一。云南省在历史记载中有过少量登革热输入病例的报道,但自从2008年开始出现本地感染病例以后,尤其是2013年以来云南省已经多次发生由输入病例引起的本地感染登革热疫情暴发。
  埃及伊蚊是重要的医学昆虫,是登革热的主要传播媒介。埃及伊蚊起源于非洲,主要分布在热带和亚热带地区。虽然其飞行扩散距离有限,但可以通过成蚊、蛹、幼虫、卵等方式随着飞机、轮船、汽车运输或其他人类活动而发生远距离的被动扩散,在19世纪后期通过航运入侵到东南亚。2000年以前,埃及伊蚊在我国的分布也仅限于北纬22°以南地区,包括台湾南部、海南以及广东、广西的部分地区和个别岛屿,在云南省并未有过埃及伊蚊的记载。然而,全球化发展以及全球气候变暖,为媒介生物的扩散提供了更加便利的条件。自2002年2月首次在云南省发现埃及伊蚊以来,现已在瑞丽、芒市、勐腊、勐海、景洪、盈江、陇川、泸水、耿马等地陆续发现,且分布范围和种群数量不断扩大,入侵和扩散形势非常严峻,埃及伊蚊已经成为了云南省的一个重要外来入侵蚊种。而且,与云南省接壤的越南、缅甸和老挝等国家均有埃及伊蚊且登革热频发,埃及伊蚊的入侵则加重了云南省登革热暴发和流行的风险。但是,目前对我国云南省的埃及伊蚊研究大多仅限于分布调查层面上,对于其种群遗传分化及特征、抗药性水平及机制等方面缺乏深入研究。
  基于以上原因,本研究以云南省埃及伊蚊为研究对象,通过现场采集云南省不同地区的埃及伊蚊自然种群,主要从两个方面予以深入研究。一是提取基因组DNA,综合利用微卫星DNA标记和线粒体DNA基因COI、ND4、ND5进行种群遗传特征研究,以期了解和掌握云南省埃及伊蚊种群遗传多样性和遗传结构特征,并对其种群结构和入侵事件予以探讨;二是将现场采集的埃及伊蚊进行实验室传代养殖后,通过蚊虫抗药性生物学测定、代谢酶活性以及靶标基因的检测,掌握云南省埃及伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平和抗药性分子特征,为化学杀虫剂防治埃及伊蚊提供科学依据。
  本研究结果如下:
  1、微卫星研究结果
  本研究通过文献查找,筛选获得的9个微卫星位点容易扩增且稳定性好、差异性明显、多态信息含量高(PIC=0.392~0.886)。结果表明所选用的9个微卫星位点能够充分满足本研究的需要,每个种群的样本采集量能够满足研究的样本含量需求。9个微卫星位点从28个埃及伊蚊自然种群中共获得等位基因数114个,平均每个位点获得等位基因数12.67个。从位点角度分析看,每个位点平均在每个种群获得的等位基因在3.46~7.14之间。各种群的基因丰富度在3.34~5.72之间,瑞丽和景洪两地埃及伊蚊的种群基因丰富度较为接近,且均高于2016年在其他边境地区采集的埃及伊蚊种群。
  云南省埃及伊蚊种群总体上具有较高的遗传多样性,9个微卫星位点的观察杂合度在0.108~0.939之间,平均观察杂合度为0.579;而期望杂合度在0.367~0.760之间,平均期望杂合度为0.592。各种群的观察杂合度在0.401~0.689之间,其中2016年在其他边境地区采集的8个种群观察杂合度高于期望杂合度,瑞丽和景洪地区采集的20个种群均为观察杂合度低于期望杂合度。
  基因型连锁不平衡分析显示云南28个埃及伊蚊自然种群的9个位点之间的1008对位点中,有166对位点存在着显著的连锁情况(P<0.05),其他位点均表现为独立遗传(P>0.05)。
  哈迪温伯格平衡检验显示28个种群中仅有景洪(GLR)、勐海(M1H)2个种群发生了哈温平衡偏离。采用TPM和SMM两种模式检测云南埃及伊蚊种群近期是否经历遗传瓶颈效应,结果显示共有10个自然种群产生了瓶颈效应,其中瑞丽地区采集的10个种群中有6个(MNL、JDL、JGH、JCG、GMG、CXT)种群产生了瓶颈效应,占瑞丽地区种群的60%;2016年在其他边境地区采集的8个自然种群中有4个产生了瓶颈效应,占50%;而景洪地区采集的10个种群均没有产生瓶颈效应。
  近交系数结果显示2016年在其他边境地区采集的8个种群中有7个种群的近交系数均为负数,表示这7个种群近交程度很低,而其他种群的近交系数为正值,意味着这些种群存在不同程度的近交。
  成对固定指数(FST)分析显示,各种群间仅有17个成对固定指数(FST)未表现出明显的遗传分化,其余361个成对固定指数(FST)均表现出明显的遗传分化。
  应用STRUCTRUE软件对各个个体的聚类分析,结合群体内遗传差异数据,结果显示当K=3时,将云南省不同地区的28个埃及伊蚊种群分为3类较为合理,瑞丽地区采集的10个种群、景洪地区采集的10个种群以及2016年在其他边境地区采集8个种群各聚成1类。基于Nei’s标准遗传距离应用UPGMA构建系统发育树与PCoA图谱分析也显示同样的结果。
  分子方差分析(AMOVA)表明不同组之间存在明显的分化,占14.51%;同一区域内不同种群之间的遗传分化占总的6.01%;来自个体之间的遗传分化最为显著,占77.76%。相关性分析显示地理距离和遗传分化之间呈现正相关(r=0.4948,P<0.0001)。
  综合分析判断,2002年发现的瑞丽入侵和2013年发现的景洪入侵应为不同的入侵事件,而2016年采集的其他边境地区仍然存在着持续的多点入侵。
  2、线粒体DNA研究结果
  本研究分析了云南省瑞丽和景洪地区20个不同的埃及伊蚊地理种群的线粒体基因CO I、ND4和ND5的基因多样性指数,结果显示CO I基因A+T的含量为66.9%,共获得381个多态性位点,多态性位点占碱基总数的45.36%(其中包括66个自裔位点和315个简约信息位点),共获得单倍型14种,总群体核苷酸多样性指数为0.02265、单倍型多样性指数为0.5583。ND4基因A+T的含量为70.0%,共获得334个多态性位点,多态性位点占碱基总数的55.76%(其中包括126个自裔位点和191个简约信息位点),共获得单倍型18个,总群体核苷酸多样性指数为0.01860、基因单倍型多样性指数为0.47156。ND5基因A+T的含量为74.6%,共获得369个多态性位点,多态性位点占碱基总数的60.89%(其中包括109个自裔位点和254个简约信息位点),共获得单倍型5种,总群体核苷酸多样性指数为0.07223、单倍型多样性指数为0.5098。由于ND5基因片段的单倍型较少(仅5种),本研究仅利用COI和ND4对瑞丽和景洪地区的20个埃及伊蚊地理种群进行了遗传分化和遗传结构研究。
  基于COI基因的遗传分化结果显示景洪的GGH种群与瑞丽的MNL、BFC、HDH、BNS等4个种群遗传分化不显著,反而与景洪地区的GXS、JBQ、YSC、DMY、GSZ、NKH等5个种群间具有明显的遗传分化。而基于ND4基因的遗传分化结果显示瑞丽的HDH种群与景洪的LJY、JBQ、YSC三个种群间不存在明显的遗传分化,更有意思的是,该种群与瑞丽地区其他9个种群具有明显的遗传分化。说明瑞丽和景洪地区的埃及伊蚊种群间可能存在着相互交流。基于CO I和ND4基因的遗传分化结果均显示,景洪地区各种群间遗传分化水平明显低于瑞丽地区各种群间的遗传分化。这一结果与微卫星研究的结果相似。
  线粒体COI和ND4基因单倍型虽然能够被网络图分布格局与NJ进化树分化为2个分支,但结合各单倍型的地理种群分布,无法进行非常清楚地分支。Tajima’SD和 Fu’sFS中性检验出现了显著的负值,核苷酸错配分布显示分布曲线均呈单峰结构形式,这些结果都说明这些地区的埃及伊蚊经历了明显的种群扩张。
  3、抗药性生物学测定结果
  以实验室养殖的云南埃及伊蚊敏感株为参照,采用敏感基线法对幼虫进行生物学测定,三种杀虫剂的毒力以残杀威最低(LC50=1.02882mg/L,95%CI:0.97708~1.08173 mg/L), 其次为敌敌畏(LC50=0.0367 mg/L,95%CI:0.03580~0.03770 mg/L),高效氯氰菊酯毒力最高(LC50=0.00102 mg/L,95%CI:0.00088~0.00118 mg/L)。对2016年在云南省西双版纳傣族自治州和德宏州采集的12个埃及伊蚊自然种群幼虫的生物学测定结果显示,对高效氯氰菊酯的抗性倍数在11.31~41.56之间,而对敌敌畏和残杀威虽然抗性水平略有升高,尚未达到抗性种群的标准。通过敏感基线法获得云南埃及伊蚊敏感株的对三种杀虫剂的成蚊诊断剂量分别为残杀威983.41 mg/L、敌敌畏181.95 mg/L、高效氯氰菊酯1493.37mg/L。以诊断剂量法对各自然种群埃及伊蚊成蚊进行生物学测定,成蚊生物学测定结果也显示只对高效氯氰菊酯产生了抗药性,成蚊生测结果与幼虫生测结果基本一致。
  4、代谢解毒酶活性检测结果
  本研究采用WHO推荐的生物化学测定法检测了云南埃及伊蚊各自然种群的代谢解毒酶活性,结果显示:各野外种群在受到残杀威抑制作用后,ACHE活性为未受抑制作用的22.36-31.60%之间,其中仅有J-3和J-5略高于30%;以α-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(1-N)活性均值为111.1717±34.9588 nmole of1-naphthol/min/mg protein,而野外种群的EST(1-N)活性均值在41.7940 nmole of1-naphthol/min/mg protein~198.5297 nmole of1-naphthol/min/mg protein之间;以β-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(2-N)活性为135.4011±47.3301 nmole of2-naphthol/min/mg protein,野外种群的EST(2-N)活性在39.7117 nmole of2-naphthol/min/mg protein~214.0106 nmole of2-naphthol/min/mg protein之间;敏感株MFO活性为3.08±3.77nmol cytochrome C/mg protein,野外种群的MFO活性在5.43 nmol cytochrome C/mg protein~20.11 nmol cytochrome C/mg protein之间,与敏感株相比,野外种群的MFO活性均高于敏感种群;敏感株GST活性为1.2504±0.3961 nmol of CDNB/min/mg protein,野外种群的GST活性在0.6178 nmol of CDNB/min/mg protein~3.4939 nmol of CDNB/min/mg protein之间。上述结果中仅有MFO在所有野外种群中的酶活性升高,而其他代谢酶在不同种群中的表现不一,这一结果提示云南埃及伊蚊对高效氯氰菊酯的抗药性可能主要与MFO酶活性升高有关。对于酶活性水平与生物学测定之间结果差异的原因有待进一步研究。
  5、靶标抗性检测结果
  本研究发现云南埃及伊蚊野外株钠离子通道氨基酸序列第1534位点的氨基酸突变,由F突变为C,相对应的碱基TTC突变为TGC,未发现其他突变位点。相关性分析发现这个点的突变仅与对杀虫剂高效氯氰菊酯抗药性成正相关,未发现与对残杀威和敌敌畏抗药性有关。
[硕士论文] 吕清巧
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  获取白纹伊蚊ADGF-B(Ab-ADGF-B)活性蛋白,探讨其可能的生物学功能。
  方法:
  从 NCBI数据库中下载白纹伊蚊 Ab-ADGF-B基因 ORF序列(GenBank No. AAV90660),对基因序列进行生物信息学分析;将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,将测序正确的重组质粒pET32a(+) Ab-ADGF-B(rAb-ADGF-B)转化入表达菌Rosetta-gamiB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并用SDS-PAGE和免疫印迹(western blotting)鉴定。用Ni-NTA亲和层析柱纯化rAb-ADGF-B蛋白后制备抗血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测抗体效价。采用分光光度法检测rAb-ADGF-B蛋白的ADA酶催化活性;同时采用细胞计数法检测 rAb-ADGF-B对小鼠巨噬细胞(ANA)的增殖作用;最后检测rAb-ADGF-B对人全血部分凝血酶原时间(prothrombin time,PT),凝血酶时间(thrombin time,TT)及凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的影响。
  结果:
  1.成功构建rAb-ADGF-B重组质粒;测序结果显示:成熟肽基因长1545 bp,编码514个氨基酸;结构域预测显示具有1个ADGF结构域。在20℃、150rpm的条件下经0.4 mM的IPTG诱导24 h获得可溶性rAb-ADGF-B蛋白。获得兔抗rAb-ADGF-B多克隆抗体,效价为1:10000。Western blotting证实获取的重组蛋白是目的蛋白。在30℃,pH7.0条件下,0.67μM rAb-ADGF-B可以催化100μM腺苷生成肌苷;同时,0.134μM rAb-ADGF-B蛋白和 ANA细胞共培养36 h后,细胞数量约由5×104增加到14×105。此外,2.67μM rAb-ADGF-B作用下,PT、TT和APTT分别为13.33S、15.23S、和35S,无延时效应。
  结论:
  成功获取白纹伊蚊唾液腺源rAb-ADGF-B可溶性蛋白,该蛋白具有ADA酶活性,对小鼠巨噬细胞增殖有影响。
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