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[博士论文] 雷卫强
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。
  RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。
  (一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析
  本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的cDNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的gDNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。
  (二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析
  体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。
  (三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析
  预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过dsRNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。
  本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
[硕士论文] 胡锦阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。
  起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(gRNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也己应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:
  (1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型
  本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的iL3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。
  (2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究
  以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒pAJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。
  (3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用
  本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对CeCas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512bp大小的序列作为gRNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条gRNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条gRNA是否具有良好的打靶效率,做了spCas9/gRNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的SsCas9和gRNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将pAJ50-Cas9质粒和pXL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到SsCas9和gRNA片段,说明SsCas9和gRNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将pAJ50-Cas9分别与pXL-BACII-gRNA4、pXL-BACII-gRNA7和pXL-BACII-gRNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。
  本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 肖聪
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:布氏锥虫是一种原生寄生生物,通过采采蝇在哺乳动物间传播,在撒哈拉以南的非洲地区引起人的嗜睡症和牛的那加那病,对人的健康和经济发展带来巨大危害,目前还没有针对锥虫病的有效药物。本论文研究的主要对象是布氏锥虫未知蛋白Q38FZ4和Alba,希望通过对它们结构和功能的研究来为治疗锥虫病开辟新的道路。
  Q38FZ4是布氏锥虫中一个由85个氨基酸残基构成的可溶蛋白,对血液型和前循环型的锥体虫都十分重要。Q38FZ4与哺乳动物中蛋白的序列同源性非常低,而在动基体目寄生生物中该蛋白具有高度的保守性,是抗锥虫药物的潜在靶点。我们用核磁共振技术解析了Q38FZ4的溶液结构,Q38FZ4蛋白具有一个由3个平行/反平行的β折叠片组成的β折叠片层,和1个斜跨该β片层的长螺旋以及分布在四周的4个小螺旋。我们通过RNA干扰对Q38FZ4进行敲除后,布氏锥虫细胞的生长受到抑制,说明它对布氏锥虫的生长十分重要。在荧光显微镜下,我们观察到带eYFP标签的Q38FZ4蛋白仅在细胞分裂间期定位于溶酶体上。在对带不同标签的Q38FZ4蛋白进行串联亲和纯化实验中,多种溶酶体蛋白和微管相关蛋白被分别纯化出来,说明Q38FZ4参与溶酶体中的物质运输过程。
  Alba家族蛋白是一类广泛分布在古细菌和众多真核生物中的以二聚体形式存在的核酸结合蛋白。这些蛋白能与核糖体亚基、翻译因子、其他RNA结合蛋白相互作用,通过控制基因的表达来参与各种调节通路。布氏锥虫中鉴定出了4种Alba蛋白,它们是TbAlba1-4。我们得到了TbAlba1的晶体,并收集到了一套分辨率为2.7 A的衍射数据。我们通过GST pull down和ITC实验确定了布氏锥虫Alba蛋白间的相互作用及竞争结合关系。我们还发现TbAlba3和TbAlba4能结合布氏锥虫中特定分子量大小的RNA,而TbAlba1和TbAlba2却无法结合RNA,由此推测TbAlba3-4结合RNA的能力与它们C端的RGG重复序列有关。此外,它们在与TbAlba1或TbAlba2形成异二聚体后结合RNA的范围得到提高。我们用EMSA证实了TbAlba能结合非特异的双链DNA和DNA的G四联体结构,并用ITC测得TbAlba3与DNA的G四联体有较强的结合力,说明TbAlba参与的生物过程不仅只与RNA有关,还涉及到DNA。
[硕士论文] 林万里
病理学与病理生理学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  AMA1和EAB-175是恶性疟原虫入侵红细胞的两个关键蛋白,同时也是当前研制疟疾疫苗的主要靶点。由于两个抗原均具有高度的多态性,研究非洲不同地区恶性疟原虫(Pf)的裂殖子顶端膜抗原1(apical membrane antigen-1, AMA-1)Ⅰ区基因序列特征,初步探讨其多态性形成的原因和机制,为进一步了解Pf AMA1基因多态性的分布情况并为疟疾疫苗的研制提供了一定的分子基础。了解该地区恶性疟原虫红细胞结合抗原175(erythrocyte binding antigen-175)Ⅲ区中F片段和C片段出现的频率(在单个疟原虫中有且仅有一个F片段或C片段会出现),以探讨不同虫株感染与宿主体内虫密度之间的关联性。
  方法:
  使用免疫胶体金法试剂盒和显微镜镜检(WHO规定确诊疟原虫的标准方法)及荧光定量PCR进行了虫种鉴定,筛选确诊为恶性疟原虫感染的病例。征得患者同意后,收集患者手指末梢血2-3滴,滴于滤纸上,待滤纸干燥后,编码并记载各个病人病案记录后收入塑料密封袋中制备干血片,室温下干燥后置于-80℃冰箱冻存。采用Chelex-100提取滤纸血样中的DNA,制备实验样本。巢式PCR扩增Pf AMA1Ⅰ区(498bp)和恶性疟原虫EBA175Ⅲ区(F片段和C片段,长度分别为795bp和714bp)。凝胶电泳鉴定扩增产物,将扩增产物纯化并测序。使用 DnaSP5.10、MEGA5.0等在线生物软件将测序结果进行分析并讨论。
  结果:
  Bioko岛51例恶性疟原虫样本中有41种AMA1单倍型(H=41),其中有24种单倍型在基因库中无100%吻合序列,多态位点(S)为45个,核苷酸多样度(π)为0.028±0.001;在41例非洲大陆国家样本中有31种AMA1单倍型(H=31),其中有9种单倍型在基因库中无100%吻合序列,多态位点(s)为40个,核苷酸多样度(π)为0.027±0.001。两组样本中性检验结果中除了MK检验有统计学意义,其他均无统计学意义;两组样本连锁不平衡指数R2随着核苷酸遗传距离增加出现下降趋势。
  对Bioko岛样本的EBA-175Ⅲ区F/C片段进行测序,测序成功的样本为134个。将样本数按F片段感染、C片段感染以及F/C混合感染分为3组,分别为110例(82.1%),15例(11.2%)和9例(6.7%)。使用单因素方差分析检验3组样本的疟原虫密度是否有差异,结果显示混合感染组虫密度分别与另外两组虫密度之间差异具有统计学意义,而F片段感染与C片段感染病例之间的虫密度差异无统计学意义。使用秩和检验对不同年龄段患者虫密度进行统计分析,发现不同年龄段患者之间虫密度无统计学差异。
  结论:
  恶性疟原虫样本顶端膜抗原1(AMA-1)Ⅰ区具有较高的核苷酸多态性和单倍型多态性,可作为恶性疟原虫研究的靶向分子,对了解恶性疟原虫的遗传特征有一定的参考意义。Pf AMA-1Ⅰ区基因多态性的产生可能是自然选择和基因内重组共同作用的结果。研究结果为进一步了解疟疾流行特征及疟疾疫苗的研制提供了分子基础。EBA-175Ⅲ区F/C片段混合感染的患者体内虫密度高于两者单独感染的患者,这为制定疟疾的临床治疗方案提供了分子基础,可在一定程度上,避免因过度治疗或治疗力度不够而形成疟疾耐药。
[硕士论文] 廖德君
病原生物学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨碘染色法与改良培养法在人芽囊原虫(B.h)检出中的应用,并以此获得虫株后建立B.h纯培养体系,进而采用纯培养虫株建立SD大鼠感染模型,动态研究B.h感染大鼠的Th1/Th2平衡调节。
  方法:比较普通培养法和改良培养法的最低检出限、生长曲线及厌氧环境形成时间;从广西医科大学附属肿瘤医院门诊检验科收取397份粪便样本,采用碘染色法和改良培养法对样本进行检测,对阳性标本采用碘染色法和三色染色法进行染色观察,比较阳性检出率,以改良培养法为金标准,计算碘染色法的灵敏度、特异度、一致率和kappa值,采用PCR方法进行基因分型;采用LES培养基进行带菌培养,联合使用青霉素(1000U/ml)、链霉素(1000ug/ml)、两性霉素B(2.5 ug/ml)、磷霉素(20ug/ml)、阿莫西林-克拉维酸钾混悬液(31.25ug/ml)、氯霉素(20ug/ml)等6种抗生素进行无菌纯培养,使用鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板,进行单克隆试验;获取纯培养虫株后,取30只SD大鼠,分5组,每组6只,经地塞米松免疫抑制后,实验组经口感染107/只,对照组经口灌食等量灭菌PBS,分别于0d、3d、6d、9d和14d处死大鼠取材,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平,比色法检测结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的含量,HE染色观察结肠组织病理损伤,荧光定量PCR检测结肠中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10 mRNA的表达水平。
  结果:改良培养法的最低检出限低于普通培养法,改良培养法在B.h的密度在前3天高于普通培养法;在粪便及短期培养的标本中,可观察到空泡型和颗粒型,在粪便标本中可以观察到包囊;碘染色法的阳性率为1.01%,改良培养法的阳性率为5.54%,两者的阳性率差别有统计学意义;以改良培养法结果为金标准,碘染色法的灵敏度为18.18%,特异度为100%,一致率为95.47%,kappa值为29.57%;带菌培养和纯培养的B.h均以空泡型为主,带菌培养和纯培养的密度到达峰值的时间基本相同,但是带菌培养的密度下降很快,纯培养的密度下降缓慢,维持较高的密度;在鸡蛋上清液-马血清-Bacto agar混合琼脂平板表面可观察到“菌落状”白色圆点,倒置显微镜下可看到大量空泡型虫体;感染大鼠与对照组的结肠病理评分为0分,感染大鼠结肠的MPO含量与对照组相比无显著改变;感染大鼠血清中IFN-γ和IL-4的表达水平与对照组相比无显著改变,14d组大鼠血清中TNF-α与对照组相比较有显著改变,3d组(P=0.003)、6d组(P=0.013)、9d组(P=0.004)、14d组(P=0.000)大鼠血清中的IL-10与对照组相比较均有统计学意义;各组结肠中细胞因子IFN-γ mRNA表达比较具有统计学差异,其中3d组、6d组和14d组与对照组相比较均具有统计学意义;各组大鼠结肠中的TNF-αmRNA比较具有统计学意义,但组间两两比较均无统计学意义;各组结肠中细胞因子IL-4 mRNA表达比较具有统计学差异,其中6d组和9d组与对照组相比较均有显著改变;各组大鼠结肠中的IL-10 mRNA比较具有统计学意义,其中6d组与对照组相比较有显著改变。
  结论:改良培养法的灵敏度高于碘染色法,可用于B.h的实验室诊断;联合大剂量使用抗生素可以获得纯培养的虫株并用固体培养基实现B.h的单克隆,且体外纯培养的B.h虫株可成功感染SD大鼠;ST3型B.h感染可影响大鼠Th1/Th2的平衡调节。
[博士论文] 王软林
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白质的合成是所有生物体中的基本生命过程。核糖体维持正确的读框对于蛋白质的合成至关重要,一旦发生移码,将会导致截短的或无义蛋白的生成,从而造成翻译能量的损耗,加重细胞清除及质控机制的负担。然而,在某些特殊情况下,翻译中的核糖体能够在mRNA的特定位置,从起始的0读框转换到-1或+1读框,然后继续进行翻译,这一过程被称作编程性核糖体移码(programmed ribosomal frameshifting,PRF)。PRF现象首次在病毒中发现,随后越来越多的证据表明该现象普遍存在于从细菌到真核生物等生命进化的各个分支。前期基于单个基因的研究显示游仆虫中具有高频率的+1PRF现象。本研究对八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)的大核基因组及转录组进行了测序分析,从基因组水平对这一特殊现象及其分子机制进行了深入探讨。此外,还通过质谱分析对预测的PRF基因加以验证。所得结果如下:
  1.利用Illumina测序平台对八肋游仆虫大核基因组进行测序,共得到约11Gb原始数据;将低质量reads过滤后,采用meta-assembly的拼接策略进行基因组组装,将组装结果中来自于细菌基因组及线粒体基因组的污染DNA去除后,最终得到41,980条Contigs,其N50为2,947bp,其中包含双端端粒的Contigs有29,413条;随后采用三种方法对拼接结果的完整性进行评估,结果表明拼接结果基本完整,八肋游仆虫大核基因组能够编码细胞营养生长阶段所需的全部基因;最后,利用AUGUSTUS软件对大核基因组中的non-PRF Contigs进行基因的从头预测,共预测出29,076个完整基因,其中90%的基因有RNA-Seq数据的支持。对每条微染色体所包含的基因个数进行了统计,结果显示约83%的微染色体仅编码一个基因;与其他纤毛虫一样,八肋游仆虫非编码区的AT含量比编码区高。
  2.利用二代测序技术,对生长阶段的八肋游仆虫转录组进行测序,共得到4.9Gb数据。采用两种方法对转录组数据进行组装,比较后选择Tophat&Cufflinks的组装结果进行后续分析,该方法共拼接出32,353条转录本,平均长度为1,300bp;基于转录组数据,采用相似性搜索的策略,最终共预测出4,690个移码位点,分布于3,866个编程性核糖体移码基因中,其中+1PRF基因3,700个,+2/-1PRF基因166个。随后通过跟其他游仆虫进行同源序列比对,共鉴定出5个-1PRF基因;对移码基因进行了Pfam结构域注释,KEGG信号通路注释及GO功能注释,注释结果显示游仆虫中PRF基因功能多样,分布于多个信号通路及生物过程;利用GO信息,对移码基因进行了功能富集分析,结果表明移码基因显著富集于多个生物过程,主要涉及到磷酸化、去磷酸化及依赖泛素的蛋白降解等过程。
  3.对八肋游仆虫的总蛋白进行了大规模质谱分析,最终得到2,853种蛋白的肽段信息,其中253种为PRF蛋白;移码位点被肽段覆盖的基因有7个,全部为+1PRF基因,其中CUFF.27536.1的两个+1位移码位点均有肽段覆盖。根据移码位点肽段的氨基酸序列信息,确定了游仆虫中+1PRF基因的移码发生在滑动序列中终止密码子TAR(R=A or G)的T处;此外还有89个PRF基因的移码位点上下游均有肽段覆盖,包括82个+1PRF基因以及7个+2PRF基因,这些肽段为证明游仆虫中的PRF现象提供了间接的蛋白证据;根据肽段信息,结合多序列比对结果,我们推测八肋游仆虫的+2位移码过程中,核糖体跳过了滑动序列中终止密码子TAR的TA两个核苷酸。
  4.对所有PRF基因移码位点上下游30bp的序列进行保守序列模体的分析,结果发现除滑动序列外,无其他保守序列元件;对滑动序列的分析结果显示,约92%的移码位点由AAA密码子和紧随其后的终止密码子组成,其余8%由其他密码子和终止密码子构成,移码位点共包含47种有义密码子;在+1PRF基因的滑动序列中XXX(三个核苷酸相同)类型的密码子最多(97%),而在+2PRF基因的滑动序列中XTA(X代表任意核苷酸)类型的密码子最多(73%),5个-1PRF基因中,有3个基因的滑动序列为AAG TAA,其余两个分别为TCT TAA和TTT TAA,其滑动序列下游未检测到假结或茎环等刺激结构;此外,对八肋游仆虫中正常翻译终止位点及移码位点中终止密码子及四核苷酸序列的使用频率进行了比较,结果显示UAA和UAA-A在正常翻译终止位点和移码位点中都是优先使用的,但移码位点中UAA及UAA-A的使用频率要显著高于正常翻译终止位点。这些结果说明在游仆虫中,终止密码子UAA及四核苷酸序列UAA-A可能更有利于移码的发生。八肋游仆虫大核基因组中含有12种反密码子环扩大的特殊tRNAs,对其核酸序列进行分析结果表明这些tRNAs含有保守的基因内启动子,TATA-box以及终止信号。随后对八肋游仆虫的small RNA进行了高通量测序,结果表明除Contig34792外,其他特殊tRNAs均具有转录活性。
  5.基于核酸序列信息,共鉴定出23个包含读框内终止密码子的基因。对其中编码组织蛋白酶B的基因进行了序列分析及同源序列比对,结果显示,在八肋游仆虫中,UAA和UAG既可作为终止密码子,又可以编码氨基酸;质谱分析检测到AMP结合酶家族蛋白的三条肽段,证明在八肋游仆虫体内,含有读框内终止密码子的基因能够翻译出有功能的蛋白产物。
  6.建立了八肋游仆虫基因组数据库(Euplotes octocarinatus Genome Database,EOGD,http://ciliates.ihb.ac.cn/database/species/eo),该数据库整合了本研究测得的八肋游仆虫大核基因组数据、转录组数据、预测基因的注释信息以及关于八肋游仆虫分类和形态的描述信息。该数据库设计了多种简单易用的搜索方式,包括Gene ID、scaffold ID、关键词、基因的序列及位置信息等,使研究人员能够轻松获取游仆虫基因组及转录组数据。EOGD的建立为在游仆虫中开展相关研究提供了极大的便利。
[博士论文] 石清明
病原生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:登革热是由登革病毒引起的一种重要虫媒传染病,近年来,全球登革热发病率急剧上升,有100多个国家呈地方性流行,其中东南亚是受侵袭最严重的地区之一。云南省在历史记载中有过少量登革热输入病例的报道,但自从2008年开始出现本地感染病例以后,尤其是2013年以来云南省已经多次发生由输入病例引起的本地感染登革热疫情暴发。
  埃及伊蚊是重要的医学昆虫,是登革热的主要传播媒介。埃及伊蚊起源于非洲,主要分布在热带和亚热带地区。虽然其飞行扩散距离有限,但可以通过成蚊、蛹、幼虫、卵等方式随着飞机、轮船、汽车运输或其他人类活动而发生远距离的被动扩散,在19世纪后期通过航运入侵到东南亚。2000年以前,埃及伊蚊在我国的分布也仅限于北纬22°以南地区,包括台湾南部、海南以及广东、广西的部分地区和个别岛屿,在云南省并未有过埃及伊蚊的记载。然而,全球化发展以及全球气候变暖,为媒介生物的扩散提供了更加便利的条件。自2002年2月首次在云南省发现埃及伊蚊以来,现已在瑞丽、芒市、勐腊、勐海、景洪、盈江、陇川、泸水、耿马等地陆续发现,且分布范围和种群数量不断扩大,入侵和扩散形势非常严峻,埃及伊蚊已经成为了云南省的一个重要外来入侵蚊种。而且,与云南省接壤的越南、缅甸和老挝等国家均有埃及伊蚊且登革热频发,埃及伊蚊的入侵则加重了云南省登革热暴发和流行的风险。但是,目前对我国云南省的埃及伊蚊研究大多仅限于分布调查层面上,对于其种群遗传分化及特征、抗药性水平及机制等方面缺乏深入研究。
  基于以上原因,本研究以云南省埃及伊蚊为研究对象,通过现场采集云南省不同地区的埃及伊蚊自然种群,主要从两个方面予以深入研究。一是提取基因组DNA,综合利用微卫星DNA标记和线粒体DNA基因COI、ND4、ND5进行种群遗传特征研究,以期了解和掌握云南省埃及伊蚊种群遗传多样性和遗传结构特征,并对其种群结构和入侵事件予以探讨;二是将现场采集的埃及伊蚊进行实验室传代养殖后,通过蚊虫抗药性生物学测定、代谢酶活性以及靶标基因的检测,掌握云南省埃及伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平和抗药性分子特征,为化学杀虫剂防治埃及伊蚊提供科学依据。
  本研究结果如下:
  1、微卫星研究结果
  本研究通过文献查找,筛选获得的9个微卫星位点容易扩增且稳定性好、差异性明显、多态信息含量高(PIC=0.392~0.886)。结果表明所选用的9个微卫星位点能够充分满足本研究的需要,每个种群的样本采集量能够满足研究的样本含量需求。9个微卫星位点从28个埃及伊蚊自然种群中共获得等位基因数114个,平均每个位点获得等位基因数12.67个。从位点角度分析看,每个位点平均在每个种群获得的等位基因在3.46~7.14之间。各种群的基因丰富度在3.34~5.72之间,瑞丽和景洪两地埃及伊蚊的种群基因丰富度较为接近,且均高于2016年在其他边境地区采集的埃及伊蚊种群。
  云南省埃及伊蚊种群总体上具有较高的遗传多样性,9个微卫星位点的观察杂合度在0.108~0.939之间,平均观察杂合度为0.579;而期望杂合度在0.367~0.760之间,平均期望杂合度为0.592。各种群的观察杂合度在0.401~0.689之间,其中2016年在其他边境地区采集的8个种群观察杂合度高于期望杂合度,瑞丽和景洪地区采集的20个种群均为观察杂合度低于期望杂合度。
  基因型连锁不平衡分析显示云南28个埃及伊蚊自然种群的9个位点之间的1008对位点中,有166对位点存在着显著的连锁情况(P<0.05),其他位点均表现为独立遗传(P>0.05)。
  哈迪温伯格平衡检验显示28个种群中仅有景洪(GLR)、勐海(M1H)2个种群发生了哈温平衡偏离。采用TPM和SMM两种模式检测云南埃及伊蚊种群近期是否经历遗传瓶颈效应,结果显示共有10个自然种群产生了瓶颈效应,其中瑞丽地区采集的10个种群中有6个(MNL、JDL、JGH、JCG、GMG、CXT)种群产生了瓶颈效应,占瑞丽地区种群的60%;2016年在其他边境地区采集的8个自然种群中有4个产生了瓶颈效应,占50%;而景洪地区采集的10个种群均没有产生瓶颈效应。
  近交系数结果显示2016年在其他边境地区采集的8个种群中有7个种群的近交系数均为负数,表示这7个种群近交程度很低,而其他种群的近交系数为正值,意味着这些种群存在不同程度的近交。
  成对固定指数(FST)分析显示,各种群间仅有17个成对固定指数(FST)未表现出明显的遗传分化,其余361个成对固定指数(FST)均表现出明显的遗传分化。
  应用STRUCTRUE软件对各个个体的聚类分析,结合群体内遗传差异数据,结果显示当K=3时,将云南省不同地区的28个埃及伊蚊种群分为3类较为合理,瑞丽地区采集的10个种群、景洪地区采集的10个种群以及2016年在其他边境地区采集8个种群各聚成1类。基于Nei’s标准遗传距离应用UPGMA构建系统发育树与PCoA图谱分析也显示同样的结果。
  分子方差分析(AMOVA)表明不同组之间存在明显的分化,占14.51%;同一区域内不同种群之间的遗传分化占总的6.01%;来自个体之间的遗传分化最为显著,占77.76%。相关性分析显示地理距离和遗传分化之间呈现正相关(r=0.4948,P<0.0001)。
  综合分析判断,2002年发现的瑞丽入侵和2013年发现的景洪入侵应为不同的入侵事件,而2016年采集的其他边境地区仍然存在着持续的多点入侵。
  2、线粒体DNA研究结果
  本研究分析了云南省瑞丽和景洪地区20个不同的埃及伊蚊地理种群的线粒体基因CO I、ND4和ND5的基因多样性指数,结果显示CO I基因A+T的含量为66.9%,共获得381个多态性位点,多态性位点占碱基总数的45.36%(其中包括66个自裔位点和315个简约信息位点),共获得单倍型14种,总群体核苷酸多样性指数为0.02265、单倍型多样性指数为0.5583。ND4基因A+T的含量为70.0%,共获得334个多态性位点,多态性位点占碱基总数的55.76%(其中包括126个自裔位点和191个简约信息位点),共获得单倍型18个,总群体核苷酸多样性指数为0.01860、基因单倍型多样性指数为0.47156。ND5基因A+T的含量为74.6%,共获得369个多态性位点,多态性位点占碱基总数的60.89%(其中包括109个自裔位点和254个简约信息位点),共获得单倍型5种,总群体核苷酸多样性指数为0.07223、单倍型多样性指数为0.5098。由于ND5基因片段的单倍型较少(仅5种),本研究仅利用COI和ND4对瑞丽和景洪地区的20个埃及伊蚊地理种群进行了遗传分化和遗传结构研究。
  基于COI基因的遗传分化结果显示景洪的GGH种群与瑞丽的MNL、BFC、HDH、BNS等4个种群遗传分化不显著,反而与景洪地区的GXS、JBQ、YSC、DMY、GSZ、NKH等5个种群间具有明显的遗传分化。而基于ND4基因的遗传分化结果显示瑞丽的HDH种群与景洪的LJY、JBQ、YSC三个种群间不存在明显的遗传分化,更有意思的是,该种群与瑞丽地区其他9个种群具有明显的遗传分化。说明瑞丽和景洪地区的埃及伊蚊种群间可能存在着相互交流。基于CO I和ND4基因的遗传分化结果均显示,景洪地区各种群间遗传分化水平明显低于瑞丽地区各种群间的遗传分化。这一结果与微卫星研究的结果相似。
  线粒体COI和ND4基因单倍型虽然能够被网络图分布格局与NJ进化树分化为2个分支,但结合各单倍型的地理种群分布,无法进行非常清楚地分支。Tajima’SD和 Fu’sFS中性检验出现了显著的负值,核苷酸错配分布显示分布曲线均呈单峰结构形式,这些结果都说明这些地区的埃及伊蚊经历了明显的种群扩张。
  3、抗药性生物学测定结果
  以实验室养殖的云南埃及伊蚊敏感株为参照,采用敏感基线法对幼虫进行生物学测定,三种杀虫剂的毒力以残杀威最低(LC50=1.02882mg/L,95%CI:0.97708~1.08173 mg/L), 其次为敌敌畏(LC50=0.0367 mg/L,95%CI:0.03580~0.03770 mg/L),高效氯氰菊酯毒力最高(LC50=0.00102 mg/L,95%CI:0.00088~0.00118 mg/L)。对2016年在云南省西双版纳傣族自治州和德宏州采集的12个埃及伊蚊自然种群幼虫的生物学测定结果显示,对高效氯氰菊酯的抗性倍数在11.31~41.56之间,而对敌敌畏和残杀威虽然抗性水平略有升高,尚未达到抗性种群的标准。通过敏感基线法获得云南埃及伊蚊敏感株的对三种杀虫剂的成蚊诊断剂量分别为残杀威983.41 mg/L、敌敌畏181.95 mg/L、高效氯氰菊酯1493.37mg/L。以诊断剂量法对各自然种群埃及伊蚊成蚊进行生物学测定,成蚊生物学测定结果也显示只对高效氯氰菊酯产生了抗药性,成蚊生测结果与幼虫生测结果基本一致。
  4、代谢解毒酶活性检测结果
  本研究采用WHO推荐的生物化学测定法检测了云南埃及伊蚊各自然种群的代谢解毒酶活性,结果显示:各野外种群在受到残杀威抑制作用后,ACHE活性为未受抑制作用的22.36-31.60%之间,其中仅有J-3和J-5略高于30%;以α-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(1-N)活性均值为111.1717±34.9588 nmole of1-naphthol/min/mg protein,而野外种群的EST(1-N)活性均值在41.7940 nmole of1-naphthol/min/mg protein~198.5297 nmole of1-naphthol/min/mg protein之间;以β-Naphthyl Acetate为底物检测得到敏感株EST(2-N)活性为135.4011±47.3301 nmole of2-naphthol/min/mg protein,野外种群的EST(2-N)活性在39.7117 nmole of2-naphthol/min/mg protein~214.0106 nmole of2-naphthol/min/mg protein之间;敏感株MFO活性为3.08±3.77nmol cytochrome C/mg protein,野外种群的MFO活性在5.43 nmol cytochrome C/mg protein~20.11 nmol cytochrome C/mg protein之间,与敏感株相比,野外种群的MFO活性均高于敏感种群;敏感株GST活性为1.2504±0.3961 nmol of CDNB/min/mg protein,野外种群的GST活性在0.6178 nmol of CDNB/min/mg protein~3.4939 nmol of CDNB/min/mg protein之间。上述结果中仅有MFO在所有野外种群中的酶活性升高,而其他代谢酶在不同种群中的表现不一,这一结果提示云南埃及伊蚊对高效氯氰菊酯的抗药性可能主要与MFO酶活性升高有关。对于酶活性水平与生物学测定之间结果差异的原因有待进一步研究。
  5、靶标抗性检测结果
  本研究发现云南埃及伊蚊野外株钠离子通道氨基酸序列第1534位点的氨基酸突变,由F突变为C,相对应的碱基TTC突变为TGC,未发现其他突变位点。相关性分析发现这个点的突变仅与对杀虫剂高效氯氰菊酯抗药性成正相关,未发现与对残杀威和敌敌畏抗药性有关。
[硕士论文] 罗嫚
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究家蝇幼虫围食膜蛋白 MdPM-17分子特点及生物学特性。
  方法:
  用RT-PCR方法从家蝇cDNA中获取MdPM-17基因,运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白序列进行预测和分析;构建原核表达质粒pET-32a(+)-MdPM-17,在大肠杆菌Transetta(DE3)中诱导表达并进行纯化,纯化产物经免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;利用几丁质结合实验检测重组蛋白的几丁质结合特性。对家蝇幼虫MdPM-17基因进行RNA干扰,探索最佳干扰时间及效果,通过实时荧光 PCR方法检测防御素 defensin、天蚕素 cecropins、双翅肽diptericin等抗菌肽基因的表达变化情况,研究MdPM-17基因干扰后抗微生物感染反应。
  结果:
  成功克隆MdPM-17基因,MdPM-17基因全长635 bp,其ORF长477 bp,编码158个氨基酸,理论分子量为17 kDa,等电点为4.55,蛋白质的N端含有一段信号肽,结构预测分析显示其包含几丁质Ⅱ型结构域。RT-PCR检测显示MdPM-17在家蝇幼虫脂肪体、前肠、中肠、气管以及马氏管中均有表达,其中在中肠的表达量最高。双酶切及SDS-PAGE电泳结果表明成功构建了pET-32a(+)-MdPM-17重组质粒并表达目的重组蛋白。几丁质结合实验表明MdPM-17蛋白具有几丁质结合活性,并只能够被强变性剂6M尿素洗脱,属于PM第三类蛋白。RNA干扰家蝇 MdPM-17基因,结果显示在注射 MdPM-17 dsRNA后24 h达到有效沉默,MdPM-17基因沉默后家蝇幼虫的存活率及化蛹率降低。RNA干扰MdPM-17基因后,抗菌肽基因(defensin、cecropins、diptericin)的表达均较对照组升高;微生物感染后抗菌肽基因的表达各有差异,大肠杆菌感染时,cecropins、diptericin的表达较对照组高;金黄色葡萄球菌感染时,defensin、cecropins、diptericin的表达较对照组高;白假丝酵母菌感染时,diptericin的表达较对照组高。
  结论:
  成功构建pET-32a(+)-MdPM-17重组质粒并获得纯化重组蛋白。MdPM-17具有几丁质结合活性,属于第三类围食膜蛋白。MdPM-17基因在家蝇幼虫的中肠组织表达量最高;RNA干扰后MdPM-17基因在24 h时达到有效沉默,并且使抗菌肽基因的表达升高。微生物感染后MdPM-17 RNAi组的抗菌肽基因的表达各有不同程度的代偿性上调,表明MdPM-17在家蝇幼虫肠道免疫调控中发挥重要作用。
[硕士论文] 焦梦涵
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  克隆、表达猬迭宫绦虫27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Protease,CP)基因,优化原核表达条件,并应用免疫荧光技术检测27kDa-CP在成虫、裂头蚴不同组织中的分布情况。
  方法:
  ①根据NCBI中公布的猬裂头蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶基因序列(27kDa-CP,D63670),提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Transetta(DE3)中,观察在不同培养时间、不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及不同培养温度条件下27kDa-CP重组蛋白的表达情况。用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白,表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析。②用纯化后的重组27kDa-CP蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体(一抗),用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG作为二抗,对27kDa-CP在猬迭宫绦虫成虫、裂头蚴组织中的位置分布进行免疫荧光定位。
  结果:
  ①pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经 IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌 Transetta(DE3)中成功表达,最适表达条件为:培养温度30℃,IPTG浓度为0.3mmol/L,培养时间为18h。重组蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后测得其浓度为0.2 mg/mL。②纯化后的重组蛋白经Western Blotting检测,其相对分子质量大小(Mr)约为35kDa,与预期大小相符,且能被重组蛋白免疫小鼠血清识别。③免疫荧光定位显示27kDa-CP在裂头蚴皮层及排泄管中呈高度表达;在成虫中,以节片(孕节和成节)子宫内虫卵卵壳的表达最强,其次为排泄管道及皮层。
  结论:
  ①成功构建了猬迭宫绦虫27kDa-CP基因原核表达体系,通过表达条件的优化,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中27kDa-CP重组蛋白可获得高效表达。②通过免疫荧光技术组织定位初步提示27kDa-CP可能参与了虫体的入侵、移行、营养吸收、排泄、免疫逃避、生长发育及生殖等过程。
[硕士论文] 吕清巧
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  获取白纹伊蚊ADGF-B(Ab-ADGF-B)活性蛋白,探讨其可能的生物学功能。
  方法:
  从 NCBI数据库中下载白纹伊蚊 Ab-ADGF-B基因 ORF序列(GenBank No. AAV90660),对基因序列进行生物信息学分析;将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,将测序正确的重组质粒pET32a(+) Ab-ADGF-B(rAb-ADGF-B)转化入表达菌Rosetta-gamiB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并用SDS-PAGE和免疫印迹(western blotting)鉴定。用Ni-NTA亲和层析柱纯化rAb-ADGF-B蛋白后制备抗血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测抗体效价。采用分光光度法检测rAb-ADGF-B蛋白的ADA酶催化活性;同时采用细胞计数法检测 rAb-ADGF-B对小鼠巨噬细胞(ANA)的增殖作用;最后检测rAb-ADGF-B对人全血部分凝血酶原时间(prothrombin time,PT),凝血酶时间(thrombin time,TT)及凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的影响。
  结果:
  1.成功构建rAb-ADGF-B重组质粒;测序结果显示:成熟肽基因长1545 bp,编码514个氨基酸;结构域预测显示具有1个ADGF结构域。在20℃、150rpm的条件下经0.4 mM的IPTG诱导24 h获得可溶性rAb-ADGF-B蛋白。获得兔抗rAb-ADGF-B多克隆抗体,效价为1:10000。Western blotting证实获取的重组蛋白是目的蛋白。在30℃,pH7.0条件下,0.67μM rAb-ADGF-B可以催化100μM腺苷生成肌苷;同时,0.134μM rAb-ADGF-B蛋白和 ANA细胞共培养36 h后,细胞数量约由5×104增加到14×105。此外,2.67μM rAb-ADGF-B作用下,PT、TT和APTT分别为13.33S、15.23S、和35S,无延时效应。
  结论:
  成功获取白纹伊蚊唾液腺源rAb-ADGF-B可溶性蛋白,该蛋白具有ADA酶活性,对小鼠巨噬细胞增殖有影响。
[硕士论文] 许士刚
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  采用蛋白质组学技术和方法研究亚洲带绦虫实验感染乳猪后15 d、75 d幼虫寄生处肝脏组织与对照组肝组织的蛋白质表达差异,为进一步研究亚洲带绦虫感染致乳猪肝损伤的分子机制提供基础资料。
  方法:
  1.绦虫标本采集及虫卵收集:将采自贵州省都匀市良亩乡的亚洲带绦虫孕节解剖后,以生理盐水反复清洗并离心收集虫卵。2.乳猪实验动物模型的建立及肝脏样本采集:20日龄约克施格杂交乳猪12头随机分为实验组和对照组各6头,实验组以定量虫卵15万个/头灌胃感染。于感染后第15 d和第75 d解剖乳猪,取实验组囊尾蚴寄生处肝组织和对照组对应部位肝组织。3.iTRAQ技术检测分析实验组和对照组乳猪肝脏的差异蛋白表达:主要步骤:蛋白质制备、酶解和肽段定量、肽段标记、液相色谱-串联质谱分析、Mascot软件查库鉴定及定量分析和生物信息学分析。4.部分差异蛋白的验证:运用实时荧光定量 PCR、免疫印迹方法和免疫组织化学技术对部分差异蛋白进行进一步验证。
  结果:
  1.根据一般形态学特征和分子生物学鉴定结果,证实2条都匀采集的带绦虫为亚洲带绦虫。2.实验组6头乳猪均感染了亚洲带绦虫囊尾蚴,感染率为100%。囊尾蚴只存在于乳猪肝脏,其它组织未检获。3. iTRAQ分析结果显示感染后第15 d实验组与对照组比较共有187个蛋白质(92个未知)有显著差异;感染后第75 d实验组与对照组比较共有158个蛋白质(72个未知)有显著差异。4.验证结果显示感染后第15 d,实验组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartyl proteinase3,Caspase-3)mRNA和蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01),感染后第75 d,实验组Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平较对照组无明显变化(P>0.05);感染后第15 d和75 d,实验组膜联蛋白A5(Annexin A5,Anxa5)和甲硫氨酰氨肽酶2(Methionine aminopeptidase2,Metap2)mRNA和蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05,P<0.01),而实验组细胞色素P4501A1(CytochromeP4501A1,Cyp1a1)mRNA和蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01);免疫组化结果显示 Caspase-3、Anxa5阳性染色主要定位在肝细胞胞质中,呈黄色或棕黄色。
  结论:
  1. iTRAQ技术检测到了亚洲带绦虫实验感染乳猪肝脏的大量差异蛋白表达,为进一步研究亚洲带绦虫致中间宿主乳猪肝损伤的分子机制提供了基础资料。2.目标蛋白的验证结果提示Caspase-3可能参与了亚洲带绦虫感染乳猪15 d肝损伤的调节,而Cyp1a1、Anxa5和Metap2可能参与了亚洲带绦虫感染乳猪15 d和75 d肝损伤的调节。
[硕士论文] 杨尉锦
病原生物学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  从家蝇cDNA文库中筛选获得家蝇14-3-3δ(MD14-3-3δ)基因序列,对该序列及其编码蛋白进行分子特性分析,原核表达,初步探讨重组蛋白的抗菌活性及抗菌机制;检测MD14-3-3δ基因在家蝇生活史中各龄期及3龄幼虫不同组织部位时空表达模式,初步探讨经大肠埃希菌诱导后,基因表达谱的变化,为进一步探讨其功能提供实验依据。
  方法:
  1、序列分析:采用生物信息学相关软件,对家蝇14-3-3δ基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构等进行分析,预测蛋白质功能。2、cDNA克隆及原核表达:根据MD14-3-3δ的cDNA序列设计引物,PCR扩增,构建pET-28a(+)-MD14-3-3δ重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物的可溶性,通过镍柱纯化重组蛋白。3、Western blot及质谱鉴定:将纯化的MD14-3-3δ蛋白免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗体,Western blot鉴定重组蛋白;切下纯化蛋白的SDS-PAGE条带,送公司进行质谱分析鉴定。4、重组MD14-3-3δ蛋白的抗菌活性检测及抗菌功能初探:采用微量液体稀释法,以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,检测重组蛋白的抗菌活性;细胞内膜渗透性实验检测MD14-3-3δ对大肠埃希菌细胞膜通透性的影响。5、MD14-3-3δ基因时空表达模式的研究:1)收集家蝇生活史各发育阶段(卵、各龄期、蛹、成虫)的虫体及3龄幼虫不同组织(体壁、脂肪体、马氏管、中肠、唾液腺、气管),分别提取总RNA后并逆转录为cDNA,以家蝇RPS18为内参基因,对不同样本的MD14-3-3δ基因表达情况进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测,所有实验进行3个生物重复,每个样本重复实验3次。2)大肠埃希菌诱导后MD14-3-3δ基因时空表达谱的变化:采用显微注射的方法将细菌注入家蝇2龄晚期幼虫,分别收集诱导后3h、6h、12h、24h、36h、48h虫体,qPCR检测不同时间点MD14-3-3δ基因表达水平的变化,以注射PBS组为对照。
  结果:
  1、MD14-3-3δ基因ORF全长771 bp,编码257个氨基酸,理论分子量29.35 kD;等电点4.87,属于亲水性的酸性蛋白,含有多种酶的结合位点,有14-3-3家族结构域和活性位点,定位于细胞核中,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。2、成功构建MD14-3-3δ原核表达载体,IPTG诱导后,上清可溶表达重组蛋白,经镍柱纯化,获得纯化的MD14-3-3δ重组蛋白。3、Western blot结果显示,得到与预计条带大小相符的清晰条带;质谱分析显示,重组蛋白序列与MD14-3-3δ序列一致。4、体外抗菌试验结果:MD14-3-3δ蛋白对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用,MIC(minimal inhibitory concentration)值分别为0.16 mg/mL、0.25 mg/mL。细胞内膜渗透性实验显示,随着MD14-3-3δ作用时间的延长,A430nm值从0.1左右上升至0.7,随着时间的延长而增加。5、时空表达模式研究:1)在不同发育时期,以卵期为参照,该基因在成虫中表达量最高,表达量为成虫>2龄幼虫>蛹>1龄幼虫>3龄幼虫>卵,成虫比卵期上调了141.773倍(P<0.05),2龄幼虫则上调了79.7967倍(P<0.05);在3龄幼虫不同组织中,该基因在体壁表达量最高,其次为气管(P<0.05)和唾液腺(P<0.01)。2)注射感染大肠埃希菌后,以PBS组为对照进行计算,表明注射感染大肠埃希菌后3 h,MD14-3-3δ基因出现明显的上调,上调了14.704倍(P<0.05),其次为24 h,上调了2.503倍。36 h、48 h为下调趋势(P<0.01)。
  结论:
  1、本研究对家蝇14-3-3δ基因进行了分子特性分析,体外克隆、表达,获得并鉴定了MD14-3-3δ重组蛋白;该重组蛋白在体外对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌均有抗菌效果,对大肠埃希菌抗菌活性较好;并能改变其细胞内膜的通透性。2、MD14-3-3δ基因在家蝇不同生长时期及3龄幼虫不同组织中均有表达,经大肠埃希菌诱导后,该基因的表达量在3h出现了明显的上调,提示该基因参与了家蝇的免疫防御过程。
[硕士论文] 王楠楠
病原生物学 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  原核表达和鉴定刚地弓形虫致密颗粒蛋白5(GRA5),以期获得大量与天然抗原活性相似的弓形虫重组 GRA5蛋白抗原,将获得的重组蛋白进行纯化,应用纯化的GRA5重组蛋白抗原包被在96孔板上,建立ELISA法检测弓形虫感染。
  方法:
  从GenBank中查到弓形虫GRA5基因序列,根据基因序列设计合成一对引物,用RT-PCR方法将GRA5基因扩增,构建pET28a-GRA5原核表达载体,双核酸内酶切及序列测定进行鉴定, IPTG诱导 pET28a-GRA5转化的 BL21/DE3菌, SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物并鉴定弓形虫GRA5是否表达。建立以纯化的重组蛋白的间接ELISA法,检测收集样本血清中弓形虫特异性抗体。
  结果:
  成功构建刚地弓形虫GRA5基因原核表达质粒,PCR反应扩增出为363 bp大小的GRA5基因,所构建的pET28a-GRA5原核表达载体经双酶切显示插入片段大小与上相符,DNA测序结果表明与GenBank中录入的GRA5基因经Blast比对序列同源性100%,原核细胞表达的该重组蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有显示(约14 ku)。将重组GRA5蛋白作为抗原包被在96孔板中,建立了检测弓形虫感染的ELISA方法,ELISA法经过优化后最终确定:最佳抗原包被浓度为10ug/ml、最佳条件为在37℃作用2h后,在4℃包被过夜、弓形虫血清最佳稀释度为1:25,最佳封闭条件为用5%脱脂奶粉在37℃作用2h,二抗最佳工作浓度为1:20000,底物的最佳反应时间为20min。本实验建立的ELISA法检测的100例弓形虫感染病人(血清学阳性)血清中有73例呈阳性,阳性率为73%(73/100),其中40例IgG阳性标本的阳性率为72.5%(29/40),30例IgM阳性标本的阳性率为53.3%(16/30),30例IgG、IgM均阳性标本的阳性率为93.3%(28/30),30例阴性血清标本的阳性率仅为6.7%(2/30)
[博士论文] 魏海霞
病原生物学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:弓形虫是一种机会性致病原虫,人和其他温血动物均可通过多种途径被感染。弓形虫入侵宿主细胞的过程主要包括粘附细胞膜,纳虫泡(PV)的形成等。中间宿主感染后,弓形虫可实现速殖子向缓殖子的转化,形成慢性感染;当宿主免疫力低下时,缓殖子则会向速殖子转化,引起急性发病。目前关于弓形虫入侵及速、缓殖子相互转化机制尚不完全清楚。
  目的:宿主Rac1在细胞骨架重组中扮演着重要的角色,以往研究发现弓形虫入侵宿主细胞过程中Rac1在纳虫泡膜(PVM)上存在聚集现象。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,主要参与物种表型的可塑性和适应性。本研究着重探讨弓形虫入侵转化过程中宿主Rac1及虫体DNA甲基化的作用。
  方法:Rac1抑制剂(NSC23766)处理HFF细胞后用RH-GHP-SAG1株弓形虫感染细胞,观察统计弓形虫入侵效率。抑制剂处理细胞后观察宿主actin在弓形虫感染时的重排现象。宿主Rac1与弓形虫ROP2共定位现象观察。COS-7细胞中过表达CFP-Rac1-WT后感染弓形虫,在不同的时间点统计Rac1阳性PVs。Western blot检测弓形虫感染后不同时间点Rac1磷酸化水平变化。NSC23766处理细胞后观察抑制剂对弓形虫增殖的影响。
  检测核蛋白DNA甲基转移酶(DNMT)活性。体外克隆表达弓形虫DNMT基因Tgdnmta和Tgdnmtb,纯化重组表达的TgDNMTa和TgDNMTb并进行DNMT活性检测。qPCR检测两个基因在速、缓殖子的表达水平。弓形虫速、缓殖子全基因组DNA甲基化高通量亚硫酸氢盐测序。特定位点测序结果验证。差异甲基化基因的生物信息学分析。DNMT抑制剂(5-AzaC)处理弓形虫后,观察5-AzaC对其入侵增殖的影响。构建弓形虫DNMTs敲除虫株。
  结果:NSC23766处理细胞后弓形虫的入侵效率显著低于正常组(p<0.05)。正常细胞感染弓形虫时细胞骨架重组更活跃。宿主Rac1与弓形虫ROP2在PVM上共定位。弓形虫一旦开始入侵便会招募Rac1向PVM聚集,随着入侵时间的延长,Rac1会从PVM上消失。宿主细胞Rac1磷酸化水平随着弓形虫感染时间的增加(0-6小时)而增强。长期用NSC23766处理细胞会抑制弓形虫在PV增殖(p<0.05)。
  弓形虫存在两个DNMT蛋白:TgDNMTa和TgDNMTb。重组表达的TgDNMTa和TgDNMTb蛋白均具有DNMT活性,两个基因在缓殖子转录水平均高于速殖子。缓殖子甲基化位点多于速殖子。速、缓殖子存在差异DNA甲基化的基因主要参与一些基础的能量代谢过程并且和寄生虫抵抗宿主免疫等密切相关。5-AzaC处理弓形虫能够抑制弓形虫DNA甲基化的发生,进而抑制速殖子在PV增殖(p<0.05)。
  结论:Rac1调节宿主细胞骨架重组从而有利于弓形虫入侵。弓形虫基因组存在DNA甲基化现象,且缓殖子甲基化水平高于速殖子,DNA甲基化有可能在弓形虫速、缓殖子相互转化过程中起作用。
[博士论文] 褚宏亮
病原生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis,JE),简称乙脑,是一种重要的蚊媒传染病,其传播媒介主要是三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus),病原体是日本脑炎病毒(Japanese Encephatlitis virus,JEV),主要感染儿童和青少年,病死率可达10%以上,一半以上的幸存者会留下神经系统缺陷,是人类健康的严重威胁。另外,乙脑病毒也容易造成受感染的母猪流产或畸胎,对养殖业危害巨大。
  为阐明三带喙库蚊种群特征及感染流行性乙型脑炎病毒特点,从而科学有效地防控流行性乙型脑炎,本研究主要从生态学和分子生物学、群体遗传学等角度开展了三方面研究:
  1.流行性乙型脑炎主要媒介三带喙库蚊种群分布特征研究。
  在江苏省长江入海口两岸选择启东市和太仓市作为调查地点,调查以鸡、猪为诱饵的蚊虫种类构成和三带喙库蚊种群数量季节变化,同时调查三带喙库蚊在农村猪圈、民居和草地等生态环境的种群分布。通过收集江苏省病媒生物监测网络中2009年-2015年蚊虫监测数据,对三带喙库蚊在城市城区范围内公园、居民区和医院不同生境分布和动态变化进行了分析。
  研究结果发现,三带喙库蚊以叮吸猪等家畜类血液为主,主要分布于猪圈、牛棚等生境,其次是民居,在江苏每年从5月开始出现,然后密度逐渐升高,7-8月达到密度高峰,随后密度逐渐下降,10月基本监测不到该蚊种。基于鸡为诱饵的三带喙库蚊种群数量较少,在江苏主要出现在6-8月。研究同时发现,至少从2009年开始,三带喙库蚊已经在江苏各市的城区范围内出现,主要分布于公园,居民区和医院等场所分布相对较少,高峰主要出现在8月,这可能是由于农村生态环境和经济模式改变造成生存压力所致。
  2.三带喙库蚊线粒体DNA和微卫星特征分析。
  采集三带喙库蚊标本,提取基因组DNA,对线粒体全长进行测序。从GenBank检索下载5属33种蚊虫线粒体全长和COⅠ基因序列,与三带喙库蚊相应序列构成数据,探讨线粒体DNA全长用于三带喙库蚊分子分类鉴定的可行性和优势。本研究系首次对三带喙库蚊线粒体全长进行了测序。通过构建进化树,对线粒体全长和COⅠ基因用于三带喙库蚊分子分类鉴定进行了研究,发现线粒体基因组全长可以用于三带喙库蚊分子分类鉴定,由于序列更长,含有更丰富的生物信息,相对于线粒体上COⅠ基因可以更细致的对蚊虫种类进行区分。
  采集16个地理种群的三带喙库蚊,每个地理种群挑选5-6只蚊虫,每只蚊虫作为一个样本提取DNA,设计引物扩增线粒体ND4和ND5基因。分析发现,ND5基因比ND4基因拥有更高比例的多态性位点和更多的单倍型数,相对更适合做种群进化分析的分子标记。三带喙库蚊ND4和ND5单倍型与地理位置无明显对应关系,种群间分化程度小。
  采集20个地理种群的三带喙库蚊,每个地理种群挑选30只蚊虫,每只蚊虫作为一个样本提取DNA,设计引物筛选出10个微卫星DNA位点。PCR扩增后对微卫星 DNA数据进行种群遗传学分析。结果表明,本研究中单地点30次重复采样能够代表对应地理种群的整体情况,20个地理种群的观察杂合度均低于预期杂合度,种群近交系数基本在0.1以上,10个位点群体间近交系数(0.141)大于群体内近交系数(0.006),10个微卫星位点的基因流平均值为10.4703,64.7%的种群间成对固定指数Fst未表现出明显的遗传分化,这些参数结果表明三带喙库蚊种群间近交明显,基因交流频繁。
  3.三带喙库蚊和宿主携带流行性乙型脑炎病毒和病毒基因组特征分析。
  2015-2016年在江苏省4个城市9个地点的猪圈中以诱蚊灯法采集三带喙库蚊,其中连云港小高庄和新滩村在2015年和2016年分别在同一地点进行了2次采集,其余地点均为2016年采集。以50只蚊虫为一组,提取RNA,设计引物,RT-PCR法扩增乙脑病毒核酸。结果显示,乙脑病毒在三带喙库蚊中的感染比例较高,本研究中,阳性样本份数比例基本在10%以上,近一半在50%以上,最高为泰州张家院村,达到了80%。最小感染率(IR)也有近一半在10%以上,最高为16.00‰,而最大似然估计值(MLE)比相应的最小感染率值都大,感染情况越严重,两者的误差越大。
  2014年在江苏省分别采集小苇鹣、小白鹭和池鹭血清样本13、12和2份,提取核酸后进行PCR扩增,未检测出乙脑病毒。2014年3-10月,每月在启东和太仓分别采集幼猪和母猪血清标本,以ELISA法检测抗乙脑病毒IgG抗体,以乳胶凝集法检测IgM抗体,结果发现猪对乙脑病毒IgM和IgG抗体自6月开始升高,7-8月达到高峰,9月开始逐渐下降。将抗体阳性的血清标本提取核酸检测乙脑病毒,未发现阳性。2014年4-9月,每月在屠宰场采集猪脑,提取核酸检测乙脑病毒,结果在228份猪脑中均未检出乙脑病毒核酸。
  从三带喙库蚊每个地理种群乙脑病毒检测阳性的标本中挑选1-2份对乙脑病毒E基因进行测序。2015-2016年共获得17株乙脑病毒的E基因序列,其中2015年从连云港3地的三带喙库蚊中获得4株乙脑病毒E基因序列,2016年从宿迁、南京、泰州和连云港的三带喙库蚊中获得12株乙脑病毒的 E基因序列,从泰州张家院十四组的中华按蚊中获得1株乙脑病毒的E基因序列。根据E基因序列构建进化树进行基因分型,17株乙脑病毒在基因型上均属于GⅠ-b型,氨基酸序列与减毒疫苗株SA14-14-2比较,抗原关键位点E332、E304和E335相同。17株乙脑病毒毒力关键位点E138和E176相同,但与SA14-14-2株不同,表明17株乙脑病毒与SA14-14-2株抗原性相似,但毒力可能强于SA14-14-2,这表明基于SA14-14-2的乙脑疫苗目前在江苏省内仍然有效,但需要进一步加强乙脑病毒的监测。
  本研究中2015年和2016年在同一地点检测到的乙脑病毒E基因核酸和氨基酸序列有完全相同的情况,而在南京、宿迁和泰州分别检测到E基因核酸和氨基酸序列完全相同的的乙脑病毒,这可能是候鸟等水禽迁徙带入或三带喙库蚊迁飞带入所致。
[硕士论文] 周昊
法医学 贵州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察贵阳地区夏季瘦叶带绿蝇(Hemipyrellia ligurriens)、厩腐蝇(Muscina stabulans)、台湾别麻蝇(Boettcherisca formosensis)在室内自然条件下生活史与积温的关系;探讨棕尾别麻蝇(Boettcherisca peregrine)蛹3个不同发育时间转录组的差异表达,为进一步探究棕尾别麻蝇蛹各个时间转录组中的差异基因提供实验数据。
  方法:
  1.于贵州医科大学和贵州警官职业学院两地,分别放置家兔尸体诱捕台湾别麻蝇、厩腐蝇、瘦叶带绿蝇3种嗜尸性蝇类进行饲养直至产卵,观察3种嗜尸性蝇类在贵阳地区夏季自然条件下各发育阶段的历期并记录温、湿度。2.于贵州医科大学室外放置实验用家兔尸体,采集棕尾别麻蝇进行人工饲养。待其产下幼虫至化蛹后,每24 h收集一次蝇蛹,每次2粒,直至羽化出成虫,选取第1、5、10天收集的蝇蛹,提取总RNA测序进行文库构建,使用软件edgeR对基因差异表达进行分析,筛选差异基因做实时荧光定量验证,对已知基因(Unigene)进行京都数据库(KEGG)代谢通路分析,使用MISA对Unigene进行简单重复序列(SSR)检测。
  结果:
  1.台湾别麻蝇6月、7月、8月发育历期为17.00d、15.19d、15.7d;厩腐蝇6月、7月发育历期为16.13d、13.9d;瘦叶带绿蝇7月发育历为13.06d。其中厩腐蝇与瘦叶带绿蝇在7月发育历期相似;厩腐蝇6月、7月发育历期时间和台湾别麻蝇6月与7月、8月发育历期有差异。统计出3种嗜尸性蝇类的发育总历期和积温的基础数据。2.获得各分组样品基因组表达水平,共捕获38727条Unigenes,将不同时间的蝇蛹转录组结果构建数据库进行两两比较,差异基因总数为5283,将差异表达基因进行可视化散点图和火山图构建以及模式聚类构建,对差异基因GO分类统计和富集分析并将差异性明显的酪氨酸羟化酶(TH)基因与CBM-14基因筛选出来做实时荧光定量与测序结果一致。棕尾别麻蝇蛹转录组共有8856个 Unigene被注释,被注释的代谢通路有336个。SSR查找发现,从Unigene中共查找到SSR位点占总比例的22.32%。其中,单核苷酸重复所占比例最高,其次是三核苷酸重复。SSR不同重复基元类型中,出现频率最高的为A/T,其次是AAC/GTT,AC/GT。
  结论:
  1.厩腐蝇、台湾别麻蝇、瘦叶带绿蝇的发育历期与温度变化有关,并获得三种嗜尸性蝇类的生活史数据。2.构建贵阳地区棕尾别麻蝇蛹3个不同发育时间的转录组数据库,用于寻找差异基因。3.TH基因与CBM-14基因在棕尾别麻蝇蛹的三个不同发育时间表达有显著差异。
[硕士论文] 刘园
病原生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,呈世界性分布,可感染包括人和牲畜在内的所有温血动物,引起人兽共患病的弓形虫病,严重威胁人类健康和畜牧业发展。目前,尚无理想的药物用来防治弓形虫病。因此,深入研究弓形虫的致病机制,寻找新的防治弓形虫病的药物或疫苗显得尤为重要。Exosomes是有核细胞分泌到细胞外环境的膜性小囊泡,直径在30-100 nm之间。其中病原体分泌的exosomes具有一些特殊的生物学功能,如介导病原体与宿主的信息交流、调节宿主免疫应答等。然而,弓形虫是否产生并分泌exosomes尚不清晰。
  研究目的:从弓形虫RH株和ME49株的速殖子培养上清液中分别提取并鉴定exosomes,评价弓形虫exosomes对巨噬细胞和BALB/c小鼠的免疫调节作用,为寻找防治弓形虫病的药物或疫苗提供实验依据。
  研究方法:利用透射电镜和Western blotting分析鉴定从弓形虫速殖子培养液中获取的exosomes形态结构和表面标志。用PKH67绿色荧光染料对弓形虫分泌的exosomes进行染色后与RAW264.7巨噬细胞共孵育,在荧光显微镜下观察exosomes与巨噬细胞融合情况,采用ELISA法检测弓形虫exosomes影响小鼠巨噬细胞分泌细胞因子水平。将弓形虫exosomes经肌肉注射免疫接种BALB/c小鼠,检测小鼠体内产生的体液免疫与细胞免疫应答来评价其作为抗弓形虫候选疫苗的免疫保护效果。
  结果:透射电镜和WB检测结果显示,弓形虫exosomes形态结构呈圆形或椭圆形、直径大小在10-150 nm之间、含有蛋白分子P30和Hsp70。体外实验结果显示,弓形虫exosomes能与巨噬细胞融合,且能调节巨噬细胞分泌细胞因子的水平。弓形虫exosomes免疫接种BALB/c小鼠后能产生更高水平的IFN-γ、IL-12、IgG和IgG2a,小鼠的生存时间也明显延长。体内实验结果显示,弓形虫exosomes诱导小鼠产生一定的体液免疫与细胞免疫,可为抵抗弓形虫速殖子攻击提供部分免疫保护力。
  结论:弓形虫exosomes与巨噬细胞融合并调节其分泌细胞因子水平,表明巨噬细胞是弓形虫exosomes的靶细胞之一。弓形虫分泌的exosomes作为疫苗可刺激小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫应答,表明弓形虫exosomes也可成为抵抗细胞内病原体的候选疫苗,为研制弓形虫新型疫苗奠定理论基础。
[硕士论文] 王婷
病原生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞内的原虫。作为一种机会致病性原虫,过去一直认为在免疫功能正常的宿主体内呈无症状的隐性感染的状态。然而,近年来,越来越多的研究发现,弓形虫隐性感染并不是无症状的带虫状态,而是以一种非常精妙的方式引起宿主智力改变,行为异常,甚至精神疾病的发生。
  越来越多的研究关注于弓形虫感染如何导致宿主精神行为变化。弓形虫在宿主体内长期以包囊的形式存在,这可能导致了感染宿主的神经细胞损伤以及神经递质表达异常。研究发现,由于弓形虫的亲神经细胞的特性,寄生于宿主细胞的弓形虫速殖子最终以“特洛伊木马”的方式穿过血脑屏障进入宿主的中枢神经系统,随着宿主的免疫反应,速殖子转化为缓殖子形成包囊,最终导致中枢神经系统损伤。一些研究者认为弓形虫慢性感染,打破了宿主体内神经免疫调节的平衡,进一步导致神经递质相关信号通路网络失衡,最终引起宿主精神行为的变化。然而,目前为止,关于弓形虫感染引起宿主精神行为异常的机制还不是很明确。
  为了探究弓形虫感染引起宿主行为改变的分子机制。我们用弓形虫Ⅱ型株(Pru株)感染小鼠,建立弓形虫慢性感染的小鼠模型,通过一系列动物行为学实验,探究感染弓形虫的小鼠在精神行为上的变化,并将感染组小鼠灌注取脑,石蜡切片,利用免疫组化,免疫荧光以及Western blot检测慢性弓形虫感染对小鼠脑组织造成的病理变化和损伤。接着,我们利用RT2 Profiler PCR Array和ELISA实验技术对小鼠脑组织内细胞因子、趋化因子以及NF-κB炎性通路的表达水平进行了检测。此外,我们还利用HPLC和RT2 Profiler PCR Array分析了脑组织内神经递质及相关信号通路的表达水平。
  结果显示,相对于健康小鼠,慢性感染弓形虫两个月后小鼠的其学习能力和健康小鼠相比并无明显变化,但是对记忆的保持能力明显减弱。而且更易出现恐惧和绝望情绪,对周围环境的自主探索能力也明显下降。然后将实验小鼠通过动物实验解剖的方法灌注取脑,制作脑组织石蜡切片。通过免疫组化染色发现弓形虫包囊寄生于在脑组织的不同部位,其中大脑皮质,纹状体,海马外围是常见的寄生部位。但我们发现形成的包囊大部分界限清晰,包囊周围组织未见明显炎症反应,血管炎性浸润形成的套袖样改变多见;免疫组织细胞化学实验发现相对于正常小鼠,感染组小鼠脑部星形胶质细胞和小胶质细胞活化,神经元出现凋亡,突触数量减少。同时发现,弓形虫感染小鼠脑组织中细胞因子和趋化因了表达发生明显变化。RT2 Profiler PCR Array信号通路分析表明在感染鼠脑部炎性信号通路NF-κB通路活化以及多巴胺相关信号通路的表达异常。HPLC检测显示了弓形虫慢性感染小鼠脑组织中神经递质表达的异常:NE和5-HT的表达量明显下降(P<0.05),DA和E的表达量明显升高(P<0.05)。
  综上所述,本研究通过行为学研究,免疫病理研究,神经递质和信号通路研究揭示弓形虫感染穿过血脑屏障后首先诱导小胶质细胞和星形胶质细胞活化,多种细胞因子和趋化因子表达升高,NF-κB信号通路活化,又进一步加剧了炎症应答对中枢神经系统的损伤,破坏了神经递质及相关信号通路的平衡,最终引起宿主精神行为改变。
[硕士论文] 宋鹏霞
病原生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:刚地弓形虫疾病在全世界范围内普遍流行,对人类的身体状况造成了严重的伤害。因此,研制弓形虫疫苗治疗弓形虫疾病迫在眉睫。本实验研究目的主要是评估弓形虫肌动蛋白结合蛋白(Toxofilin)基因疫苗对小鼠的免疫效果。此外,我们分别将单佐剂(铝盐佐剂(alum),脂质体A(MPLA)),双佐剂(alum+MPLA)分别与Toxofilin DNA疫苗联合使用注入到宿主体内从而进行筛选宿主抗体表达能力。
  方法:使用生物信息学的方法,我们分析了Toxofilin表达蛋白的氨基酸排列序列,并且运用相关生物学软件预测了Toxofilin蛋白几个潜在的B细胞,T细胞抗原表位。将BALB/c小鼠分为四个实验组(单Toxofilin DNA疫苗,alum佐剂+DNA疫苗,MPLA佐剂+DNA疫苗,双佐剂(alum+MPLA)+DNA疫苗),并且将上述四组实验试剂连续免疫小鼠三次,通过检测弓形虫总抗体以及细胞因子的含量来评价小鼠产生的免疫反应。待第三次免疫小鼠14天后,将致死性剂量的弓形虫(RH株)速殖子腹腔注射到小鼠体内,通过观察小鼠的存活时间进而来验证DNA疫苗并且结合不同佐剂对小鼠的免疫保护性。
  结果:所有实验组(Toxofilin,Toxofilin+alum,Toxofilin+MPLA,Toxofilin+alum+MPLA)免疫小鼠后,在其小鼠体内,细胞免疫与体液免疫水平都明显高于对照组(PBS,alum,MPLA)。此外,与单基因组(Toxofilin)疫苗相比,alum+Toxofilin基因疫苗联合使用增强了体液免疫应答与Th2型细胞免疫应答,相反地MPLA+Toxofilin一起使用增强了体液免疫应答与Th1型细胞免疫反应。更重要地是,与alum+Toxofilin相比,将MPLA与alum+Toxofilin基因疫苗联合使用能够转变alum+Toxofilin基因疫苗中细胞免疫应答的类型,将Th2型细胞免疫转变为Th1型细胞免疫,同时,在alum+MPLA+Toxofilin基因疫苗免疫组中,体液免疫与Th1型细胞免疫应答都显著高于其它实验组与对照组,最后通过弓形虫速殖子攻击实验来评价基因疫苗与不同佐剂对小鼠的免疫保护性,结果表明,与其它实验组与对照组相比,alum+MPLA+Toxofilin基因疫苗明显地延长了小鼠的存活时间。
  结论:刚地弓形虫Toxofilin基因可以作为一个合适的候选疫苗,将复合佐剂alum+MPLA与Toxofilin基因共同使用,使小鼠体内的免疫应答包括细胞免疫与体液免疫应答都明显地增强与提高。
[硕士论文] 段江洋
病原生物学(人体寄生虫学) 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:迭宫属绦虫的中绦期幼虫——裂头蚴,可寄生于人体引起裂头蚴病,主要表现为幼虫移行症,累及全身,可导致失明、肢体麻痹、甚至死亡。裂头蚴病呈世界性分布,但多见于东亚及东南亚国家。我国大部分地区均有人体裂头蚴病报道,累计超过1000例,病例数为世界之最。近年来,裂头蚴病的发病趋势在部分地区呈上升态势,已被列为新现的动物源性寄生虫病。对我国的裂头蚴种群进行遗传结构和系统发生生物地理学研究,不仅对于了解我国迭宫绦虫种群的历史演化过程有基础性理论意义,而且对揭示它们如何响应气候变化和环境变迁,从而对制定裂头蚴病有效的防制策略具有指导意义。然而,目前关于我国裂头蚴的种群遗传多样性其分化模式等方面的研究还较薄弱。本研究利用公共数据库中现有的欧猥迭宫绦虫(Spirometra erinaceieuropaei)成虫及裂头蚴的ESTs开发了4个多态性微卫星分子标记,并利用这4个位点对我国西南11个地区的裂头蚴类群进行了种群遗传多态性研究。
  材料与方法:
  1.裂头蚴标本采集及鉴定:2014年5月至2015年9月,对我国四川、重庆和云南11个地区野生蛙体内裂头蚴的自然感染情况进行调查,并对阳性蛙体的裂头蚴进行收集,用无水乙醇密闭保存。利用通用型柱式基因组DNA提取试剂盒提取每一株标本的基因组DNA,基于cox1分子标记对采集的地理株进行分子生物学鉴定。
  2.微卫星分子标记开发:首先利用NCBI_BLAST和UniVec数据库掩蔽获取自公共数据库裂头蚴相关ESTs中冗余序列,然后使用CD_HIT_EST在线工具对ESTs聚类,最后利用MISA遵照单核酸重复10次及以上、2核苷酸和3核苷酸4次及以上、4核苷酸及5核苷酸和6核苷酸3次及以上、长度在100bp内的标准查找微卫星位点。选择以3核苷酸和(或)4核苷酸模式为主且位点侧翼序列符合引物设计要求的微卫星作为目的序列。利用Primer3设计目的序列引物,通过小样本预实验利用温度梯度PCR、琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序来检测扩增序列与原位点序列的一致性和多态性。
  3.目的序列扩增和测序:对确定与原位点序列一致且具有多态性的引物利用预实验确定的PCR条件和体系对所有地理株进行有效扩增,扩增产物一部分进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳加硝酸银染色(即PAGE银染),另一部分进行微卫星序列测序。
  4. PAGE及微卫星序列数据处理:对于银染数据,使用GenePop在线模块估算HO(观测杂合度)、HE(期望杂合度)、H(基因多样性)、哈德温伯格平衡和连锁不平衡检验、群体内近交系数Fis、固定系数Fst和总体近交系数Fit;使用Arlequin3.5计算遗传分化指数FST和G-W指数(Garza-Williamson index);使用GenALEx6.5进行分子变异分析(AMOVA)和主坐标分析(PCoA)。对于测序数据,使用MEGA v.6.06进行序列比对并对比对结果进行人工校正;使用DnaSP v.5.10进行单倍型(Haplotype)分析并分别构建不同微卫星标记的单倍型矩阵及多标记联合矩阵。
  5.遗传多态性分析:使用DnaSP v.5.10计算各地理群的单倍型多态性及核苷酸多态性;使用Network v.4.5对各个微卫星标记及联合序列进行单倍型网络的重建;分别使用最大简约、最大似然及贝叶斯推断法进行系统发育分析。最大简约分析在MEGA v.6.06中进行,树的搜索策略采用启发式搜索,分支交换法采用树二等分再连接的分支交换法,系统树每一分枝的置信度采用自引导法重复检验,设置2000次重复;使用 PhyML软件进行最大似然分析,基因进化模型用赤池信息量准则在jModelTest2中选择模型,分枝的置信度采用自引导法重复检验,设置2000次重复;采用MrBayes v3.1进行贝叶斯分析,运行1×108代,每100代对系统树进行抽样,使用收敛诊断法对稳定性进行重新评估,当分离频率的平均标准差小于0.02时则认为两次运行之间存在收敛。所有系统发育分析均运算两次。使用Arlequin3.5中岐点分布分析来评估裂头蚴种群的动态变化,并基于中性选择理论,对不同种群进行Fu’s FS检测和Tajima’s D检测。
  结果:
  1.中国西南地区野生蛙类裂头蚴自然感染率:自中国西南11个不同地区(四川南充、营山、广安、乐山、自贡、泸州、达州、凉山州和云南昆明、保山及重庆梁平)共采集野生蛙类347只,经鉴定均为黑斑蛙(Rana nigromaculata)。其中64只感染裂头蚴,平均感染率为18.44%。不同地区裂头蚴感染率从6.67%到36.36%不等,最多的1只感染31裂头蚴,最少的感染1条。四川地区蛙类裂头蚴感染率较高,其中又以南充的感染率最高,达36.36%。
  2.微卫星位点筛选和引物设计:共获得12481条裂头蚴相关ESTs,找到符合要求的微卫星915条,平均约1779个碱基中含有1条微卫星位点。重复单元以单核苷酸为最多,占46.67%,其中重复大于15次的长序列以A/T模式为主,小于15次的短序列以C/G为主;其次是2核苷酸,占31.26%,又以AC/GT和AG/CT丰度最高;再次是3核苷酸分别为16.72%,数量最多的是AGG/CCT模式;最后是占4.48%的4核苷酸模式以及合计不足1%的5核苷酸和6核苷酸。通过小样本预实验从15个位点中筛选出了5个(C07、M15、I03、N11和M20)与预期位点序列一致的微卫星分子标记,经测序验证其中4个(C07、M15、N11和M20)具有多态性。
  3.基于PAGE银染数据的遗传多态性分析:5个微卫星标记和64株裂头蚴地理株共鉴定出13个等位基因,每个微卫星标记所鉴定出的等位基因数量为2~3个(平均2.60)。95%的地理株等位基因数不超过3个,平均每个地理株每个微卫星位点的等位基因数为1.89。I03位点上的杂合数量最少,只有18.75%,其次是N11位点,占26.56%。四川广安和南充地区具有最多的等位基因数(11个),平均等位基因数也最高(2.20),而四川达州和云南昆明的平均等位基因数最少(1.40),四川乐山在5个位点上均表现出多态性。所有地理株整体上总杂合度范围为0~0.682(平均值为0.322),每个地理种群观测杂合度(HO)的均值为0.436(范围为0~1.000)。哈德温伯格平衡检验结果表明本研究的所有地理株是一个整体种群中的随机个体(P>0.05),且所选的微卫星位点之间不存在连锁不平衡(P>0.05)。估算的Fis和Fit结果均为负值,表明群体观测杂合度大于期望杂合度,群体内存在杂交情况。在 N11位点上群体间遗传分化较弱(Fst<0.05),I03位点上群体间遗传分化较强(Fst>0.25),C07、M20和M15为中等(0.05  4.基于序列的遗传多态性分析:通过序列比对发现 I03的多态性来自微卫星位点的侧翼序列上,因此在基于微卫星序列数据进行遗传多态性分析时剔除了I03位点。在剩余的4个位点中,基于C07标记共鉴定出4个单倍型,其中Hap1涵盖17个地理株,Hap2涵盖41个地理株,Hap3涵盖5个地理株,Hap4只包含1个地理株;M15标记共鉴定出9个单倍型,其中Hap1涵盖46个地理株,Hap4涵盖9个地理株,Hap6和Hap8分别包含2个地理株,Hap2、Hap3、Hap5、Hap7和Hap9均只有1个地理株;M20标记共鉴定出7个单倍型,其中Hap1涵盖10个地理株,Hap2和Hap7均涵盖2个地理株,Hap3包含30个地理株,Hap4涵盖13个地理株,Hap5涵盖6个地理株,Hap6只包含1个地理株;N11标记共鉴定出10个单倍型,其中Hap1涵盖21个地理株,Hap2包含18个地理株,Hap3包含6个地理株,Hap4涵盖9个地理株,Hap9涵盖3个地理株, Hap8和Hap10均涵盖2个地理株,Hap5、Hap6和Hap7均只有1个地理株;C07、M15、M20和N11总的单倍型多态性(Hd)及核苷酸多态性(Pi)分别为:0.175±0.061、0.00090±0.00032,0.468±0.072、0.01559±0.01007,0.553±0.057、0.00430±0.00062,0.581±0.064、0.00494±0.00077。分子差异度分析的结果显示种群之间的遗传差异度比种群内的要高。分别使用最大简约法、最大似然法和贝叶斯推断法对不同微卫星标记进行的系统发育分析结果表明,所有微卫星标记的单倍型均分为两个主要分枝,其中,C07标记的 Hap4单独形成一个分枝;M15标记的Hap4和Hap5形成一个分枝;M20标记的Hap2和Hap5形成一个分枝;N11标记的Hap3、Hap4、Hap6和Hap7共同形成一个类群。基于单倍型的中接邻接网络分析的结果也显示西南地区裂头蚴的存在两个单倍型子网络,并且与系统进化树上的分枝相对应。其中,C07标记的 Hap2是最主要的单倍型,频数为41;M15标记的Hap1是最主要的单倍型,频数为46;M20标记的Hap3是最主要的单倍型,频数为30;N11标记的Hap1和Hap2是最主要的单倍型,频数分别为21和18。
  结论:
  1.我国西南地区野生黑斑蛙体内均存在裂头蚴自然感染情况,平均感染率为18.44%;
  2.基于欧猥迭宫绦虫成虫和裂头蚴的 EST序列数据库,利用生物信息工具成功筛选出4组微卫星标记:C07、M15、M20和N11;
  3. PCoA分析结果表明我国西南地区裂头蚴存在2个种群,且地理隔离对裂头蚴的种群遗传多态性影响较大;
  4.基于不同微卫星标记的单倍型分析结果表明,我国西南地区裂头蚴种群的基因多态性水平较低;
  5.系统发育及单倍型网络分析结果均提示西南地区裂头蚴种群存在2种基因型,且这2种基因型在不同地理区域混合存在。
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