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[硕士论文] 林志灯
海洋生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFA)一般指的是双键数≥3且碳链长度≥20的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)。其中具有重要生理功能的LC-PUFA主要有二十二碳六酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA),它们都是生物体正常生长发育所必需的脂肪酸。一般认为,海蟹不具有将亚油酸和α-亚麻酸转化为LC-PUFA的能力。因此,DHA和EPA等LC-PUFA被认为是海蟹的必需脂肪酸。近年来,本课题组在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)脂肪需求以及植物油替代鱼油方面开展了相关研究。研究结果发现,在饲喂紫苏籽油和红花油的青蟹的肌肉中,脂肪酸20:4n-6和20:5n-3的含量有轻微的提高。据此结果,我们推测青蟹自身可能具有合成LC-PUFA的能力。为验证我们的推测,本研究对青蟹合成LC-PUFA的关键酶基因进行了克隆,并对基因的组织表达和营养调节进行了研究。主要结果如下:
  1.采用RT-PCR和RACE-PCR方法,从青蟹中克隆到一个脂肪酸去饱和酶基因(GenBank登录号:KU975033),命名为Δ6 Fad-like。该基因的cDNA序列全长为1973bp,包含201bp的5’非翻译区,443bp的3’非翻译区以及1329bp的开放阅读框,共编码442个氨基酸。氨基酸序列与其它已克隆的甲壳类Δ6脂肪酸去饱和酶具有53%~80%的相似性,且具有典型的脂肪酸去饱和酶的结构特征。RT-qPCR结果显示:Δ6 Fad-like基因主要在肝胰腺中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Δ6 Fad-like基因在肝胰腺中的表达显著上调,说明了大豆油能促进该基因的表达。
  2.克隆到一个碳链延长酶4基因(GenBank登录号:KX454537),命名为Elovl4-like。该基因的cDNA序列全长为1119bp,包含58bp的5’非翻译区,44bp的3’非翻译区以及1017bp的开放阅读框,共编码338个氨基酸。氨基酸序列与已克隆的其它物种的延长酶4具有42%~47%相似性,且具有典型的延长酶的结构特征。RT-qPCR结果显示:Elovl4-like基因主要在肝胰腺中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Elovl4-like基因在肝胰腺中的表达显著上调,说明了大豆油能促进该基因表达。
  3.克隆到一个碳链延长酶基因,命名为Elovlm,又因该基因有两个亚型,故又分别命名为Elovlm1和Elovlm2。Elovlm1和Elovlm2 cDNA序列全长均为1529bp,包含75bp的3’非翻译区,389bp的5’非翻译区以及1065bp的开放阅读框,共编码354个氨基酸。RT-qPCR结果显示:Elovlm基因主要在胃中表达,而在其它组织中的表达量相对较低。养殖试验结果表明,随着大豆油替代鱼油比例的升高,Elovlm基因在胃中的表达显著上调,但对肝胰腺中的Elovlm基因的表达影响不显著。
  综上所述,本研究从青蟹中克隆到三个LC-PUFA合成关键酶基因,即Δ6 Fad-like、Elovl4-like和Elovlm。这些基因在肝胰腺和胃等组织中的表达水平较高,说明这些组织可能是青蟹LC-PUFA合成的主要部位。饲料中的大豆油能够显著提高青蟹LC-PUFA合成关键酶基因的表达水平。该研究结果对于丰富甲壳类营养学,特别是分子营养学内容等具有较重要的理论意义和学术价值,为进一步研究甲壳类LC-PUFA合成的分子机制提供了基础。
[博士论文] 刘春华
生理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分 AT1R偏向性途径对嗜铬细胞儿茶酚胺分泌的影响
  目的:
  血管紧张素Ⅰ型受体(Angiotensin receptor1 receptor,AT1R)偏向性配体通过激活G蛋白依赖的或β-拘禁蛋白依赖的途径产生不同的效应。最近的研究结果表明,针对AT1R-拘禁蛋白偏向性途径的配体对治疗心衰,要比氯沙坦具有更好的疗效。但是血管紧张素通过其受体刺激肾上腺髓质后产生的肾上腺素和去甲肾上腺素对某些心血管疾病是不利的。目前AT1R-拘禁蛋白偏向性配体-TRV120027已进入三期临床,所以本实验主要研究拘禁蛋白介导的AT1R信号途径是否影响肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺的分泌及其机制。
  方法:
  在本研究中,我们分离雌性小鼠的原代肾上腺嗜铬细胞(Mouse AdrenalChromaffin Cells,MACC),使用特异的G蛋白偏向性或β-拘禁蛋白偏向性AT1R激动剂研究不同偏向性信号通路对肾上腺髓质嗜铬细胞分泌的影响及分子机制。我们通过电化学方法和酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检查临床前药物TRV120027对儿茶酚胺分泌的影响,并应用信号通路中小分子抑制剂,野生型或β-arrestin-1-/-、β-arrestin-2-/-、Gq-/-或TRPC3--敲除小鼠,检测TRV120027刺激儿茶酚胺分泌的分子机制。
  结果:
  1.Gq偏向性配体引起MACC分泌
  AT1R的Gq偏向性配体TRV120055和TRV120056能引起小鼠肾上腺嗜铬细胞,儿茶酚胺的量子化释放,并且Gq偏向性激动剂(TRV120055,TRV120056)引起的分泌量只占全激动剂AngⅡ引起儿茶酚胺分泌量的一半。
  2.β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC分泌
  AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SⅡ、TRV120026和TRV120027能引起小鼠肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺分泌。并且分析发现β-拘禁蛋白偏向性激动剂(SⅡ、TRV120027和TRV120026)引起的分泌量只占全激动剂AngⅡ引起儿茶酚胺分泌量的一半。同时TRV120027引起的分泌能被AT1R的拮抗剂坎地沙坦(100nM)完全阻断。
  3.ELISA检测AT1R不同偏向性配体引起的MACC分泌
  在分离的完整小鼠肾上腺髓质上,给予配体刺激1min,用ELISA试剂盒分别检测AT1R的不同偏向性配体引起髓质分泌肾上腺素(Epinephrine,E)和去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)的情况。AT1R的完全激动剂AngⅡ、Gq偏向性配体(TRV120055)和β-拘禁蛋白偏向性配体(SⅡ和TRV120027)短时间刺激1min均可引起髓质E和NE分泌增多。
  4.Gq偏向性配体引起MACC的分泌可被U73122阻断
  在分离的MACC上,PLC的阻断剂U73122(10μM)抑制AT1R的全激动剂AngⅡ引起的儿茶酚胺分泌,其分泌量降低约有一半;而AT1R的Gq偏向性激动剂TRV120055和TRV120056引起MACC分泌后,再给予U73122后,无法检测到儿茶酚胺的分泌,说明U73122完全阻断了AT1R的Gq偏向性激动剂引起的MACC的分泌。
  5.β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC的分泌不能被U73122阻断
  在培养的单个的MACC上,分别给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SⅡ、TRV120027或TRV120026,检测MACC儿茶酚胺分泌,给10μM U73122阻断6min后,再给AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体后,儿茶酚胺分泌量并未下降。因此,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起的MACC分泌不能被U73122阻断。
  6.TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌非Gq途径
  在分离培养的Gq-/-基因敲除小鼠肾上腺嗜铬细胞上,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,可引起Gq敲除的MACC儿茶酚胺分泌,同时比较Gq敲除的和野生的MACC的儿茶酚胺释放量无明显差异,进一步证实TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌不需要激活Gq途径,是非Gq依赖的。
  7.TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌非Gi途径
  实验中选择Gi的抑制剂百日咳毒素(pertussis toxin,PTX),用1μM PTX预孵育嗜铬细胞后,再给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,仍可检测到MACC儿茶酚胺分泌,同时比较加入PTX的和未加入PTX孵育的MACC儿茶酚胺释放量无明显差异,提示TRV120027引起的MACC儿茶酚胺分泌是非Gi依赖的。
  8.β-arrestin-1介导TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌
  实验中分离培养β-arrestin-2-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027,嗜铬细胞分泌良好,比较β-arrestin-2-/-敲除的和野生型(Wild type,WT)的MACC的儿茶酚胺释放量无明显差异。由结果可知,β-arrestin-2-敲除不影响TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌。
  然而,同样分离培养β-arrestin-1-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,却未引起嗜铬细胞儿茶酚胺的量子化释放,比较β-arrestin-1-/-敲除的和WT的MACC的儿茶酚胺释放量差异非常显著。由结果可知β-arrestin-1介导了TRV120027引起MACC的儿茶酚胺分泌。
  9.TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌依赖于细胞外钙离子
  实验中使MACC在标准含钙离子溶液和无钙离子的外液之间进行切换的方法,当给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SⅡ和TRV120027后,在标准含钙离子溶液可引起MACC的分泌;而切换到无钙离子的外液时,SⅡ和TRV120027均未引起MACC儿茶酚胺的分泌,由此可知TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌依赖于细胞外的钙离子。
  10.TRPC3敲除后,影响TRV120027引起MACC儿茶酚胺的分泌
  实验中分别分离培养TRPC3+/-TRPC6-/-TRPC7-/-和TRPC3-/-TRPC6-/-TRPC7-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,当给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,可引起TRPC3+/-TRPC6 TRPC7-的MACC儿茶酚胺的分泌却不能引起TRPC3-/-TRPC6-/-TRPC7的MACC儿茶酚胺的分泌,二者儿茶酚胺释放量差异非常显著(p<0.005)。当实验中分离培养只敲除TRPC3--基因的小鼠的嗜铬细胞,给予AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027后,也未引起MACC儿茶酚胺的量子化释放,比较TRPC3-/-敲除的和WT的MACC的儿茶酚胺释放量差异非常显著(p<0.005),以上结果证实AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027激活TRPC3通道导致钙内流引起MACC的儿茶酚胺分泌。
  11.β-arrestin-1-TRPC3途径在是不同GPCR激动剂诱导分泌中的一般通路。
  实验中选用不同G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)激动剂激动剂,包括氯化乙酰甲胆碱(Methacholine Chloride,Mch)、硫酸化八肽胆囊收缩素(sulfated cholecystokininoctapeptide,CCK-8s)和缩宫素(Oxytocin OT),激活MACC上的相应受体后均引起儿茶酚胺的分泌。而且OT和CCK-8s引起的MACC儿茶酚胺的分泌被U73122阻断后,分泌量分别降为80%和50%。当同时应用TRPC3通道阻断剂Pyr3和PLC阻断剂U73122后,OT-或CCK-8s引起的MACC儿茶酚胺的分泌量与单独用U73122后MACC儿茶酚胺的分泌量无明显差异,表明TRPC3在活化胆囊收缩素受体或缩宫素受体后不参与除Gq-PLCβ通路外的儿茶酚胺分泌。与此不同的是,虽然U73122将Mch诱导MACC儿茶酚胺的分泌量降低了50%,但是Pyr3和U73122的组合使用进一步使Mch引起MACC的儿茶酚胺分泌量进一步降低至约15%,这表明在嗜铬细胞中乙酰胆碱受体介导的MACC的儿茶酚胺分泌也是基于激活TRPC3而产生的。
  同样的,实验中分离培养β-arrestin-1-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,给予Mch引起儿茶酚胺分泌,与WT小鼠儿茶酚胺分泌量比较,在β-arrestin-1--敲除的MACC中显著降低。在WT小鼠中,U73122的应用虽降低了Mch诱导的儿茶酚胺分泌量约40%,而在Mch诱导β-arrestin-1--敲除的MACC的儿茶酚胺分泌减少了近80%。因此,β-arrestin-1-TRPC3途径是介导原代嗜铬细胞中Mch诱导的儿茶酚胺分泌的有效活性成分。
  讨论:
  这项工作揭示了除了经典的G蛋白-TRP通道轴,β-arrestin-1也可以介导急性生理过程,通过直接结合并由此激活TRPC3通道。尤其在GPCR信号和拘禁蛋白功能领域,AT1R-β-arrestin-1-TRPC3分泌模式是一种新的GPCR激活方式。综合起来看,本研究有助于阐明GPCR是如何调节离子通道活动的,并为临床上治疗心力衰竭指明了一个新的方向。对人类在某些生理和病理条件,阐明细胞对环境刺激产生的不同反应也将产生广泛的影响。
  结论:
  1.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体可引起MACC儿茶酚胺的量子化释放。
  2.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC儿茶酚胺的量子化释放是由β-arrestin-1介导的。
  3.AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC儿茶酚胺的量子化释放主要通过细胞外的钙离子内流而实现。
  4.TRV120027激活TRPC3通道引起钙内流导致儿茶酚胺分泌。
  5.β-arrestin-1介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活的方式。
  第二部分 AT1R偏向性途径对嗜铬细胞内钙离子的影响
  目的:
  几乎所有的生命活动过程都受到Ca2+的调控。Ca2+作为胞内第二信使,在细胞内调节包括分泌在内的各种生理过程。钙离子在调控分泌中的核心作用得到确立。在囊泡出胞的过程中,Ca2+更是触发最后融合的关键因子。据我们前述的研究结果,β-拘禁蛋白偏向性配体刺激小鼠肾上腺嗜铬细胞引起的儿茶酚胺释放主要通过细胞外的钙离子内流而实现的,本实验研究钙通道在β-拘禁蛋白偏向性配体引起的钙离子变化中的作用。
  方法:
  本研究主要应用钙成像记录法以明确证明AT1R拘禁蛋白介导的儿茶酚胺分泌胞内钙离子的变化及机制,并应用小分子抑制剂、通道阻断剂和β-arrestin-1、β-arrestin-2-/-、TRPC3-/-敲除小鼠的原代嗜铬细胞内钙的变化加以证实。并用293细胞进行AT1R,β-arrestin-1和TRPC3共表达实验,以验证TRV120027作用于AT1R,β-arrestin-1和TRPC3在细胞膜上的共定位情况。
  结果:
  1.β-拘禁蛋白偏向性配体引起MACC内的[Ca2+]i增加不能被U73122阻断本研究中首先选用AT1R全激动剂AngⅡ作用于嗜铬细胞1min使F340/380比值升高,细胞内[Ca2+]i升高,U73122阻断后,再用AngⅡ后MACC的F340/380比值升高降低了约50%。在β-arrestin-2-/-基因敲除的小鼠中得到了相同的结果。
  而且在β-arrestin-2-/-基因敲除小鼠的嗜铬细胞,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027引起MACC的F340/380的比值仍然升高约0.4,进一步说明β-arrestin-2不能介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i的升高变化。但是β-arrestin-2--基因敲除比较WT小鼠嗜铬细胞内[Ca2+]i的比值升高更明显(p<0.05)。而高KCl导致的β-arrestin-2-/-基因敲除小鼠嗜铬细胞内[Ca2+]i升高,和WT小鼠嗜铬细胞[Ca2+]i升高变化不明显,说明β-arrestin-2敲除不影响高KCl对MACC的分泌效应,这与第一部分结果中对嗜铬细胞分泌的影响一致。
  2.β-arrestin-1介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化
  本实验中首先用AT1R的全激动剂AngⅡ作用于β-arrestin-1-/-敲除的嗜铬细胞后F340/380比值升高,细胞内[Ca2+]i升高,用U73122阻断后,再用AngⅡ作用MACC后,嗜铬细胞的F340/380比值未见升高,比较分析差异非常显著(p<0.005)。其次,选用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于β-arrestin-1-/-敲除的嗜铬细胞1min后F340/380比值未发生变化,即嗜铬细胞内[Ca2+]i未发生变化。由此得到结果,β-arrestin-1介导了TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化。
  3.细胞外Ca2+对TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化的影响
  AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体SⅡ和TRV120027在无钙溶液中作用于MACC后F340/380比值不变,没有记录到[Ca2+]i升高变化,与在标准钙溶液中记录到的F340/380比值升高比较分析差异非常显著(p<0.01)。高KCl作用于MACC后F340/380比值升高约1.5以上,使[Ca2+]i升高,当切换到无钙离子的外液时,也未出现F340/380比值的变化,胞内[Ca2+]i未升高,两者分析比较差异极显著(p<0.005)。由此证实,AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体作用于MACC后,使细胞外的Ca2+内流,致使细胞内[Ca2+]i升高。
  4.TRP通道介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化
  实验中选择不同钙通道阻断剂,L型钙通道阻断剂尼卡地平、R型钙通道阻断剂SNX482和电压门控性钙通道阻断剂CdCl2,阻断相应通道后,用AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于MACC,仍可记录到F340/F380比值升高,通过分析比较各阻断剂的抑制率没有发现显著差异,证实尼卡地平、SNX482和CdCl2未阻断钙内流。最后选择非特异性TRP通道阻断剂钌红(Ruthenium Red,RR),阻断TRP通道后,再给TRV120027作用于MACC,却未出现F340/F380比值的升高,嗜铬细胞内[Ca外2+]i未发生变化,说明RR明显的抑制了TRV120027引起的钙离子变化,钙内流被阻断,即TRP通道介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化。
  5.TRPC3介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化
  实验中选择不同TRP通道阻断剂,检测AT1R的β-拘禁蛋白偏向性配体TRV120027作用于MACC后胞内[Ca2+]i的变化,以确定哪种TRP通道起作用。当用TRPV4特异性阻断剂HC067047和TRPC4特异性阻断剂ML-204阻断相应通道后,TRV120027作用于MACC,仍记录到F340/F380比值升高,通过分析比较各阻断剂的抑制率没有发现显著差异,HC067047和ML-204未阻断TRV120027引起的MACC的钙内流。
  选用非特异性TRPC3/6/7阻断剂氯化镧后,再给TRV120027作用于MACC,并未出现F340/F380比值的升高,说明氯化镧明显的抑制了TRV120027引起的钙离子变化,钙内流被阻断;应用特异性TRPC3通道阻断剂Pyr3后,TRV120027作用于MACC引起的钙内流也被阻断。以上结果可知,TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i增加是由TRPC3通道介导的。
  6.TRPC3,β-arrestin-1和AT1R共表达
  把TRPC3-GFP和β-arrestin-1-RFP共转染293细胞,100nM AngⅡ和100nMTRV120007刺激后β-arrestin-1-RFP上膜,Merge后与TRPC3共定位在细胞膜上。把TRPC3-GFP和AT1R-cherry共转染293细胞,100nM AngⅡ和100nMTRV120027刺激后AT1R受体上膜,Merge后与TRPC3共定位在细胞膜上。证实了TRV120027刺激AT1R-arrestin1后迅速偶联激活TRPC3通道。
  讨论:
  我们的结果表明,AT1R招募了β-arrestin-1到质膜并以快速促进形成的AT1 R-arresti n-1-TRPC3复合物的方式,从而导致TRPC3通道的直接开放,介导细胞外Ca2+流入并触发儿茶酚胺分泌。本研究阐明了GPCR信号传导和抑制功能的新范例。β-arrestin介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活的方式。
  结论:
  1.β-arrestin-1介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化。
  2.TRPC3介导TRV120027引起的嗜铬细胞内[Ca2+]i变化。
  3.β-arrestin-1介导的AT1R与TRPC3的偶联是一种新的GPCR激活方式。
[博士论文] 李静
病原生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分鼠衣原体肺部感染中NK细胞对CD4+T细胞亚群的调节作用
  研究目的:
  衣原体(Chlamydia)是一种严格细胞内寄生的原核细胞型微生物,可引起多种人类疾病。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ctrachomatis)是最常见的性传播性疾病的病原体,并可引起新生儿衣原体肺炎。肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae,C.pneumoniae)是继肺炎链球菌、流感嗜血杆菌之后引起社区获得性肺炎的第二位主要病原体,在儿童、成人尤其是老人中引起急性非典型性肺炎。尽管多种广谱抗生素可用于治疗衣原体感染,但由于个体间不同的临床表现,药物耐药性等因素的存在影响了对衣原体病及时的诊断和有效治疗。目前尚无有效疫苗上市用于衣原体疾病的预防。因此,深入研究宿主抗衣原体感染中的免疫应答及免疫调控机制是探索新型防治策略的基石,对于进一步控制衣原体感染是必要的。
  衣原体感染后,宿主的固有免疫和适应性免疫共同参与抗感染免疫应答。衣原体感染可激活固有免疫细胞包括DC(树突状细胞,dendritic cell),巨噬细胞(macrophage,MΦ)和NK细胞(自然杀伤细胞,nature killer cell)等。这些细胞不仅能增强固有免疫应答也可以进一步影响适应性免疫应答。机体的抗衣原体适应性免疫以细胞免疫为主。CD4+T细胞在衣原体感染中具有重要作用,其中,以分泌IFN-γ为特征的CD4+T(Th1)细胞免疫应答在机体清除衣原体感染中发挥至关重要的保护性作用。Th17细胞通过产生IL-17和IL-22等细胞因子协同促进Th1细胞应答在机体清除衣原体感染中发挥重要作用。研究发现人和小鼠衣原体感染局部组织中Tregs应答增强且与组织病理损伤有关。
  NK细胞是固有免疫细胞的重要成员,在机体抵御病原体感染中起重要作用。除杀伤作用外,NK细胞的免疫调节作用近年来受到学者重视。越来越多的证据表明,在感染性疾病和炎症性疾病中NK细胞可调节T细胞应答。目前,尽管已有研究表明NK细胞在抗衣原体感染中起保护作用,但是有关NK细胞的免疫调节机制报道不多,尤其缺乏NK细胞对不同CD4+T细胞亚群免疫调控作用的研究。
  本研究采用BALB/c小鼠衣原体呼吸道感染模型,较系统的研究了NK细胞对重要CD4+T细胞亚群的免疫调节作用。采用anti-asialo-GM1抗体特异性清除体内NK细胞。检测NK细胞去除对小鼠肺部衣原体清除能力、组织病理损伤的影响。利用ELISA、细胞内细胞因子染色以及荧光定量PCR等技术检测NK细胞对感染局部(肺组织)、免疫器官(脾脏和纵膈淋巴结)的不同CD4+T细胞亚群Th1、Th17以及Tregs的免疫调节作用,并进一步分析评估NK细胞对维持CD4+T细胞亚群免疫平衡的作用。
  研究方法:
  1 NK细胞去除对小鼠衣原体肺部感染疾病的影响
  1.1鼠衣原体(C.muridarum)的培养与纯化:培养Hep-2细胞,感染鼠衣原体,观察包涵体形成。玻璃珠方法收集感染细胞后,超声破碎释放衣原体,离心去除细胞碎片。超速离心纯化衣原体EB,-80℃保存
  1.2鼠肺部感染模型的建立:小鼠(6-8周龄,雌性BALB/c小鼠)麻醉后鼻吸入感染C.muridarum(1×103IFU),建立Cmuridarum肺部感染模型。
  1.3 NK细胞体内去除方法:小鼠于衣原体感染前一天,感染后一天尾静脉注射NK细胞封闭抗体(anti-asialo-GM1抗体),对照组注射同型对照抗体,之后间隔72h注射一次,直到实验结束。流式细胞术检测肺中NK细胞清除效率。正常对照组采用非感染的野生型小鼠。
  1.4小鼠疾病评估:小鼠经鼻吸入感染衣原体后,每隔24h记录体重;感染后不同时间(0、3、6、12和22天)取小鼠右肺中叶进行HE染色(hematoxylin-eosinstaining),观察并评估肺组织病理损伤;取左肺制备肺匀浆,检测包涵体形成单位(IFU),观察肺中衣原体生长情况。
  2 NK细胞对T细胞亚群应答的调控作用
  2.1 NK细胞对Th1、Th17和Tregs细胞分泌细胞因子的影响:小鼠于感染后6天和12天麻醉后处死,取肺(右肺上叶和下叶)、脾和纵膈淋巴结制备单个核细胞;心脏取血,获得血清。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测小鼠肺、脾和纵膈淋巴结细胞培养上清(IFN-γ、IL-17A、IL-22和IL-10)和血清中(IFN-γ、IL-17A和IL-22)细胞因子分泌。
  2.2 NK细胞对Th1、Th17和Tregs细胞群的影响:小鼠于感染后6天和12天麻醉后处死,制备小鼠肺、脾和纵膈淋巴结单个核细胞,细胞内因子染色,流式细胞术检测(CD3+CD4+IFN-γ+T)Th1、(CD3+CD4+IL-17+T)Th17细胞和(CD4+CD25+Foxp3+T) Tregs的比例和绝对数。
  3 NK细胞对Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡的影响
  3.1 NK细胞对T细胞亚群转录因子表达的影响:取衣原体感染后6天和12天小鼠的脾和肺单个核细胞,提取总RNA,实时定量PCR检测Th1(T-bet)、Th2(GATA3)、Th17(RORγT)和Treg(Foxp3)细胞分化发育特异性转录因子的mRNA表达水平。
  3.2 NK细胞对感染局部T细胞分化相关细胞因子的影响:取衣原体感染后6天和12天小鼠的肺和纵膈淋巴结单个核细胞培养上清,采用ELISA方法检测IL-12、TGF-β和IL-6的表达变化。
  3.3 NK细胞对Th1/Treg和Th17/Treg比值的影响:根据以上流式数据和细胞计数结果,分析小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1、Th17和Tregs的绝对数,计算Th1/Treg和Th17/Treg比值。
  研究结果:
  1 NK细胞去除小鼠衣原体肺部感染加重。
  1.1 Anti-asialo-GM1抗体可特异性去除NK细胞:于衣原体感染后第四天处死小鼠,检测小鼠肺中NK细胞比例。结果显示,注射anti-asialo-GM1抗体的小鼠肺中NK细胞数量和比例都显著降低,清除率为90%左右。
  1.2 NK细胞去除导致小鼠肺部感染加重:通过比较衣原体肺部感染后同型对照鼠和NK细胞去除鼠疾病变化发现,NK细胞去除鼠体重下降明显且恢复减慢(0-22天),肺部载菌量增加(感染后3、6、12和22天),HE染色结果显示,肺中支气管和血管周围有大量炎细胞浸润,组织病理损伤更重(感染后6天和12天)。
  2衣原体肺部感染中,NK细胞增强Th1和Th17应答,抑制Tregs应答
  2.1 NK细胞促进IFN-γ、IL-17和IL-22表达:IFN-γ主要由Th1细胞分泌,而Th17细胞以产生IL-17和IL-22等细胞因子为特征。我们使用ELISA方法检测衣原体感染后6天和12天小鼠肺、脾和纵膈淋巴结细胞以及血清中IFN-γ、IL-17和IL-22的表达。结果显示,NK细胞去除后,以上器官中IFN-γ、 IL-17和IL-22的表达水平均显著下降,血清中的浓度也明显降低。
  2.2 NK细胞去除导致Th1和Th17细胞的比例和绝对数降低: Th1细胞免疫应答在机体清除衣原体感染中发挥关键作用,Th17细胞协同促进Th1细胞应答。采用细胞内细胞因子染色,流式细胞术检测(CD3+CD4+IFN-γ+T)Th1和(CD3+CD4+IL-17+T)Th17细胞的比例和绝对数。分析NK细胞去除对Th1和Th17的影响。结果显示,与同型对照组相比,NK细胞去除组小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1、Th17细胞的比例和绝对数均明显降低,衣原体感染后6天和12天结果一致。说明NK细胞促进感染局部(肺)以及免疫器官(脾和纵膈淋巴结)中Th1、Th17细胞的免疫应答。
  2.3 NK细胞去除导致Tregs的比例和绝对数明显升高:观察小鼠肺部感染过程中NK细胞去除对Tregs应答的影响。细胞内细胞因子染色,流式细胞术分析(CD4+CD25+Foxp3+T) Tregs的比例和绝对数。结果显示,与同型对照组相比,NK细胞去除组小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Tregs的比例和绝对数显著增加,尤其在衣原体感染早期(6天)肺中Tregs的升高比较显著。证明,在衣原体肺部感染中,NK细胞对Tregs应答具有抑制作用,尤其在感染早期(6天)较为明显。
  3衣原体肺部感染中,NK细胞可维持Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡
  3.1 NK细胞促进Th1和Th17细胞分化,抑制Tregs分化:实时定量PCR检测小鼠脾和肺细胞中T细胞亚群特异性转录因子的表达。结果表明,NK细胞去除诱导脾和肺细胞中转录因子T-bet(Th1)和RORγT(Th17)表达降低,Foxp3(Tregs)和GATA3(Th2)表达增加。
  3.2 NK细胞去除导致维持T细胞亚群分化的细胞因子环境改变:采用ELISA方法,检测感染局部肺和纵膈淋巴结细胞培养上清中维持T细胞亚群分化的细胞因子表达变化。结果显示,衣原体感染中,NK细胞去除鼠肺和淋巴结细胞中维持Th1和Th17细胞分化的IL-12p40和IL-6分泌降低,而诱导Tregs分化的TGF-β表达水平增加。说明,NK细胞去除导致细胞因子环境改变促进了Tregs的分化,而不利于Th1和Th17细胞分化。
  3.3 NK细胞去除诱导Th1/Treg和Th17/Treg应答失衡:分析T细胞亚群的绝对数并计算Th1/Treg和Th17/Treg比值。结果发现,在衣原体肺部感染后第6天,NK细胞去除导致小鼠肺、脾和纵膈淋巴结中Th1/Treg和Th17/Treg比值均降低,机体免疫应答倾向于Treg方向。在感染后12天,尽管同型对照组Th1/Treg和Th17/Treg的比值很低,NK细胞去除组的比值仍然显著低于对照组。说明,衣原体肺部感染中,NK细胞通过调控Th1/Treg和Th17/Treg应答平衡,发挥其免疫保护性作用。
  研究结论与意义:
  1.NK细胞在BALB/c小鼠抵御衣原体肺部感染中发挥重要保护作用,有助于清除衣原体感染,减轻肺组织病理损伤,加快疾病恢复。
  2.NK细胞可显著抑制衣原体感染局部(肺脏)和外周淋巴器官(脾和纵膈淋巴结)中的Tregs应答,有利于增强保护性免疫反应。
  3.NK细胞通过促进Th1和Th17应答,抑制Tregs应答,从而维持Th1/Treg和Th17/Treg免疫平衡,增强机体清除肺部衣原体感染的能力,减轻组织病理损伤。
  本研究系统的揭示了在衣原体肺部感染中NK细胞对重要CD4+T细胞亚群的免疫调节作用,尤其是首次发现NK细胞对Tregs应答具有明显抑制作用。NK细胞通过维持Th1/Treg和Th17/Treg免疫平衡(促进Th1和Th17应答,抑制Tregs应答),在机体抵御衣原体肺部感染中发挥重要的保护作用。本研究为NK细胞免疫调节机制的研究提供了新见解。
  第二部分鼠衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的调节作用
  研究目的
  巨噬细胞是重要的固有免疫细胞,在维持免疫稳态和抵御病原体感染中起重要作用。巨噬细胞具有极强的可塑性,极化状态是其发挥不同功能的关键,巨噬细胞至少存在两种不同的极化状态,分为M1和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞(又称为经典活化的巨噬细胞)可被IFN-γ、PAMPs、TNF-α等活化,产生前炎症细胞因子,高表达iNOS,可直接杀伤病原体。M2型巨噬细胞(又称为替代性活化巨噬细胞),由Th2型细胞因子例如IL-4、DAMPs和TGF-β等诱导激活,高表达精氨酸酶-1,YM-1,CD206,参与寄生虫的清除,免疫调节以及促进组织重建。与Th1/Th2极化相似,巨噬细胞M1与M2表型之间的转换同样由特异性转录因子控制。现已知,C/EBP-α、PU.1、NF-κB(P65/P50)、Stat1、IRF5和HIFα等分子参与调控M1型巨噬细胞激活;而Stat3、Stat6、IRF4和SOCS1等胞内信号分子则参与了对巨噬细胞M2型极化的调控。巨噬细胞的极化机制复杂,一直是最近研究的焦点。研究表明,巨噬细胞参与机体抵御与清除病原体感染,其不同极化状态在控制衣原体感染中的作用已有一定的了解:M1型巨噬细胞可限制衣原体在细胞内增殖,并通过分泌细胞因子增强固有免疫和适应性免疫应答,利于机体快速清除感染;衣原体可在M2型巨噬细胞中正常增殖,并转移感染机体其他器官。因此,诱导适度的M1型巨噬细胞应答有利于机体对衣原体感染的清除。
  NK细胞可根据细胞因子微环境以及与其他免疫细胞相互作用控制其对巨噬细胞的细胞毒性或正向免疫调节作用,在不同病原体感染中发挥不同的作用。在衣原体肺部感染中,NK细胞是否可调节巨噬细胞,尤其是肺局部巨噬细胞目前尚未见报道。MicroRNAs(miRNAs)是一类介导基因转录后沉默调控基因表达的内源性非编码RNA,已发现多种miRNAs可调控巨噬细胞极化中关键分子的转录,参与巨噬细胞极化的调控。在衣原体感染中,miRNAs是否参与NK细胞诱导的巨噬细胞极化过程尚不清楚。
  本研究拟探讨在衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的调节作用及可能机制。采用BALB/c小鼠呼吸道感染模型,注射anti-asialo-GM1抗体特异性清除体内NK细胞。检测各组小鼠肺巨噬细胞极化状态,并进一步分析肺巨噬细胞中相关miRNAs及其靶分子的表达变化。
  研究方法:
  1.巨噬细胞的纯化与流式分析
  1.1肺巨噬细胞纯化:BALB/c小鼠鼻吸入感染衣原体,实验分组同第一部分。于感染后第6天处死小鼠,取肺组织用胶原酶Ⅺ(10mg/ml)消化,percoll密度梯度离心,制备单个核细胞。采用anti-F4/80磁珠抗体,分离纯化肺巨噬细胞。
  1.2肺巨噬细胞纯度分析:取5×105个纯化的肺巨噬细胞,采用表面染色,流式细胞术检测分析F4/80+CD11b+细胞的比例。
  2.NK细胞对巨噬细胞极化的影响
  2.1 NK细胞对肺巨噬细胞极化细胞因子表达的影响:磁珠分离纯化同型对照组和NK细胞去除组小鼠肺巨噬细胞(感染后第6天),提取总RNA,实时定量PCR检测TNF-α、IL-6(M1型细胞因子)和IL-10(M2型细胞因子)的mRNA表达。
  2.2 NK细胞对肺巨噬细胞极化标志分子的影响:取纯化的小鼠肺巨噬细胞,实时定量PCR检测M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IRF5)和M2型巨噬细胞标志物(Arg-1、IRF4) mRNA表达;取小鼠左肺下叶,提取肺组织总蛋白,westernblot方法检测iNOS、Arg-1、IRF5和IRF4蛋白表达;根据mRNA和蛋白相对表达水平计算iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值。
  2.3 NK细胞对肺中M1和M2细胞比例的影响:取小鼠肺组织,制备单个核细胞,细胞内染色后,流式细胞术分析M1(CD45+F4/80+iNOS+)和M2(CD45+F4/80+CD206+)型巨噬细胞的比例。
  3.NK细胞调节肺巨噬细胞极化机制
  3.1 NK细胞影响肺巨噬细胞中miR-155和miR-223的表达:实验分组同上,于衣原体感染后第6天处死小鼠,制备肺单个核细胞,磁珠分离纯化肺巨噬细胞,提取小RNA,使用miR-155和miR-223特异性反转录引物将RNA反转录成cDNA,采用实时定量PCR方法检测miR-155和miR-223的表达。
  3.2 NK细胞对miR-155和miR-223相关靶分子表达的影响:提取肺巨噬细胞总RNA,实时定量PCR检测miR-155的靶分子SOCS1和miR-223的靶分子pknox1的mRNA表达。
  研究结果:
  1.衣原体肺部感染中,NK细胞促进肺局部M1,抑制M2型巨噬细胞极化
  1.1肺巨噬细胞纯度:采用anti-F4/80磁珠分离纯化肺巨噬细胞,流式细胞术分析巨噬细胞纯度。结果显示,磁珠分选后,F4/80+CD11b+巨噬细胞比例为96%以上。
  1.2衣原体肺部感染中,NK细胞促进肺巨噬细胞产生M1型极化细胞因子,抑制M2型细胞因子的产生:衣原体肺部感染后第六天,实时定量PCR检测肺巨噬细胞中TNF-α、IL-6(M1型细胞因子)和IL-10(M2型细胞因子)mRNA表达。结果显示,NK细胞去除导致肺巨噬细胞中TNF-α,IL-6表达显著降低,而IL-10表达明显升高。
  1.3衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值降低:采用实时定量PCR和western blot方法检测肺巨噬细胞或肺组织中iNOS、Arg-1、IRF5和IRF4 mRNA、蛋白表达。结果显示,衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致iNOS和IRF5表达略降低,而Arg-1和IRF4表达显著升高,mRNA、蛋白水平结果一致;分别使用mRNA相对表达和蛋白相对灰度值计算iNOS/Arg-1和IRF5/IRF4比值,结果显示,NK细胞去除导致iNO S/Arg-1和IRF5/IRF4比值显著降低,mRNA与蛋白水平结果一致。
  1.4衣原体肺部感染中,NK细胞缺失导致肺中M1型巨噬细胞减少,M2型巨噬细胞增加:采用流式细胞术,分析小鼠肺中M1和M2型巨噬细胞比例。结果显示,衣原体肺部感染后第6天,与同型对照组相比NK细胞去除组小鼠肺中M1型细胞(CD45+F4/80+iNOS+)的比例明显降低,而M2型巨噬细胞(CD45+F4/80+CD206+)比例显著增高。证明,在衣原体肺部感染中,NK细胞可通过调节肺巨噬细胞极化(促进M1型极化,抑制M2型极化),发挥免疫保护作用。
  2.衣原体肺部感染中,miR-155和miR-223参与NK细胞诱导的肺巨噬细胞极化
  2.1 NK细胞去除鼠肺巨噬细胞中miR-155表达降低,miR-223表达升高:实时定量PCR检测衣原体感染后同型对照组和NK细胞去除组小鼠肺巨噬细胞中miRNAs表达。结果显示,衣原体肺部感染后,NK细胞去除导致小鼠肺巨噬细胞中miR-155表达显著降低,而miR-223表达显著升高,miR-155的表达变化与肺中M1型巨噬细胞比例变化一致,而miR-223的表达变化与M2型巨噬细胞一致。证明,在衣原体肺部感染模型中miR-155和miR-223参与了肺巨噬细胞极化过程。
  2.2 NK细胞去除鼠肺巨噬细胞中SOCS1表达升高,pknox1表达降低:实时定量PCR检测以上两组小鼠肺巨噬细胞中,miR-155的靶分子SOCS1和miR-223靶分子pknox1的表达。结果显示,衣原体肺部感染中,NK细胞去除导致SOCS1表达升高,而pknox1表达降低。证明,在衣原体肺部感染模型中,miR-155和miR-223可分别抑制其相应靶分子SOCS1和pknox1的转录,调节肺巨噬细胞极化。
  以上研究为阐明衣原体感染中NK细胞调控肺巨噬细胞极化的作用及其分子机制提供了实验依据。
  研究结论与意义:
  1.在衣原体肺部感染中,NK细胞对肺巨噬细胞的极化具有调控作用,促进肺M1型巨噬细胞极化,抑制M2型巨噬细胞极化,发挥其免疫保护作用。
  2.NK细胞去除导致衣原体感染鼠的肺巨噬细胞中miR-155表达降低(其靶分子SOSC1升高)而miR-223表达升高(其靶分子pknox1降低)。说明,miR-155、miR-223及其靶分子参与了NK细胞诱导的肺巨噬细胞极化过程。
  本研究首次揭示了衣原体肺部感染中NK细胞对肺巨噬细胞极化的正向免疫调节作用及可能机制,并发现miR-155、miR-223及其靶分子SOCS1和pknox1参与了肺巨噬细胞极化的调控。为阐明NK细胞和肺巨噬细胞相互间的免疫调节作用提供了新的实验依据。
[硕士论文] 王国强
动物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类在基因表达过程中具有重要调控作用的非编码RNA,其可通过不同的作用方式参与多种生物学过程。脂肪组织的特异性分泌因子脂联素(Adiponectin)在前体脂肪细胞的分化和机体的正常代谢中发挥着重要的调节作用,其表达受转录及转录后调控;本研究通过生物信息软件预测了转录自脂联素基因反义链上的Adiponectin AS lncRNA的存在,探究了其对小鼠原代前体脂肪细胞分化的作用及机制,并研究了其对小鼠代谢的影响。
  本文首先应运生物软件分析了Adiponectin AS lncRNA的编码能力;通过RT-PCR鉴定了其在小鼠脂肪组织的转录;其次,利用RT-qPCR研究了其在小鼠不同组织和3T3-L1细胞系分化过程中的表达和半衰期;再通过FISH等技术确定了其在细胞中的定位;通过构建Adiponectin AS lncRNA腺病毒过表达载体侵染小鼠原代前体脂肪细胞,利用RT-qPCR、WB、油红O染色等技术研究了其对前体脂肪细胞分化的作用;再利用RPA等技术探究了Adiponectin AS lncRNA的作用机制;最后,利用过表达Adiponectin AS lncRNA的腺病毒注射C57BL/6小鼠,通过GTT、ITT、ELISA、RT-qPCR、TG检测等技术检测了其对小鼠糖、脂代谢的影响。获得的主要研究结果如下:
  1.Adiponectin AS lncRNA在小鼠心脏、肝脏、脾脏、脑、肾脏、肌肉和脂肪中均有表达,其在脂肪、肝脏及脾脏表达量相对较高;在3T3-L1成脂分化过程中,Adiponectin AS lncRNA的表达量随着分化的进行逐渐升高,在分化后期趋于稳定;
  2.Adiponectin AS lncRNA在前体脂肪细胞的核和质中均有分布,成熟脂肪细胞中荧光探针在细胞质中的荧光强度要高于细胞核中的荧光强度,Adiponectin AS lncRNA在脂肪细胞的分化过程中出现了由核到质的转移;
  3.过表达Adiponectin AS lncRNA显著抑制前体脂肪细胞成脂分化,下调成脂标志基因PPARγ、adiponectin和aP2mRNA及蛋白的表达(P<0.05);Adiponectin AS lncRNA与Adiponectin mRNA通过碱基互补配对形成内源性的RNA二聚体,抑制Adiponectin mRNA的翻译;
  4.在高脂饲喂组,用表达全长和非重叠区的Adiponectin AS lncRNA腺病毒处理会降低小鼠的采食量,其脂肪的重量也显著低于对照组(P<0.05);非重叠区Adiponectin AS lncRNA腺病毒处理组与对照组及全长的Adiponectin AS lncRNA腺病毒处理组相比,其葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性更强;处理组小鼠的肝脏、肌肉、血液中甘油三酯的含量要显著低于对照组(P<0.05);处理组血液中的脂联素含量与对照组无显著差异,但处理组血液中瘦素的含量却显著低于对照组(P<0.05)。
  综上所述,Adiponectin AS lncRNA可以与Adiponectin mRNA之间形成RNA二聚体阻止其蛋白翻译,从而抑制前体脂肪细胞成脂分化;Adiponectin AS lncRNA在小鼠活体中的过表达可以抑制脂肪组织的增重,提升其葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性,减少肝脏内甘油三酯含量,促进肝脏内胰岛素受体相关基因的表达。研究结果为探索脂肪沉积的lncRNA调控提供了新的候选基因,也为肉品质性状选育提供了科学依据。
[硕士论文] 吕舜
动物遗传育种与繁殖 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:MicroRNA在脂肪的各个进程中都发挥着重要作用,包括脂肪细胞的增殖、分化以及棕色化。MiR-129-5p是一个重要的肿瘤抑制因子,它对很多癌细胞的增殖具有抑制作用。中南大学关于miRNA的微阵列分析表明miR-129-5p在胰岛素抵抗的3T3细胞中高表达,预示着miR-129-5p可能在脂肪细胞中发挥作用。本文旨在探索miR-129-5p在脂肪细胞增殖、分化及棕色化过程中发挥的作用。
  本文使用miR-129-5p mimic转染3T3细胞系和小鼠原代皮下脂肪细胞,并使用EdU、流式细胞术、CCK-8、油红O染色、Bodipy染色、RT-qPCR、Western blot等技术检测过表达miR-129-5p对脂肪细胞增殖、分化及棕色化的影响。同时构建了miR-129-5p靶基因G3BP1的荧光素酶报告载体,对miR-129-5p调控3T3增殖的机制进行探索。获得的主要结果如下:
  1.在人、小鼠、大鼠等物种间miR-129-5p的成熟序列及种子序列一致;miR-129-5p在小鼠脑、皮下白色脂肪、棕色脂肪中表达较高,且其表达水平在脂肪细胞增殖期间呈下降趋势,在分化期间呈升高趋势。
  2.过表达miR-129-5p可以影响cyclin D及p27等细胞周期相关基因的mRNA及蛋白水平表达;miR-129-5p显著减少了处于细胞周期S期的细胞数目同时显著增加了处于细胞周期G2期的细胞数目并造成G2期阻滞;过表达miR-129-5p在分子水平和细胞水平上显著抑制了3T3前体脂肪细胞的增殖过程。
  3.过表达miR-129-5p显著抑制了G3BP1基因mRNA及蛋白水平的表达;miR-129-5p直接靶定G3BP1基因的3'UTR区域;过表达miR-129-5p显著升高了p38的蛋白水平及磷酸化水平表达;miR-129-5p是通过靶定G3BP1并影响下游p38信号通路发挥其抑制3T3前体脂肪细胞增殖作用的。
  4.过表达miR-129-5p后成脂相关基因PPARγ、CEBPα及aP2的mRNA及蛋白水平的表达没有发生变化;miR-129-5p没有影响脂滴的形成及数量;miR-129-5p过表达不影响脂肪细胞分化过程。
  5.罗格列酮法诱导小鼠脂肪细胞棕色化后棕色脂肪标志基因UCP1及Cidea的表达明显升高。过表达miR-129-5p使棕色脂肪标志基因UCP及PGC1-α的mRNA和蛋白水平表达显著降低;过表达miR-129-5p在分子水平上抑制了脂肪细胞棕色化过程。
  综上所述,miR-129-5p可以通过靶定G3BP1并影响p38通路抑制3T3前体脂肪细胞的增殖过程,同时miR-129-5p可以在分子水平上抑制脂肪细胞的棕色化过程,但对脂肪细胞的分化过程没有影响。该研究结果为脂肪沉积性状的选育以及miRNA对白色脂肪棕色化的调控研究提供了理论依据。
[硕士论文] 李兴
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:HIF-1α即乏氧诱导因子-1α是HIF-1异源二聚体结构的一个亚基。HIF-1是PAS(PER-ARNT-SIM)转录因子家族的成员之一,主要通过与靶基因结合进而调节靶基因的转录来发挥功能。其作用主要集中于介导机体的缺氧缺血等适应性反应。而HIF-1α亚基是HIF-1转录因子的活性调节亚基,它决定了HIF-1转录因子具有活性并行使其功能。血管内皮生长因子(VEGF)是血小板衍生性生长因子家族的成员之一,它被证明具有促进毛囊发育和毛发生长的作用,同时也被证明是HIF-1α的靶基因之一。本实验利用CISPR/Cas9基因打靶系统将HIF-1α基因整合到小鼠Rosa26基因位点上来探讨HIF-1α对毛囊发育等的影响。本实验制作转基因小鼠的方法为原核显微操作技术。利用该方法获得HIF-1α转基因小鼠之后,首先利用PCR来筛选阳性小鼠;之后通过Real-time PCR的方法检测转基因小鼠皮肤组织中HIF-1α、VEGF的mRNA的相对表达量;再通过Western Blot检测转基因小鼠皮肤组织中HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平。
  1、HIF-1α过表达载体的构建及功能的检验
  研究HIF-1α对毛囊发育与生长的关系则需研究HIF-1α与其靶基因VEGF的关系,验证HIF-1α的过表达是否真正引起其靶基因VEGF、eNOS的变化,是否在HIF-1α/VEGF/VEGFR2的信号通路中起作用。
  本实验首先从小鼠基因组中克隆出HIF-1α基因并成功构建了过表达载体。将该载体通过电穿孔转染法成功转入小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)中,通过实时定量PCR的检测,以非转基因MEF为对照组,转基因MEF中基因HIF-1α的mRNA的表达量为对照组的17.91倍,VEGF mRNA的表达量为对照组的15.49倍,VEGFR2 mRNA的表达量为对照组的6.13倍,eNOS mRNA的表达量为对照组的2倍;通过Western Blot的检测,转基因MEF中HIF-1α的蛋白表达量为对照组的2.41倍,VEGF的蛋白表达量为对照组的1.79倍。说明过表达HIF-1α确实引起了其靶基因VEGF,eNOS的上调,也同时引起VEGFR2的上调。
  2、HIF-1α基因定点整合载体的构建
  本实验利用CISPR/Cas9基因打靶系统进行基因编辑,因此需要三个载体:Cas9载体、sgRNA载体以及HIF-1α同源重组载体。本实验选取的靶位点为Rosa26第一内含子1096bp处,由于该位点之前在本实验室已实现过同源重组插入目的基因的先例因此Cas9载体、sgRNA载体直接使用本实验室存留载体。同时通过扩增上游同源臂、人源K14启动子、目的基因HIF-1α并加入合适酶切位点最终成功构建HIF-1α同源重组打靶载体。经过一系列酶切鉴定正确后再经过测序该载体同源性达到100%,因此认定打靶载体构建成功。
  3、定点整合载体相关细胞检测
  本实验主要使用电穿孔转染法将Cas9载体、sgRNA载体以及HIF-1α同源重组载体导入MEF中,培养48h之后提取基因组。本实验筛选出两对引物:一对用来检测目的基因HIF-1α是否成功整合到细胞基因组中即检测随机整合引物;另一对用来检测目的基因是否如预期插入靶位点。以转染后的细胞基因组为模板用以上两对引物进行PCR反应,反应产物条带大小符合预期,经测序正确。以上两对引物可用于后续进行转基因小鼠检验。
  4、转基因小鼠的制备
  本实验主要通过原核注射的方法制备转基因小鼠,该方法首先需要准备注射用外源基因,其次即原核时期受精卵的获得,然后进行注射,最后完成胚胎移植。本实验一共制备了原代小鼠56只,经PCR鉴定其中有2只HIF-1α随机整合阳性小鼠,并未得到定点整合的小鼠。为后期研究HIF-1α基因与毛囊发育的关系构建了转基因小鼠模型和相关实验材料。
  5、HIF-1α转基因小鼠的表达水平检测
  本实验对已筛选出的两只随机整合阳性小鼠661号、664号的皮肤组织进行HIF-1α的表达水平的检测。该实验以同批非转基因小鼠682号为对照,首先通过实时定量PCR进行mRNA水平的检测,以α-tublin为内参基因,检测结果为661号小鼠的HIF-1α mRNA表达量是对照小鼠的7.75倍,VEGF mRNA的表达量是对照小鼠的29.62倍;664号小鼠的HIF-1α mRNA表达量是对照小鼠的3.41倍,VEGF mRNA的表达量是对照小鼠的2.91倍。然后通过Western Blot进行蛋白水平的表达的检测,同样以α-tublin为内参基因,实验结果显示661号小鼠的HIF-1α蛋白表达量是对照小鼠的2.02倍,VEGF蛋白表达量是对照小鼠的1.72倍;664号小鼠的HIF-1α蛋白表达量是对照小鼠的1.84倍,VEGF蛋白表达量是对照小鼠的1.54倍。
[硕士论文] 张卉琴
细胞生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:Wnt信号转导通路在器官的发生、癌症以及多细胞生物体轴分化过程中起着重要作用。本论文主要以红鲫中的GSK3β和Dvl2基因作为研究对象。首先采用RACE克隆技术获得红鲫GSK3β和Dvl2基因的cDNA全长,再分别通过半定量RT-PCR技术和蛋白免疫印记(Western Blot)技术分析GSK3β和Dvl2基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达。最后通过一定浓度的镉处理,比较分析了GSK3β与β-catenin的表达情况。结果显示:
  (1) Dvl2基因全长为3042bp,编码754个氨基酸,预测蛋白分子量约为82360.64,等电点为5.89。Dvl2基因蛋白序列和斑马鱼的相似度是95.3%,与鲤鱼的相似度是97.2%,与小鼠的相似度是68.8%,与非洲爪蟾的相似度是70.5%,与人的相似度是67.3%。揭示了红鲫Dvl2基因在进化中保守性不高。
  (2) GSK3β基因全长为2195bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量约为46846.40,等电点为9.05。比较不同物种氨基酸的同源相似性,GSK3β蛋白序列和斑马鱼的相似度是98.5%,与小鼠的相似度是94.2%,与非洲爪蟾的相似度是92.1%,与人的相似度是94.7%。可以看出相似度比值都较高,表明在进化过程中红鲫GSK3β基因中拥有较高的保守性。
  (3)经过半定量RT-PCR的分析发现Dvl2基因在红鲫8个组织中表达最高的是精巢,表达量排列第二的是眼睛,其中大脑、肌肉、皮肤和卵巢4种组织表达相对持平且较高,肝脏和肾脏中的表达相对较低。GSK3β基因在红鲫8个组织中表达最高的是眼睛,其次分别是大脑和肌肉,其余四个组织中,精巢组织和卵巢组织相对持平且较高,表达量相对较低的依次为肝脏、肾脏、皮肤组织。在红鲫不同胚胎时期的mRNA表达水平层面,Dvl2基因表达最强时期为体节期,按表达强度排列依次为肌效期、出膜期、神经胚期、囊胚期,眼色素时期、体色素时期表达较低,两细胞时期基本没有表达。GSK3基因表达最强在出膜期,按表达强度依次排列为肌效期、囊胚时期、神经胚期、体节期、眼色素、体色素、两细胞期。其中眼色素期和体色素期表达液相对较低,表达最低的为两细胞期。
  (4)通过Western Blot技术分析得出:Dvl2和GSK3β蛋白在红鲫组织中特异性表达,并且表现出一定的组织差异性。Dvl2和GSK3β在红鲫肾脏中表达最低,其次在肝脏中。GSK3β蛋白在大脑中表达最高,其次是肌肉,在肾脏、肝脏和精巢中基本没有表达。而Dvl2在精巢中表达最高,眼睛次之,在肾脏中表达最低。Dvl2和GSK3β在胚胎的不同发育时期中也出现差异表达模式,两者都在两细胞时期表达最低,在出膜时期表达最强。在眼色素期Dvl2较GSK3β表达高,神经胚期和肌肉效应期中GSK3β较Dvl2表达高,在囊胚期、体节期和体色素期表达相近。
  (5)通过利用一定浓度的镉处理后的二倍体红鲫和三倍体湘云鲫在mRNA水平上均出现不同程度的GSK3β表达降低,β-catenin表达上调,可见GSK3β在镉胁迫下可能行使特定的生物学功能,但其具体生物学机制仍有待进一步研究。
  以上结果为我们研究低等脊椎动物中Dvl2和GSK3β基因在Wnt信号转导通路中的具体调控机理以及其对镉胁迫应答的分子机制研究奠定了重要的基础。
[硕士论文] 骆瑜蓉
细胞生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:观赏鱼因其绚丽多彩的体色深受欢迎,而色素细胞的形成、分化及迁移等决定了其体色的发生。红鲤和红鲫体表呈橙红色,具有观赏价值且易养殖。观察发现,红鲤从胚胎到成体,体表都没黑色素细胞;然而红鲫在胚胎期有黑色素细胞的发生,1月龄前体表为青灰色,3月龄后通体变为橙红色;而红鲤和红鲫的杂交后代即鲫鲤杂种,在胚胎期就有黑色素细胞的发生,青灰体色一直保持为成体体色。在本课题中主要以红鲤、红鲫及其杂种为材料,旨在探讨导致红鲤、红鲫及其杂种体色差异形成的发育机制。具体研究结果如下:
  1.分别对红鲤、红鲫自交后代及红鲫和红鲤杂交后代的幼苗、成体中部侧线鳞片和远端尾鳍进行色素细胞种类、分布、数量的显微观察。红鲤幼苗及成体中部侧线鳞片和远端尾鳍未观察到黑色素细胞;红鲫幼苗体表含有黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞,而成体的中部侧线鳞片和远端尾鳍仅观察到红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞;而红鲫与红鲤的杂交后代,不管是幼苗还是成体的侧线鳞片和远端尾鳍,都含有黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞;
  2.结合RT-PCR技术,检测了黑色素干细胞标记基因mitfa,黑色素细胞标记基因tyrp-1和dct,黄色素细胞标记基因fms及虹彩细胞标记基因foxd3和ltk在红鲤、红鲫及其杂种体色素期胚胎和成体皮肤中的表达情况。结果表明,在三种鱼的体色素期胚胎和成体皮肤中均检测到fms、foxd3、ltk的表达;黑色素干细胞标记基因mitfa在三种鱼的体色素期胚胎和成体皮肤均表达,但黑色素细胞标记基因tyrp-1和dct在红鲤体色素期胚胎、红鲫和红鲤成体皮肤中没有或极弱表达。
  3.对红鲤体色素期胚胎和成体皮肤中检测到的mitfa基因进行测序,与Genbank已发表的锦鲤mitfa基因序列进行比对,完全一致,这表明mitfa在红鲤中确实有表达;
  4.以红鲤、红鲫及其杂种体节期和体色素期胚胎为材料,分离胚胎细胞并进行体外培养,在经多次传代后的红鲫、鲫鲤杂种的胚胎培养细胞中观察到黑色素样细胞;
  5.RT-PCR检测在体外培养的红鲤、红鲫及其鲫鲤杂种胚胎细胞中mitfa及其他色素相关功能基因的表达,结果表明mitfa、tyr、dct、fms、foxd3和ltk在体外培养的红鲤、红鲫及其杂种胚胎细胞中均有表达;
  6.利用构建的mitfa-EGFP质粒,对红鲤、红鲫及其杂种胚胎的培养细胞进行转染实验,均观察到mitfa+细胞,且这些mitfa+细胞能够传代培养。
  综上所述,本文研究表明,mitfa、tyrp-1、dct、fms、foxd3和ltk等色素细胞发育相关基因参与了红鲤、红鲫及其杂种体色形成和体色发育的调控。值得关注的是,黑色素干细胞标记基因mitfa在无黑色素表型的红鲤胚胎及红鲤和红鲫的成体皮肤中均有表达,显示mitfa基因可能还参与了非黑色素细胞的分化和发育调控。离体培养的红鲤、红鲫及其杂种胚胎细胞中均检测到mitfa+细胞,且mitfa、tyr、dct、fms、foxd3和ltk在红鲤、红鲫及其杂种胚胎的培养细胞均有表达,证实体外培养胚胎细胞中含有的色素干细胞具有分化形成不同色素细胞的潜能。相关研究成果为深入解析鲤、鲫体色发育机制奠定了理论基础和技术平台。
[博士论文] 曹冬冬
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:免疫系统分为天然免疫系统和适应性免疫系统。天然免疫在进化上从昆虫到哺乳动物都是保守的,其主要通过模式识别受体来识别抗原。一般认为,适应性免疫只在脊椎动物中存在。近来发现,在脊椎动物中存在着两种不同的适应性免疫系统。一种存在于从软骨鱼到哺乳动物的有颌类脊椎动物中,由免疫球蛋白家族的B淋巴细胞受体(BCR)、T淋巴细胞受体(TCR)来识别抗原,并激活免疫反应;另一种只存在于无颌类脊椎动物中,由Leucine Rich Repeat(LRR)模块组装成可变淋巴受体(VLR)来识别抗原。这两种免疫识别受体都具有高度多样性,可以识别任何入侵的病原体和/或毒素。无颌类脊椎动物VLR的发现标志着适应性免疫起源于5亿年前的原始脊椎动物祖先。
  头索动物文昌鱼在进化上处于无脊椎动物和脊椎动物的过度阶段,是研究脊椎动物起源的重要模式生物。前期研究中,已经在文昌鱼中发现一些基于TCR/BCR的适应性免疫系统的基本组成成分的同系物。但是,近期在无颌类脊椎动物发现的基于VLR的适应性免疫系统组成成分是否也在文昌鱼中存在尚不清楚。
  我们通过生物信息学分析从弗罗里达文昌鱼的数据库中发现了近10个可能的VLR样蛋白,并成功解析了其中之一的Bf66946蛋白的1.79(A)分辨率晶体结构。其整体结构呈新月形,由5个富含亮氨酸和异亮氨酸的LRR模块组成。基于结构分析,我们发现Bf66946与七鳃鳗VLRC的结构具有相同特征。进一步的表面电势分析显示,在Bf66946的新月形结构的凹面(对应于七鳃鳗VLR的抗原识别位点)有一块酸性区域。基于点突变和细菌结合实验,证明Bf66946特异性识别革兰氏阳性菌肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌,而且结合位点位于凹面酸性区域。此外,Bf66946在白氏文昌鱼中的同源蛋白Bb24355在类免疫器官咽鳃裂的显著性表达也暗示Bf66946是一种免疫相关蛋白。
  综上所述,我们在文昌鱼中鉴定了第一个VLR样蛋白,暗示基于VLR的适应性免疫系统组成成分的雏形分子在脊索动物文昌鱼已经出现,为适应性免疫的起源与演化提供了重要参考。
[硕士论文] 李文香
水生生物学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:捕食者存在时,猎物常常会产生一系列形态学和行为学方面的变化来抵御捕食者的捕食。然而,极少有研究关注捕食者对猎物体内生理应激和生化组成的影响。化学生态计量学理论预测:暴露于捕食风险下的猎物个体将会产生一系列的生理反应,包括糖异生、增加呼吸作用、加速体内N、P元素的排泄,从而导致猎物体内的C:N、C:P的增加。此外,捕食者会迫使猎物启动逃逸行为,进而增加新陈代谢速率,导致氧化胁迫的增加,从而诱发体内的抗氧化防御过程。因此,在本研究中我们用植食性萼花臂尾轮虫( Brachionus calyciflorus)和捕食性卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwellii)验证以下三个假说:在晶囊轮虫捕食风险下,萼花臂尾轮虫体内的C:N、C:P将会显著提高;在晶囊轮虫的捕食风险下萼花臂尾轮虫体内的抗氧化酶活性将显著提升,同时反应氧化损伤程度的丙二醛(MDA)含量也会显著提高;晶囊轮虫捕食风险可诱导萼花臂尾轮虫的元素计量比发生改变,表现为C:N、C:P升高,因而对低氮、低磷的食物有更好的适应性。此外,由于防御体型需要消耗能量,而低氮、低磷的食物质量较低,提供的能量较少,因而萼花臂尾轮虫的防御体型可能在一定程度上被抑制。
  本研究主要内容包括:⑴当萼花臂尾轮虫暴露于晶囊轮虫捕食风险下时将会产生防御型体型,表现为侧棘刺的长度增加。与此同时与未暴露于捕食风险下的萼花臂尾轮虫相比暴露于捕食风险下的萼花臂尾轮虫体内的碳的百分含量(C%)显著升高,氮和磷的百分含量(N%和P%)显著降低,C:N、C:P均显著提高。这说明萼花臂尾轮虫在捕食风险下产生防御体型的同时体内的C: N、C: P也会显著升高。⑵萼花臂尾轮虫暴露于晶囊轮虫释放的化学信息素下,没有启动逃逸行为来躲避捕食,游动速度与未暴露于晶囊轮虫释放的信息素下的个体差异不显著,但是会导致氧化胁迫的增加,诱发体内的抗氧化防御过程,使其体内抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性显著升高,同时反应氧化损伤程度的丙二醛(MDA)含量显著降低。⑶萼花臂尾轮虫喂食不同质量的食物(正常氮磷、低氮、低磷)结果为低氮、低磷食物对种群增长率和繁殖率起抑制作用,低磷食物起主要的抑制作用,但是在捕食风险下萼花臂尾轮虫由于体内C:N、C:P的升高,在低氮、低磷食物条件下有较好的适应性,其种群在增长率和繁殖率与未暴露于捕食风险下的萼花臂尾轮虫差异不显著,且生命周期被显著延长。捕食风险是影响萼花臂尾轮虫防御形态的最主要因素,低氮、低磷食物无论在有无捕食风险都促进了防御体型的形成,低氮食物显著促进萼花臂尾轮虫侧棘刺的延长。本研究结果表明在捕食者存在时猎物会产生一系列生理生化响应以应对捕食风险。
[博士论文] 杨磊
动物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)是指将体细胞核注入到去核的卵母细胞质中获得重构胚(Reconstructed embryo),由重构胚最终发育为后代的技术。细胞的重编程能够通过核移植、细胞融合、特定转录因子以及培养条件诱导等方法来实现。但是目前唯一能够诱导细胞重新发育成个体的重编程方法只有体细胞核移植,其他方法只能够在细胞、分子或者生化的水平上产生诱导,并且都存在一些不足之处。但是,自从体细胞核移植技术建立以来,克隆效率一直处于较低的水平,只有很少的重构胚胎能够发育到足月出生,在小鼠中通常只有1~2%的出生率。而且大多数克隆小鼠在出生后不久就会死亡。成功出生的克隆小鼠也会出现胎盘巨大、胎儿过度生长等异常症状,即所谓的“胎儿巨大症”。造成这一现象的主要原因是供体细胞核不能够被完全的重编程(Reprogramming)所致。重编程主要指的是表观遗传修饰(Epigenetic modification)的擦除与重建,主要包括DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、基因组印记的重建、X染色体的复活与失活以及端粒长度的再延伸等修饰的动态变化。
  H3K27me3组蛋白去甲基化酶KDM6A/B(Lysine specificdemethylase6A/B)发现于2007年,与之相关的研究主要集中在去甲基化的生化机理方面,研究KDM6A/B在核移植重构胚发育中的作用还未见报道。
  在本研究中,首先建立了一套可行的小鼠克隆技术方案。利用卵丘细胞、胎儿的成纤维细胞和胚胎干细胞等3种细胞构建了重构胚,比较了这3种重构胚在不同激活液中的激活效率、不同培养液中的发育效率和不同胚胎移植方法的妊娠效率等。结果表明,1)Ca2+-free KSOM激活液是通用的高效激活液,激活效率在93.5%左右;2) KSOM-AA培养液适合于卵丘和胚胎干细胞重构胚的体外培养,而胎儿成纤维重构胚的最佳培养液为αMEM培养液;3)当重构胚体外发育至2-细胞时期,经输卵管双侧移植,每侧移植15枚胚胎可高效获得核移植动物。
  其次,对小鼠孤雌不同时期的胚胎进行H3K27me3修饰情况进行检测,在小鼠8-细胞和桑椹胚中,检测不到H3K27me3的修饰;在着床前胚胎中,KDM6A、KDM6B表达量很高,但8-细胞时期胚胎中检测不到KDM6A的蛋白;在着床前胚胎中,KDM6A、KDM6B在mRNA及蛋白质水平上存在着功能代偿现象;降低KDM6B的表达量,有助于提高胚胎的囊胚率和囊胚质量(95.1% vs.84.3%,P<0.05)。
  最后,通过干扰KDM6B提高了核移植胚胎干细胞的建系效率,而且得到的si6B-ES的多能性明显要好于野生型ES细胞。通过以上的优化,最终将克隆小鼠的出生率提高近6倍。
[博士论文] 黄聪
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:间充质干细胞(MSCs)是具有不断自我更新和多向分化潜能的基质细胞。在特定的诱导条件下,这些细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。因此,在细胞再生医学上具有重要的临床意义。然而,调控间充质干细胞命运(细胞增殖、分化、凋亡)的分子机制尚不明确。miRNAs是内源性长度约为22 nt的单链RNA分子,通过靶向基因3'UTR调控其表达。近期研究表明,miRNAs参与调控多种生理生化过程,其中包括细胞增殖、分化以及凋亡。miR-144-3p是一个典型的癌症抑制因子且参与多种癌症或肿瘤细胞的增殖调控。然而,截止目前,还没有关于miR-144-3p调控间充质干细胞增殖与分化的文献报道。因此,本研究主要通过功能“获得”和“缺失”、双荧光素酶报告基因检测、荧光定量PCR、Western blotting、实时细胞分析以及流式细胞等方法对miR-144-3p在间充质干细胞增殖、分化以及凋亡过程中的作用进行了研究,主要研究结果如下:
  1.miR-144-3p对间充质干细胞成骨分化的调控作用
  在小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,成骨分化标志基因(Runx2、OCN和Osx的表达量逐渐升高。而miR-144-3p的表达量则逐渐降低,到诱导成骨21d的时候达到最低。这表明miR-144-3p可能参与调控小鼠间充质干细胞成骨分化过程。将miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成骨分化。结果发现miR-144-3p mimics转染组细胞成骨分化显著受到抑制,ALP以及茜素红染色和定量结果均显示:miR-144-3p mimics转染组细胞ALP活性降低、钙结节形成受到抑制。另外,qRT-PCR和Western blotting结果也表明:miR-144-3pmimics转染组细胞成骨分化标志基因Runx2、OCN以及Osx的表达量显著下降。相应地将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染C3H10T1/2细胞,然后诱导成骨分化,结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。因此,miR-144-3p抑制C3H10T1/2细胞成骨分化。
  通过多种靶基因预测软件预测发现:Smad4可能是miR-144-3p的靶基因。双荧光素酶报告试验、qRT-PCR、Western blotting进一步证实,miR-144-3p直接靶向Smad43'UTR,且在转录后水平抑制其表达。
  进一步研究靶基因Smad4功能发现:①在C3H10T1/2细胞中超表达Smad4能够促进其成骨分化,而抑制Smad4表达则会抑制C3H10T1/2细胞成骨分化。②在C3H10T1/2细胞中,通过si-Smad4抑制Smad4表达将会阻断miR-144-3p inhibitor对于C3H10T1/2细胞成骨分化的促进作用。这也进一步表明,Smad4作为miR-144-3p的靶基因,是连接miR-144-3p与C3H10T1/2细胞成骨分化的桥梁。因此,miR-144-3p是通过靶向调控Smad4来抑制C3H10T1/2细胞成骨分化的。
  2.miR-144-3p对间充质干细胞成脂分化的调控作用
  在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中,成脂分化标志基因(C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ以及AP2)的表达量逐渐升高,而且miR-144-3p的表达量也随着成脂分化过程逐渐升高,到诱导成脂8d的时候达到最高。这表明miR-144-3p可能参与调控小鼠间充质干细胞成脂分化过程。将miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成脂分化。结果发现,miR-144-3p mimics促进细胞成脂分化。miR-144-3p mimics转染组油红O染色结果比阴性对照组要显著升高,同时成脂分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ以及AP2的表达量也明显升高。相应地,我们将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成脂分化,结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。这些结果表明:miR-144-3p促进C3H10T1/2细胞成脂分化。
  通过多种靶基因预测软件预测发现:bmp-3b可能是miR-144-3p调控成脂分化过程中靶向的基因。双荧光素酶报告试验、qRT-PCR、Western blotting进一步证实,miR-144-3p直接靶向bmp-3b的3'UTR,且在转录以及转录后水平抑制其表达。
  3.miR-144-3p对间充质干细胞增殖和凋亡的调控作用
  将miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后通过实时细胞分析仪监测细胞增殖情况。结果发现,miR-144-3p mimics显著抑制细胞增殖。相应地,将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,实时细胞分析结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。通过流式分析进一步证实了miR-144-3p对C3H10T1/2细胞增殖的负调控作用:在转染了miR-144-3p mimics后,G0/G1期细胞显著增多,而S期细胞显著减少,这表明miR-144-3p mimics会阻滞C3H10T1/2细胞于G0/G1期;而转染miR-144-3pinhibitor则得到相反的结果。因此,miR-144-3p通过阻滞C3H10T1/2细胞于G0/G1期,抑制C3H10T1/2细胞增殖。
  已经证实,miR-144-3p靶向抑制Smad4基因。进一步研究靶基因Smad4功能发现:①在C3H10T1/2细胞中超表达Smad4能够促进其增殖,而抑制Smad4表达则会抑制C3H10T1/2细胞增殖。②在C3H10T1/2细胞中共转染si-Smad4与miR-144-3pinhibitor, miR-144-3p inhibitor对于C3H10T1/2细胞增殖的促进作用消失。这也进一步表明,miR-144-3p通过靶向调控Smad4抑制C3H10T1/2细胞增殖。为探究miR-144-3p对于C3H10T1/2细胞凋亡的影响,我们将miR-144-3p mimics(或者是miR-144-3p inhibitor)转染到C3H10T1/2细胞中,通过流式分析转染后细胞凋亡情况。结果发现,miR-144-3p mimics和miR-144-3p inhibitor都不影响C3H10T1/2细胞凋亡。同时,我们检测凋亡相关蛋白的表达发现miR-144-3p也不影响凋亡相关蛋白的表达。因此,推断miR-144-3p对间充质干细胞凋亡不起作用。
  综上所述,本研究的结论是:①miR-144-3p通过靶向Smad4抑制C3H10T1/2细胞成骨分化,Smad4基因促进C3H10T1/2细胞成骨分化过程;②miR-144-3p通过靶向bmp-3b促进C3H10T1/2细胞成脂分化;③miR-144-3p通过靶向Smad4抑制C3H10T1/2细胞增殖,Smad4基因促进C3H10T1/2细胞增殖过程;④miR-144-3p不影响C3H10T1/2细胞凋亡。
[硕士论文] 王师
细胞生物学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:研究背景:抗体作为一种特异性强、安全性高、效果显著的药物,在肿瘤等多种疾病的临床治疗中发挥重要作用。在多种抗体制备技术中,抗体库技术是最常用的技术之一。活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase AID)参与B细胞受体亲和力成熟,促进并诱导免疫球蛋白可变区的突变,在抗体体内成熟过程中发挥重要作用。文献报道,在抗体库中引入 AID酶,有助于提高抗体库库容。因此,AID酶与抗体库技术相结合的抗体筛选技术成为当前抗体筛选的一个研究热点。
  免疫负调控的共刺激信号通路 PD-1/PD-L1在肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要的作用,PD-1、PD-L1并成为肿瘤免疫治疗的新靶点。抗PD-1/PD-L1的抗体药物也成为了新的研究热点。
  目的:在课题组前期搭建的“哺乳动物细胞展示抗体库技术”基础上,本研究以PD-1为靶点,将抗体库技术与 AID酶诱导抗体基因体外进化成熟相结合,借助流式细胞分选技术,探讨了一种高通量的抗体筛选新方法。
  方法:通过IMGT获得抗PD-1抗体Nivolumab的可变区氨基酸序列,合理考察密码子偏性的前提下进行反向翻译获得可变区基因序列;通过全合成制备 Nivolumab的轻重链基因,并克隆入 pFRT-IgG1载体中进行表达,全抗体命名为 MIL75。将 MIL75抗体 Fab片段克隆至 pFRT-FTMK载体上,该载体在抗体 Fab片段的重链 C末端偶联了 PDGFR-α跨膜区,使抗体Fab片段能够展示在细胞膜上。通过真核细胞转染技术将载体转染到CHO-K1-FRT细胞中并筛选稳定表达细胞株,进一步将含有AID酶基因的载体转染至稳定表达细胞中。利用FITC标记的PD-1抗原(PD-1-FITC),通过流式分选的方法筛选高亲和力的抗体。将富集到的细胞提取基因组,调取抗体基因经测序并克隆到全长抗体表达载体 pFRT-IgG1上进行表达。随后对筛选得到的抗体进行了初步功能评价:(1)利用 ELISA和 Biacore的方法评价了抗体与抗原结合的特异性和亲和力;(2)针对筛选获得的高亲和力抗体,借助混合淋巴细胞反应实验,通过检测 T细胞分泌 IFN-γ的水平来评价抗体激活 T细胞的功能;(3)在免疫缺陷 NPG小鼠中输注人 PMBC,构建 GVHD模型,进一步给予抗 PD-1抗体,通过免疫排斥反应的强弱评价抗体体内生物学活性。
  结果:(1)将全合成的抗体可变区基因分别克隆入载体 pFRT-IgG1以及 pFRT-FTMK中,成功构建MIL75全长抗体表达载体 pFRT-IgG1K-MIL75以及Fab抗体细胞膜展示载体 pFRT-FTMK-MIL75Fab。pFRT-IgG1K-MIL75稳定转染 CHO-K1-FRT细胞后,经过加压筛选,获得了 MIL75全长抗体稳定表达细胞株。ELISA结果表明,表达的 MIL75抗体可以特异性、高亲和力识别 PD-1抗原。pFRT-FTMK-MIL75Fab稳定转染稳定转染 CHO-K1-FRT细胞后,经过加压筛选,获得稳定表达 MIL75-Fab的细胞株。流式细胞术检测结果显示,MIL75-Fab成功展示在 CHO-K1-FRT细胞表面,且能与抗原 PD-1的特异性结合并具有浓度依赖性;进一步转染入 AID酶诱导突变。(2)经流式筛选及计算机序列比对分析后获得三条新的抗体序列,分别为 Fv56、Fv60、Fv70。(3)体外结合实验表明Fv56、Fv60、Fv70三株抗体均能够与靶抗原PD-1特异性结合;其中,Fv56、Fv60识别的表位与 MIL75相同;Fv70识别的表位发生了漂移。抗体 Fv56、Fv60在体外能够特异性阻断 PD-1与 PD-L1相互作用。进一步的生物学功能实验表明:Fv56、Fv60与母本抗体 MIL75具有相似的生物学活性,均能够激活T细胞,上调 T细胞分泌 IFN-γ,并具有一定的抗体浓度依赖性;而 Fv70只在高浓度下对 T细胞具有激活功能。(4)体内生物学功能实验结果显示抗体 Fv56能够激活人源化小鼠体内的T细胞,加剧免疫排斥反应,缩短了小鼠的生存时间。
  结论:本研究将哺乳动物细胞展示技术与 AID酶诱导抗体亲和力成熟相结合,建立了一种能够快速有效进行体外抗体进化的筛选技术。并以 PD-1为靶点,通过这种方法筛选得到了三株新的抗体 Fv56、Fv60和Fv70;其中Fv56、Fv60两株抗体具有良好的T细胞激活功能,其生物学活性与母本抗体MIL75相似。
[硕士论文] 程雨卉
海洋生物学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本文通过线性连续梯度非变性电泳结合邻苯二酚发色法分离纯化了光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)体腔液上清中的酚氧化酶(PO)。结果显示:光棘球海胆体腔液上清中存在3种PO,在聚丙烯酰胺凝胶中与邻苯二酚反应分别呈现褐色、黄色和紫色,根据其分子质量从高到低依次命名为SnPO1,SnPO2和SnPO3。分析研究了PO的最适温度和pH、底物特异性、动力学参数、金属离子和抑制剂对酶活的影响。结果显示:光棘球海胆PO可有效氧化左旋多巴(L-DOPA)、多巴胺和对苯二酚,但不能氧化酪氨酸,表明该酶可催化邻二酚和对二酚类底物而不能催化单酚类底物,属于漆酶型酚氧化酶;SnPO1,SnPO2和SnPO3的最适温度分别为75℃、70℃和40℃,最适pH分别为7.0、9.0和8.0;光棘球海胆PO在沸水中孵育60min后活力显著增强表明SnPO1,SnPO2和SnPO3是嗜熱的;SnPO1活力可被Cu2+、Mn2+和Fe2+显著增强,被Pb2+、Cd2+、EDTA、DETC、亚硫酸钠和抗坏血酸抑制,而SnPO2和SnPO3却受Pb2+和Cd2+影响不大,表明这三种酚氧化酶是含铜的,并且SnPO1与SnPO2和SnPO3的活性中心可能不同。上述结果表明,SnPO1,SnPO2和SnPO3可能在光棘球海胆的免疫和生理过程中起不同的作用。
  本研究通过生长曲线测定法进行了光棘球海胆PO氧化产物的抗菌特性分析。结果显示:以多巴胺为底物时,SnPO1的氧化产物对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有抗菌作用,SnPO2氧化产物对哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌和拟诺卡式菌(Nocardiopsis sp.)有抗菌作用,SnPO3氧化产物仅对哈维氏弧菌和拟诺卡式菌有抗菌作用;以左旋多巴为底物时,仅SnPO2氧化产物对拟诺卡式菌有抗菌作用;光棘球海胆 PO氧化产物对假交替单胞菌( Pseudoalteromonas nigrifaciens)、希瓦氏菌(Shewanella baltica)和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)的生长无明显影响。上述结果表明,在光棘球海胆中,PO氧化产物具有窄谱抗菌活性,多巴胺氧化产物的抗菌活力高于左旋多巴氧化产物,并且不同 PO亚型的氧化产物具有不同的抗菌谱和抗菌特性。
[硕士论文] 朱鸶
海洋生物学 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:本研究根据建立的生物体内总脂(TLs)的精确结构鉴定方法,利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-质谱联用分析系统(UPLC-Q-TOF-MS)对海蜇头部、伞部和柄部的总脂进行定性和定量研究。从海蜇的三个部位总共鉴定出10大类87种脂质,包括磷脂酰胆碱(PC),溶血磷脂酰胆碱(LPC),磷脂酰乙醇胺(PE),溶血磷脂酰乙醇胺(LPE),磷脂酰肌醇(PI),溶血磷脂酰肌醇(LPI),磷脂酰丝氨酸(PS),神经酰胺(Cer),神经酰胺氨乙基亚磷酸(CAEP)和甘油三酯(TAG)。其中,甘油磷脂类(GPLs)是海蜇各个部位中含量最多的脂,占了总脂含量的54-63%。进一步分析其酰基组成发现,这些甘油磷脂中富含大量的高度不饱和脂肪酸(HUFAs),因此,我们认为海蜇具有较高的营养价值,可以加工制成保健品或者一些经济鱼类和甲壳类的辅助饲料。同时,通过实验我们还发现海蜇头部中LPC,LPE和LPI的含量明显高于伞部和柄部的,这很可能与海蜇头部中较高含量的磷脂酶A2(PLA2)有关。此外,海蜇头部中CAEP的含量也明显高于伞部和柄部的,CAEP可以保护细胞免受自身PLA2的水解作用。相反的是,海蜇头部总脂中TAG的百分含量(8.3%)却低于伞部(18.6%)和柄部的(25.2%),这可能与头部的摄食功能和运动功能有关。
  本文运用建立的脂类代谢物的分析方法对2种水母(海月和海蜇)和4种普通饲料中的脂质进行测定。结果表明,Cer和CAEP只在水母中检测到,并且sn-1位上是C17不饱和脂肪酸的PC,LPC,PE和LPE在水母中的含量也远远高于普通饲料中的,而sn-1位上是C16:0脂肪酸的PC和 LPC却主要从普通饲料中检测出来。此外,普通饲料中TAG和二酰甘油(DAG)的含量也远高于水母中的。为了了解水母中脂质组成对银鲳生长发育潜在的特别功效,对不同饲料对银鲳脂类代谢物的影响进行了研究。初步的脂质组学研究表明,经过15d培养,实验组银鲳体内PC(尤其是酰基链为C16:0的PC),DAG和TAG均呈现减少的趋势;而鞘磷脂(SM)却呈现增加的趋势。实验组银鲳和对照组银鲳中脂质代谢物的差异反应了它们生长过程中经历不同的生化过程,研究这些变化为银鲳的人工养殖和饲料开发提供了重要的依据。
[硕士论文] 王海宏
生物化学与分子生物学 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:刺参(Apostichopus japonicus)又称仿刺参,属于棘皮动物门、海参纲,是一种高蛋白、低糖、低脂肪、无胆固醇的重要的养殖经济水产动物。温度是影响刺参生长、发育、繁殖的最主要环境因子之一,当海水温度升高到一定范围(20-25℃)后,刺参出现摄食停止、活动降低、消化道退化、体质量减轻、代谢速率降低等特征,处于夏眠状态。因此,开展高温胁迫条件下,刺参内在精细分子机制,特别是高温胁迫下磷酸化蛋白的研究,对刺参养殖业的健康发展具有重要的实践意义。
  本研究主要内容包括:⑴在刺参高温刺激168小时的体腔液中,我们共鉴定了55不同的磷酸化蛋白,其中43个磷酸化蛋白符合 FDR<1%,并进行后续的差异表达分析。与对照组相比,有16个磷酸化蛋白存在差异表达,其中11个磷酸化蛋白含量下降,4个磷酸化蛋白含量上升。值得注意的是,我们发现一些与代谢相关的蛋白在高温下磷酸化水平发生了变化,例如 IV型胶原α3结合蛋白,N酰基磷脂酰乙醇胺磷脂酶 D,NDRG1蛋白、p44/42MAPK等。另外,有3个分子伴侣的表达在25℃时都上升,它们分别是蛋白二硫异构酶,葡萄糖调节蛋白78和热休克蛋白90。通过Western blot进一步分析 p44/42MAPK的空间表达情况,结果表明 p44/42MAPK存在于刺参的体腔液,肠,肌肉和呼吸树。然而 p44/42MAPK的磷酸化蛋白只存在体腔液和肌肉中。对 p44/42MAPK和下游分子 p90RSK的表达模式分析发现,急性升温下,他们的磷酸化水平在高温组受到抑制。而在高温持续阶段,p44/42MAPK和下游分子 p90RSK的表达模式相对一致,都出现前期上调表达,后期下降甚至抑制的现象,并且不同组织表达模式有所区别。
[博士论文] 夏长革
水产养殖 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:水生动物的体色变化是一种令人着迷的生物学现象。仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka),作为一种具有巨大经济价值的海洋棘皮动物,也存在着体色变化的现象。不同体色的仿刺参不仅影响它们的口味,还影响它们的市场价格。在我国海区常见的仿刺参体色是青色,而全白仿刺参在自然海区较为少见,但在养殖场中则是一种相对常见的体色变种。所以,全白仿刺参被视为“珍品”海参,具有巨大的经济开发前景。为了进一步研究全白仿刺参的白化机理、培育具有优良生产性状的仿刺参品系,本文以人工养殖的全白仿刺参与青仿刺参为实验材料,运用相对与绝对同位素同重标记定量技术(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)结合液相色谱—串联质谱联用技术,我们分析了全白仿刺参与对照组青仿刺参的肠道、体壁中蛋白质表达情况。利用实时荧光定量PCR技术对实验所得到的部分差异蛋白质进行了其对应的mRNA的表达水平分析。从蛋白质组学层面上探讨了全白仿刺参与常见的青仿刺参之间的蛋白质表达差异,为仿刺参遗传育种奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴鉴定到549个蛋白质,这些蛋白质在两种体色的仿刺参肠道、体壁组织中均有表达。搜索COG数据库,对上述蛋白质进行功能注释,结果485个蛋白质具有明确的功能注释。⑵与青仿刺参相比,全白仿刺参共有28种蛋白质表现为差异表达,其中肠道中12种,上调/下调蛋白数均为6;体壁中有16种差异表达蛋白,上调和下调差异蛋白数量均为8。表达量变化最显著的差异蛋白质有:组蛋白酶 L-相关蛋白(Cathepsin L-associated protein),热应激蛋白90(HSP90),黑素转铁蛋白(melanotransferrin),补体蛋白 C3-2(complement componentC3-2),热应激蛋白 gp96(HSP gp96),调钙素(calmondulm)和补体蛋白C3(complement component C3)。GO功能分析显示:在肠道中有67%的蛋白集中在分子功能(molecular function)上,而在体壁中则为52%。⑶对差异蛋白质进行 KEGG分析发现:肠道组和体壁组各有1种蛋白质可以找到代谢路径,即Ca2+转运ATP酶(Ca2+transporting ATPase)和40S核糖体蛋白S3e-样蛋白(40S ribosomal protein S3e-like);前者可能参与钙离子信号传递功能或分泌功能,后者可能参与蛋白质的合成。⑷利用STRING数据库对全白仿刺参差异表达蛋白质进行了蛋白-蛋白之间的作用网络分析,体壁中的翻译延长因子(translation elongation factor)、40s核糖体蛋白 S3(40S ribosomal protein S3-like)、60s核糖体蛋白L32e(60S ribosomal protein L32e)之间相互作用关系,参与细胞内蛋白质的生物合成,相互作用较强。另一是α-中心体肌动蛋白-样蛋白(alpha-centractin-like)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain)等之间的相互作用,但是相互作用力较弱。⑸采用实时定量PCR技术,以18S RNA为内参,对白仿刺参的16个差异表达蛋白质进行了其对应的mRNA表达水平的相对定量分析,并与蛋白质自身的表达情况进行了比较,结果表明:16个 mRNA的表达量与其对照相比均呈显著差异。在所选的16个差异蛋白质中,12个差异蛋白质表达水平与其mRNA表达水平的变化趋势是相同的,即均是上调表达;只有4个蛋白质的表达水平的变化趋势与其mRNA的表达水平的变化趋势是不一致的,出现了差异。
[硕士论文] 宋太玉
细胞生物学 山东师范大学 2016(学位年度)
摘要:通常情况下,人体的免疫力随着年龄的增长而降低。具体表现为:人体对病原微生物的抵抗力下降、对疫苗的应答能力降低、易患各种感染性疾病和自身免疫疾病等。研究增龄过程中免疫力下降的机制,对于提升老年人生活质量,实现健康的老龄化以及减轻老年人带来的社会负担都具有重要意义。
  在进化过程中,鱼类最早出现的免疫系统与人类类似的免疫系统,已经具备基于T淋巴细胞、B淋巴细胞和IgM抗体的适应性免疫系统。假鳃鳉属(Nothobranchius)是源于非洲大陆的一年生硬骨鱼,具有生命周期短、生长速度快、便于大规模饲养和繁殖的生物学特点,成为了新兴的抗衰老研究的模式生物。基于此,我们利用这种一年生硬骨鱼进行免疫系统增龄性的研究。白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然多酚类化合物。已有多项研究证实,白藜芦醇可以提高白虾等多种动物的免疫反应。我们实验室之前的研究表明,长期白藜芦醇处理能够延长贡氏假鳃鳉(Nothobranchius guentheri)寿命,提高抗氧化酶在肝脏中的活性。然而,白藜芦醇对贡氏假鳃鳉增龄过程中免疫系统的影响还不清楚。本文通过对相关指标的检测,探究白藜芦醇对贡氏假鳃鳉增龄过程中免疫系统的影响。
  在贡氏假鳃鳉3月龄时,将其分为实验组和对照组,实验组鱼开始长期饲喂白藜芦醇,对照组则饲喂不添加白藜芦醇的食物。分别取3、6和9月龄的贡氏假鳃鳉在冰上处死并取材,探究白藜芦醇对贡氏假鳃鳉免疫器官、淋巴细胞以及免疫因子的影响。结果显示:
  1.随着年龄的增长,贡氏假鳃鳉肾脏指数呈下降的趋势而脾脏指数呈现明显的升高,白藜芦醇处理能够提高肾脏指数、降低脾脏指数。从肾脏组织结构上看,2.5和4月龄肾小管和肾间质中各种细胞排列紧密,造血组织丰富;9月龄和11月龄肾脏中,肾小管和集合小管管壁增厚,管腔变窄,肾间质发生纤维化,造血组织明显减少。从脾脏组织结构上看,2.5和4月龄脾脏结缔组织少,淋巴细胞数量多,造血组织丰富;9月龄和11月龄脾脏中,淋巴细胞大量减少,部分淋巴细胞细胞核明显增大,而结缔组织显著增多,纤维组织丰富。实验组中,长期白藜芦醇处理显著延缓了以上几种变化。
  2.贡氏假鳃鳉血细胞包含红细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核(巨噬)细胞和血栓细胞,其形态结构与斑马鱼血细胞类似。随着年龄的增长,贡氏假鳃鳉外周血淋巴细胞显著减少,而中性粒细胞和血栓细胞数量变化不明显,长期用白藜芦醇处理能显著提高9月龄贡氏假鳃鳉外周血淋巴细胞数量。
  3.为了探究白藜芦醇对贡氏假鳃鳉非特异性免疫相关酶活性的影响,我们在生化水平上检测了血清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及肾脏中溶菌酶和过氧化氢酶的活性。结果显示,随增龄,四种酶活性均显著降低,而长期白藜芦醇处理能显著提高碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶以及过氧化氢酶的活性。
  4.为了探究白藜芦醇对贡氏假鳃鳉免疫因子的影响,我们检测了一氧化氮合酶的活性以及一氧化氮和环氧合酶-2水平。结果显示,随增龄,诱导型一氧化氮合酶的活性显著升高,环氧合酶-2的水平也明显上调。长期白藜芦醇处理后显著抑制了并降低了环氧合酶-2水平,但对贡氏假鳃鳉肾脏中总一氧化氮合酶的活性以及一氧化氮水平的影响不明显。
  总之,白藜芦醇在组织结构上延缓了贡氏假鳃鳉免疫器官的增龄性变化,提高了淋巴细胞数量和非特异性免疫相关酶活性并调节了诱导型一氧化氮合酶的活性和环氧合酶-2的水平。综合以上实验结果,我们推测白藜芦醇能够延缓贡氏假鳃鳉免疫系统增龄性变化。
[硕士论文] 赵丹阳
细胞生物学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:扬子鳄是国家一级重点保护的珍稀爬行动物,已被IUCN确认为世界上最濒危的鳄类之一。无论对于扬子鳄的野生种群还是圈养种群而言,积极开展相关的繁殖生物学研究都具有着极其重要的意义。输卵管、性激素以及卵巢发育均在雌性爬行动物的生殖过程中扮演着重要的角色。但当前针对扬子鳄输卵管蛋白分泌及其性激素受体定位的研究尚处于空白。
  本研究以雌性扬子鳄的输卵管为研究对象,利用组织化学、免疫化学、超微结构技术,研究了扬子鳄输卵管的蛋白分泌情况以及性激素受体的分布等,研究成果为扬子鳄输卵管内环境的变化及其与性激素受体作用关系等研究提供了参考。研究表明:扬子鳄输卵管划分为漏斗部、蛋白分泌部、峡部、子宫部、阴道部5个分区,通过组织化学方法,运用schiff试剂(PAS),阿利新蓝(AB),汞–溴酚蓝(BB)三种不同的染色剂分别对各个区域中性黏蛋白,酸性黏蛋白和蛋白质分布进行统计,并在透射电镜下观察各部分细胞的分泌情况。结果发现输卵管分泌部,子宫部,阴道部上皮细胞的三种阳性物质在各时期分布较多,分泌部和子宫部全年以中性和酸性粘蛋白为主,阴道部上皮三种阳性染色均较多。分泌部腺体PAS,BB阳性物质分泌较多,子宫部腺体以AB,BB阳性为主,阴道部腺体各种物质分泌相对较少。电镜下上皮细胞由纤毛细胞及分泌细胞排列而成。分泌部,子宫部,阴道部分泌泡的电子密度排卵前大于产蛋后。这些数据都支持扬子鳄输卵管不同的部位分泌的不同蛋白可能用于形成卵清蛋白,蛋壳纤维和钙化外壳等。免疫化学染色定位不同时期输卵管雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、孕激素受体(PR)的分布情况,结果表明,三种性激素受体在整条输卵管都有分布,三种受体总体分布1月份较多,5月份最少,到7月再次增加到峰值,8月维持较高水平。对17条分别处于冬眠期及活动期的成年雌性扬子鳄的卵泡发育进行了B型超声波检测,并对冬眠期的卵巢卵泡发育情况进行了回归分析。结果表明扬子鳄心、肝、肠等内脏器官形态在B超视野下清晰可见。冬眠期两侧卵巢中的卵泡共41枚,繁殖期共42枚。冬眠期卵泡处于低回声暗区或无回声暗区的未成熟状态,繁殖期多数卵泡的发育状态与3月相同,少数卵泡呈高回声暗区,此时已形成卵黄颗粒,也有呈高回声亮光区形成卵黄膜的卵泡。3月份19个卵巢、卵泡大小回归分析得卵巢随卵泡发育而增大。
[硕士论文] 张樊苗
遗传学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:Sox9(SRY-related high mobility group-box gene9)是SOX基因家族中的重要一员,作为一个转录因子,在一系列的组织器官如骨骼、性腺、神经脊、心脏的分化和发育中起到了非常重要的作用。斑马鱼有两个sox9基因:sox9a和sox9b,与哺乳动物Sox9为同源基因。先前的研究表明斑马鱼sox9b基因在心脏瓣膜、心内膜细胞及动脉球中表达,注射sox9b Morpholino可导致心脏发育异常。然而,sox9b是通过何种机制如何调控心脏的发育及功能目前尚不清楚。本研究中,我们首次采用CRISPR-Cas9技术构建了斑马鱼sox9b基因靶向敲除突变体。
  在对sox9b纯合突变体的观察中,我们发现在受精后第二天开始,突变体的心脏发育及功能均出现异常:心脏形态结构改变,房室管及瓣膜发育异常;心率异常并且血液流速改变,血液流入心房时有停滞和阻塞,导致血液在腹部堆积,第三天开始出现心包水肿。用 o-dianisidine对血细胞进行染色发现血细胞数量及分布均受到了不同程度的影响。长期观察发现,与野生型相比,突变体生长发育缓慢,体型弱小,且存活率低。实验统计表明有85.7%的突变体成鱼心脏表现为不同程度的肿大充血,心脏发育畸形并且功能严重受损,由此引发死于充血性心脏衰竭,存活时间最长不超过六个月。同时,实时荧光定量PCR和原位杂交实验也表明sox9b突变体中心脏特异基因的表达异常。为了阐明sox9b调控斑马鱼心脏发育的分子机制,我们对受精后2天的幼鱼进行了高通量转录组测序分析,结果发现基因kcnj2a在突变体中显著上调,该基因编码钾离子内向整流通道蛋白亚基,其同源基因KCNJ2与人类安德森氏综合症(ATS)、Short/Long QT综合症等心脏疾病相关。我们的双荧光素酶报告实验及ChIP实验证明,Sox9b可结合到kcnj2a启动子区域的多个位点并抑制其表达。过表达kcnj2a在一定程度上模拟了sox9b突变体的表型,敲降kcnj2a同样证明了其在心脏功能和躯干发育中的重要作用。
  综上所述,我们首次发现了sox9b调控心脏功能的下游基因,并对sox9b调控心脏功能的机制进行了进一步阐述。此项sox9b在心脏中的研究、对kcnj2a调控的研究、以及对 kcnj2a功能的研究可能会对人类安德森氏综合症的探讨提供有价值的动物研究模型。
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