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[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 王晨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:FHL2(Four and a half LIM domains protein2)是FHL蛋白家族成员之一,可作为转录因子共结合因子,参与细胞增殖、迁移、凋亡、信号转导和基因转录等诸多过程。目前,基于FHL2的研究主要集中在心脏、骨骼和癌症中,对生殖发育方面的研究较少。研究表明,FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,可通过结合NR5A1,调控抑制素α基因的转录,提示FHL2对生殖具有重要调控作用,但调控作用及作用机制尚不清楚。因此,本实验以昆明小鼠卵巢颗粒细胞(mGCs)为模型,研究FHL2对小鼠颗粒细胞的调控作用及作用机制,旨在为阐明哺乳动物卵泡发育调控机制提供理论基础。主要研究结果如下:
  (1) FHL2在小鼠卵巢中的时空表达与定位规律:收集新生小鼠(1-6天)及3周和10周的小鼠卵巢,免疫组化实验结果表明,FHL2的表达量随着卵泡组装和原始卵泡池的形成逐渐升高,在颗粒细胞和卵母细胞中均有表达;Western Blot检测结果显示,出生后1天、4天和7天小鼠卵巢FHL2表达量逐渐上升;
  (2) FHL2在颗粒细胞细胞核和细胞质中表达:Western Blot和免疫荧光方法证明,FHL2在mGCs细胞核和细胞质中均有表达,定位与细胞所处的分裂周期有关;
  (3) FHL2促进小鼠颗粒细胞的增殖:体外培养小鼠颗粒细胞,分别转染FHL2小干扰RNA或过表达质粒,CCK-8、细胞计数,流式细胞分析方法结果表明,敲低FHL2后,细胞活力显著降低,S期细胞比例显著降低,细胞凋亡显著增加;过表达FHL2,则可以显著促进小鼠颗粒细胞生长,提高细胞活力,抑制细胞凋亡;
  (4) FHL2通过结合转录因子AP-1和NF-κB调控EGF和EGFR转录:转染FHL2 siRNA后,敲低组EGF和EGFR的mRNA表达量和蛋白表达量显著降低,而超表达FHL2则显著提高EGF和EGFR的表达量;进一步利用Co-IP和CHIP方法证明,FHL2分别结合转录因子AP-1和NF-κB,在转录水平上调控EGF和EGFR的表达;
  (5) EGF对小鼠颗粒细胞生长的调控依赖于FHL2表达量:EGF(20 ng/mL)可显著促进mGCs增殖、提高细胞活力,提高S期细胞比例;敲低FHL2后,EGF对颗粒细胞的促增殖作用受到抑制,提示EGF对小鼠颗粒细胞的调控依赖于FHL2表达量;此外,EGF处理可诱导颗粒细胞EGF和EGFR的表达量显著上升;敲低FHL2后再用EGF处理,EGF对其自身和其受体的诱导作用被显著抑制;
  (6) EGF可促进FHL2表达,尤其是诱导细胞核内FHL2表达量上调:上述实验说明,EGF通路可能与FHL2存在互作,为进一步验证该假设,利用EGF处理小鼠卵巢颗粒细胞,结果表明,EGF(20 ng/mL)处理可诱导mGCs FHL2表达;而分别添加EGFR抑制剂(AG1478)、MEK抑制剂(UO126)和PI3K抑制剂(LY294002)则可以阻断EGF对FHL2表达的调控,说明EGF可通过结合EGFR,激活MEK和PI3K信号通路,参与小鼠颗粒细胞FHL2的表达调控;免疫荧光检测结果显示,EGF可诱导颗粒细胞核内FHL2表达量显著上调;Western Blot结果进一步表明,随EGF处理时间的增加,FHL2在核内表达的表达量逐渐增加,呈时间依赖模式。
  在本研究中,发现FHL2在小鼠卵巢颗粒细胞中表达,并参与颗粒细胞的生长调控。EGF与EGFR在细胞膜上结合,激活MEK和PI3K信号通路,调控FHL2表达,并促进FHL2在细胞核内聚集,而核内FHL2可作为转录因子共激活子,通过结合转录因子AP-1和NF-κB,促进EGF和EGFR的表达,从而形成EGF/EGFR/FHL2自分泌通路,调控颗粒细胞的生长与增殖。研究结果阐明了FHL2对颗粒细胞生长的调控作用及作用机制,有助于我们更好的理解哺乳动物生殖发育调控网络,并为提高家畜繁殖力新技术研发提供科学依据。
[硕士论文] 崔荣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究在前期实验研究中获得一种由四因子c-Myc,Klf4,E-cadherin,Glis1诱导的,形态、体外增殖和体内外分化能力类似于胚胎干细胞,但不具有嵌合能力的部分重编程细胞,KMEG-prCs。该细胞虽具有一定多能性,但oct4,sox2,nanog,AKP并不表达,且SSEA1只在部分细胞中被激活。经转录物组分析显示,KMEG-prCs处于重编程的中间状态。该细胞可以作为一个新的细胞模型来研究重编程过程中内源多能性信号网络激活的分子机制。本研究旨在利用KMEG-prCs细胞,筛选可激活该细胞中内源多能性基因表达的小分子化合物或组合,为进一步探讨内源多能性调控网络的激活和发现新的小分子化合物组合建立新的小分子诱导体系奠定理论和技术基础。通过流式细胞分析显示,重编程不同阶段的表面标记蛋白Thy1(CD90)完全下调,CD54(ICAM-1)完全上调,CD44和SSEA1分别部分上调,CD31仅少数上调。结合转录物组的分析,进一步确定KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞。分选获得SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs,并用含有不同小分子化合物的培养液进行培养,内源多能性基因激活显示,加入HDAC抑制剂TSA、VPA、Oct4激活剂(OAC1)与腺苷酸环化酶活化剂(Forskolin)后激活了多能性基因AKP的表达,并且使一部分SSEA1阴性细胞转变为SSEA1阳性细胞。随后加入EZH2蛋白胞内增强子抑制剂(DZNeP)进一步诱导后,在小分子组合PCA+FD处理下, SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs内源oct4均被激活,SSEA1+KMEG-prCs中oct4高水平表达。获得了一个新的细胞状态,KMEG-prCs-O+,该细胞仍然保持体内外分化能力。随后,虽然将PCA+FD中的A-83-01替换为E-616452,并联合LiCl,构成PCE+FD+Li小分子化合物组合可有效激活nanog的表达,但oct4的表达被下调。综上所述,KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞,通过小分子化合物的处理其内源多能性调控网络可以被激活。该研究为探讨小分子化合物对重编程的作用机理以及进一步获得完全重编程的iPSCs奠定了基础,同样对于细胞在重编程过程中信号通路,代谢途径,表观遗传修饰等的研究提供依据。
[硕士论文] 高洋
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:肌肉抑制素(myostatin,MSTN)是TGF-β超家族的一员,广泛参与机体的生长发育调控。MSTN基因的自然突变会产生肌肉肥大的表型,在牛、羊、狗、小鼠以及人类中均有报道。MSTN通过负调控成肌生长因子,影响肌肉组织的发育和分化,同时,还参与调控肌纤维的代谢活动。
  本研究利用CRISPR/Cas9技术,获得了MSTN第三外显子部分序列敲除的小鼠。以该小鼠为模型,检测MSTN敲除对小鼠基础代谢活动以及细胞线粒体功能的影响。结果如下:通过原核注射获得的MSTN-/-小鼠各器官中的MSTN基因表达量总体呈减少的趋势,小鼠体重显著增加,肌肉发达,表现出较明显的双肌现象。MSTN-/-小鼠基础代谢率下降,体温降低。MSTN基因的敲除显著影响了肌肉组织细胞中线粒体的功能,增强了线粒体中脂肪酸的β氧化,抑制了三羧酸循环和氧化磷酸化过程;参与线粒体合成的Tfam、Nrf1与Clpp等基因的表达显著上调,参与线粒体抗氧化的Sirt1和GSH等活性也显著提升。上述结果表明,MSTN基因敲除后,显著影响了小鼠的基础代谢,抑制了肌肉组织细胞线粒体的三羧酸循环和氧化磷酸化过程。
[硕士论文] 刘淑琰
渔业 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:鲇(Silurus asotus),属鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridae)、鲇属(Silurus)。以鲇仔鱼、稚鱼、幼鱼和成熟雄性鲇为对象,系统研究了鲇性腺发生及精巢分化、精巢发育、成熟精巢周期性变化、精子结构和精子活力特征等项内容。
  本研究主要内容包括:⑴鲇性腺的发生始于鲇出膜后3日龄,生殖嵴的出现为起始标志。性腺分化发生在鲇18日龄~40日龄:卵巢分化开始于鲇18日龄,标志为卵巢腔的形成,卵巢分化完成于鲇24日龄,此时卵巢内出现大量初级卵母细胞;精巢分化于30日龄,标志为输精管的出现;而精巢分化完成于鲇40日龄,标志为精巢内出现大量初级精母细胞。⑵根据精巢形态特征,结合精子发生的组织学和细胞学特点,将鲇精巢从分化后至发育成熟分为6个时期:Ⅰ期精巢(2月龄)为1对细丝,透明或淡黄色,长≦2mm,重≦0.03g,组织切片可见少量精原细胞分散于间质细胞群间;Ⅱ期精巢(3月龄~5月龄)呈”V”形,半透明或白色,表面光滑,无明显血管,长≦35mm,重0.02 g~0.12 g,组织切片可见精原细胞增多;Ⅲ期精巢(6月龄~8月龄)边缘凹凸不平,稍皱褶,少量毛细血管,呈淡粉色,长40mm~62mm,重1.0g~3.73g,组织切片中可见精母细胞;Ⅳ期精巢(9月龄~11月龄)呈分枝不明显的树枝状,白色或淡红色,表面褶皱明显,血管粗而多,长81mm~109 mm,重1.8g~4.8g,组织切片可见精子细胞;Ⅴ期精巢,已成熟,分枝明显,白色或淡红色,长89 mm~117 mm,重2.34 g~5.0 g,组织切片可见大量成熟精子;Ⅵ期精巢为排精后的精巢,其体积缩小,血管收缩,组织切片可见少量发育不成熟的精子。⑶春季(2月~4月)精巢呈淡粉色,不饱满,血管不明显,处于Ⅲ~Ⅳ期。夏季(5月~8月)精巢呈白色或淡红色,血管显著,成熟系数为1.24%~1.83%,处于Ⅳ~Ⅴ期;7月的精巢已充分成熟,即处于第Ⅴ期,可进行人工催产。秋季(9月~11月)鲇精巢呈白色或米黄色;鲇已经排过精子,精巢明显萎缩,成熟系数下降至0.75%,处于Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅵ期。冬季(12月~翌年2月)鲇精巢呈米黄色,其内精子退化。⑷鲇精巢分为白膜和实质两部分,实质主要由小叶间质、精小叶、贮精囊和输出管构成。小叶间质由间质细胞、微血管和纤维结缔组织组成。精小叶呈不规则的管状结构,其壁分布多个精小囊;精小囊是生精细胞的发源地。贮精囊呈蜂窝状,内有嵴和腔隙,为成熟精子的贮存地。⑸采用扫描电镜和透射电镜技术观察:鲇精子由头和尾两部分组成,无颈部。精子头部近球形,直径1.85μm~2.51μm;头部无顶体,内有高度致密的细胞核染色体;头部后方凹陷形成植入窝,内有近端中心粒和远端中心粒;细胞核后方与质膜间的空隙(称袖套)内富含细胞质和线粒体、囊泡等细胞器。尾部细长,无主段、尾段之分,长44.3μm~50.7μm;横切面呈圆形,直径0.269μm~0.308μm;透过横断面可见,鲇精子尾部由轴丝和附属纤维构成,外有一层质膜包裹,无侧鳍;轴丝为典型的“9+2”结构。⑹观察不同pH、水温下鲇精子的快速运动时长和存活时长,结果表明:精子活力的适宜pH为7.0~8.5,pH8.0时,精子活力最强;精子活力的适宜温度为25℃~28℃,28℃时,精子活力最强。
[博士论文] 曹婧
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物中,卵泡闭锁是卵泡发育过程中一个复杂且不可避免的退化过程,受到激素、生长因子等多种因素的调控,而颗粒细胞在卵泡的发育中扮演至关重要的角色,其凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因。Aurora B(丝氨酸/苏氨酸激酶)作为染色体乘客蛋白的一员,参与调控染色体的排列、纺锤体的组装以及胞质分裂等有丝分裂过程。此外,SUMO修饰参与蛋白质互作、信号转导、核质运输、转录调控以及调节基因组稳定性等方面,虽已有文献报道Aurora B可以被SUMO修饰,但是对于Aurora B及其SUMO修饰对卵泡发育的影响方面,仍然是个未解之谜。因此,本课题将以小鼠卵泡及其颗粒细胞为研究模型,主要研究Aurora B及其SUMO修饰对卵泡及其颗粒细胞发育的影响,初步探索可能存在的调控机制。本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
  实验一:Aurora B对小鼠卵泡及其颗粒细胞发育的影响研究
  1、AuroraB在卵泡及颗粒细胞中的定位与表达模式。获取不同发育阶段卵泡及颗粒细胞,检测Aurora B的定位及表达。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核,当胞质分裂时,位于围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的发育,Aurora B在各级卵泡和颗粒细胞中的表达水平上升,在有腔期达到最大;
  2、Aurora B影响卵泡的发育。体外分离获得次级卵泡,添加Aurora B抑制剂培养,观察记录卵泡的生长情况。研究结果显示,抑制AuroraB活性后,卵泡生长速度成下降,闭锁率增加,卵泡的发育受到抑制;
  3、Aurora B影响颗粒细胞的生长。选取有腔期颗粒细胞(pre-GCs),进行抑制剂培养,检测细胞周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,抑制Aurora B后,G0/G1期细胞比例显著增加、S期细胞比例显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻;
  4、初步探索Aurora B调控颗粒细胞生长的分子机制。选取pre-GCs进行抑制剂培养,检测调控细胞增殖与凋亡相关基因和蛋白水平。研究结果显示,Aurora B参与调控p38MAPK与Fas/FasL信号通路,下调G1期向S期转化的细胞周期蛋白CDK4、增殖相关蛋白PCNA以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,上调细胞死亡蛋白Fas、凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达量,最终参与颗粒细胞的生长调控。
  实验二:Aurora B的SUMO修饰验证及其对卵泡颗粒细胞的影响
  1、SUMO修饰验证。成功构建几种真核表达质粒,选取pre-GCs体外分离培养,利用免疫共沉淀法检测SUMO修饰。研究结果显示,在颗粒细胞中,Aurora B可以被SUMO2修饰,Lys207为主要的SUMO2修饰位点;
  2、SUMO2修饰影响Aurora B的生物功能。体外分离培养pre-GCs,首先利用免疫细胞化学法检测Aurora B的定位分布。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核内,而Aurora BK207R主要定位在细胞核,部分定位在细胞质中;其次利用Westernblot法检测Aurora B的蛋白稳定性。研究结果显示,SUMO2可以在一定范围内促进Aurora B的蛋白表达水平。表明,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的定位与蛋白稳定性;
  3、SUM02修饰影响颗粒细胞的生长。体外分离培养pre-GCs,分别转染对照组(HA)、正常组(HA-Aurora B)和突变组(HA-Aurora BK207R),检测细胞的周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,突变组G0/G1期细胞比例显著增加、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻。
  综上,本研究发现在小鼠卵泡中,Aurora B定位于颗粒细胞核,胞质分裂时,转定位至中间体和围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的成熟,Aurora B在卵泡和颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,在有腔期达到最大。抑制Aurora B后卵泡生长受阻、凋亡增加,并通过p38MAPK和Fas/FasL信号通路,下调CDK4、PCNA和Bcl-2的水平,上调caspase-8、caspase-3水平,影响颗粒细胞生长。此外,发现AuroraB可以被SUMO2修饰,Lys207为主要修饰位点,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的亚细胞定位和稳定性,影响颗粒细胞的生长。本研究结果将为卵泡的发育和闭锁提供一定的理论依据,同时也为更好的治疗卵巢疾病奠定基础。
[博士论文] 黄纯杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会进步,人类生殖障碍已成为全世界令人堪忧的医学和社会学难题。其中一个重要因素就是由各种已知或未知原因导致的女性卵子数量和/或质量恶化。恶化的卵子往往无法完成减数分裂或在减数分裂过程中染色体更易发生异常分离产生非整倍体配子,进而导致女性不孕、流产和新生儿先天缺陷。因此,从分子水平阐明调控卵子减数分裂和胚胎发育的机制对于提高和改善人类生殖能力具有重要的医学和社会学意义。SENP7是一种去SUMO化蛋白酶,作用于多聚SUMO链的剪切,从而维持SUMO化修饰的动态平衡。体细胞中,SENP7参与调控染色质稳态和DNA损伤修复。然而,SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的作用仍有待研究。本研究以小鼠为模型,通过敲低卵子和早期胚胎中内源性SENP7的表达以研究其在哺乳动物卵子成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:
  (1)敲低GⅤ期(减数第一次分裂前期)卵子内SENP7的表达后卵子减数分裂进程受到明显抑制。表现为卵子恢复减数分裂(GVBD)和第一极体排放(PBE)受阻,导致成熟卵子的产生显著减少;
  (2)敲低SENP7表达后,组蛋白H3K9和H3K27表观修饰状态的改变(乙酰化上调和三甲基化下调),以及Cdc14B/C表达水平上调伴随着的CyclinB1和CyclinB2降解导致卵子恢复减数分裂受阻以及卵子内纺锤体组装异常;
  (3)y-tubulin定位紊乱以及泛素化修饰介导的γ-tubulin表达量下调也直接引起SENP7缺失型卵子内纺锤体组装异常;
  (4)纺锤体组装异常使恢复减数分裂的SENP7缺失型卵子后续发育受阻;同时持续活化的纺锤体组装检验点将这些卵子的发育进程阻滞在MⅠ期之前,导致这些卵子无法进入AⅠ期,进而无法排出第一极体;
  (5)敲低受精卵内SENP7表达后,胚胎发育同样出现明显缺陷。表现为胚胎卵裂受阻,大部分胚胎甚至无法发育到2细胞时期,导致囊胚发育率趋于零水平。同时,伴随着时间的延长,胚胎会发生凋亡;
  (6) SENP7缺失型胚胎内组蛋白H3K9和H3K27表观修饰的紊乱(乙酰化水平上调和三甲基化水平下调)以及DNA5hmC修饰水平的下调导致DNA损伤位点邻近的染色质无法维持DNA修复所需的理想空间结构;HP1α在常染色质上的分布导致DNA修复蛋白Rad51C的表达量下调;胚胎有丝分裂过程中纺锤体组装同样出现异常。这些因素共同导致缺失母源性SENP7的胚胎无法修复其基因组中存在的DNA损伤,因而胚胎发育出现缺陷甚至胚胎发生凋亡;
  综上,本研究揭示了母源性SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的关键作用及其分子机制。另外,本研究将SUMO化修饰与染色质上的其他修饰在生殖生物学的一些事件中联系起来,有助于认识生殖发育过程中蛋白质水平的复杂调控网络,为提高动物繁殖和人类生殖健康提供重要理论依据。
[硕士论文] 杜健
动物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:外泌体,一类直径在50-150nm具有双层膜结构的细胞外囊泡,存在于生物的各种体液中。外泌体可以通过负载蛋白质、多肽、mRNA、长链非编码RNA、miRNA、环状RNA以及tsRNA调节不同细胞的生物活性。目前,许多研究表明外泌体在肿瘤的形成、迁移和代谢方面发挥着重要作用,同时还与许多疾病的发生密切相关。
  在精子发生的过程中,精原干细胞除了形成一个走向分化命运的精原细胞外,还会形成一个与自身相同仍旧拥有干性的细胞。在睾丸曲细精管内的“niche”微环境中,支持细胞分泌的各类因子对于精原干细胞的自我维持与更新发挥着重要的作用。附睾和精浆中的细胞外囊泡参与了精子发生的过程中,然而,在曲细精管内支持细胞来源的胞外囊泡对精原干细胞的调节作用所知甚少。
  本研究对支持细胞分泌的胞外囊泡进行了鉴定,并且探究了其对精原干细胞的影响,主要结果为:
  (1)收集不同发育阶段小鼠的睾丸,通过免疫组织化学的方法,在曲细精管内对外泌体标志性蛋白质CD63进行了定位。发现在小鼠不同发育阶段,CD63主要定位在支持细胞的细胞质,并且呈颗粒状分布。同时,CD63在小鼠出生后前7d有很高的表达量,这表明含有CD63的阳性囊泡在精子发生的过程中发挥着重要作用。
  (2)通过梯度离心和超速离心的方法,首次分离纯化出原代支持细胞释放的细胞外囊泡。在电镜下可以观察到囊泡具有双层膜结构,并且通过纳米颗粒跟踪仪测量出囊泡的大小主要在76nm左右。利用蛋白质免疫印迹发现分离出的囊泡含有外泌体的特异性蛋白质CD63。因此,从形态特征、粒径大小以及标志性蛋白质这三个方面鉴定出这类囊泡主要是外泌体。
  (3)用DiI对分离出的外泌体进行标记,发现DiI-外泌体可以附着在C18-4细胞以及原代精原干细胞的表面,呈现颗粒状不均匀分布。
  (4)在无血清的培养条件下添加100ng/μL外泌体培养24h,同时未添加外泌体的细胞作为对照组。发现加入外泌体后,C18-4细胞和原代精原干细胞的状态良好,细胞饱满,表面光滑,而对照组的细胞表面出现大量颗粒,细胞萎缩,细胞状态变差。
  因此,本研究首次分离纯化出支持细胞来源的外泌体,通过表型分析发现这类外泌体可以附着在精原干细胞表面,并且可以维持精原干细胞的存活。通过本项研究,能够进一步揭示支持细胞调控精原干细胞的方式,对于了解精原干细胞的功能和调控机制开辟了新的视野并奠定了前期的工作基础。
[硕士论文] 李阳
动物遗传育种与繁殖 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:约束应激会造成卵母细胞的氧化应激,并进一步导致卵母细胞的损伤,影响发育能力。褪黑素(melatonin,MT)是高效的抗氧化剂。在体外环境、老化、化学物质等诱发的卵母细胞和胚胎氧化应激中,适度的褪黑素处理可以有效清除活性氧族(reactive oxygen species,ROS)缓解氧化应激,改善卵母细胞和胚胎发育能力。因此,我们推测针对母体的褪黑素处理,可以缓解约束应激造成的卵母细胞损伤。本试验将以约束应激小鼠为模型,探究母体注射褪黑素对卵母细胞的保护作用。
  试验对小鼠超排后的卵母细胞进行收集统计,观察约束应激和褪黑素对小鼠超排效果的影响。结果显示,与对照组相比,约束应激处理48小时后小鼠排卵数显著增加(P<0.05),而注射褪黑素后排卵数恢复至正常超排水平,表明约束应激增强了小鼠的超排反应,褪黑素能够对其进行有效地缓解。
  通过检测卵母细胞活性氧水平、线粒体拷贝数、线粒体活性和膜电位,以此来评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞质量的影响。结果显示,与对照组相比,约束应激后卵母细胞内ROS含量显著上升(P<0.05),线粒体拷贝数显著增加(P<0.05)、线粒体活性显著降低(P<0.05)、膜电位异常升高(P<0.05),而褪黑素处理后线粒体活性显著升高(P<0.05)、膜电位显著降低(P<0.05),但拷贝数变化不显著(P>0.05)。这些结果表明约束应激造成小鼠卵母细胞氧化应激,增加了线粒体的数量但同时对线粒体的功能造成损伤,影响了卵母细胞的质量,而母体注射褪黑素可以提高约束应激小鼠卵母细胞的质量。
  利用卵母细胞体外受精技术并对获得的囊胚进行细胞数和凋亡染色,评价褪黑素对约束应激小鼠卵母细胞体外发育能力的影响。结果发现与对照组相比,约束应激小鼠卵母细胞体外受精后受精率和卵裂率并未显著降低(P>0.05),但囊胚率和囊胚细胞数显著下降(P<0.05),并且凋亡的囊胚比例显著上升(P<0.05)。注射褪黑素后可以显著提高囊胚率和囊胚细胞数,并且显著降低凋亡的囊胚比例(P<0.05)。这些结果表明,约束应激会损伤小鼠卵母细胞受精后到附植前的发育能力,而褪黑素的使用提高了约束应激小鼠卵母细胞的体外发育能力。
  上述试验结果证实:母体的约束应激会诱发异常的超排反应,并造成卵母细胞氧化应激,降低卵母细胞质量和体外发育能力。针对约束应激小鼠进行褪黑素注射,能有效缓解约束应激反应,改善卵母细胞质量,并提高卵母细胞体外发育能力。
[硕士论文] 罗利娟
生理生态及行为生态学 沈阳师范大学 2017(学位年度)
摘要:表型可塑性是生物长期进化过程中形成的一种适应策略。消化器官形态和生理方面的表型可塑性,能够限制动物获取营养和能量的速率。在自然环境中,动物时常会经历食物质量和数量的变化,为满足其对能量和营养的需求,消化道器官形态和小肠刷状缘膜上的各种酶活力会发生适度的调节。为探究食物营养成分变化对不同生活史阶段小鼠消化的影响,选取了哺乳期、正常生长期及繁殖期的小鼠,测定了日摄食量、内脏器官及消化道器官的形态、小肠组织蛋白浓度、幼鼠胃内容物的蛋白浓度及小肠刷状缘膜上的消化酶(二糖酶和氨基肽酶)活力,并分析了消化率及不同食物组间消化策略的差异,主要的结果与结论如下:
  1.小鼠肠道四种消化酶活力出生后发育的时间变化模式不同。乳糖酶活力先增后降,在9~12日龄达最高,至27日龄降至微弱,且不同位置时间不同步;蔗糖酶活力12日龄始出现,自15日龄迅速升高,至18~21日龄达到最高,但随后显著降低;麦芽糖酶出生时已具有活力,但15日龄以前维持较低水平,此后迅速升高,在18~21日龄达到峰值,此后下降;小肠前段的氨基肽酶活力出生后持续下降,而后段和中段则持续升高,断乳后略有下降。这表明,小鼠小肠4种消化酶活力的时间变化能够与其食物转变的消化需求相匹配。
  2.为研究食物营养成分是否会影响母鼠乳汁成分进而影响到幼鼠的发育,在母鼠分娩当天饲喂高淀粉、普通、高蛋白食物。结果发现,食物营养成分可影响到乳汁成分,但小肠刷状缘膜上的消化酶活力受到食物成分的影响较小。
  3.为比较断乳后不同发育期的消化表型可塑性差异,不同食物驯化亚成年和成年小鼠两周后,检测比较了摄食消化、器官形态、小肠消化酶活力及血液指标。结果表明,成体小鼠肠道二糖酶活力比亚成体小鼠可塑性能力强,而氨基肽酶活力相反。
  4.高淀粉、普通和高蛋白食物饲喂哺乳期母鼠,结果发现,其摄食量随幼鼠日龄的增加而不断增加,但消化率无显著变化,且三组母鼠小肠刷状缘膜上二糖酶活力支持适应性调节假说,氨基肽酶活力不支持适应性调节假说。血清中的葡萄糖和甘油三酯浓度无显著差异,而高蛋白食物组血清中的尿素氮和肌酐浓度显著高于高淀粉组。
[硕士论文] 史文姝
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精过程中,多精入卵被视为最普遍的异常受精,而近年来的许多研究表明,透明带(ZP)的泛素化异常是造成多精入卵的主要原因之一。泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)是一种主要的去泛素化酶,研究显示UCHL1与透明带蛋白的泛素化水平相关。本试验的丰要目的是探究抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。试验主要分三部分进行:(1)UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用DAPI染色观察极体排放情况,从而验证抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟率的影响;(2) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用SDS-PAGE和Western blot等方法检测猪卵母细胞透明带泛素化水平的影响;(3) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用Hoechst染色观察精卵粘附及多精入卵情况。试验得到以下结果:
  1.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为66.22%,而30μM组的成熟率为5.30%,且各处理组成熟率差异性显著(P<0.05),结果表明抑制UCHL1对猪卵母细胞的体外成熟有影响。
  2.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,经Western blot检测结果显示各处理组的ZP在约65kDa,85kDa,120kDa处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著(P<0.05),结果表明随UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。
  3.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,进行体外受精,经Hoechst染色显示对照组ZP精子粘附数最多,精子入卵数最少;随着UCHL1抑制剂浓度逐渐增大,ZP精子粘附数逐渐减少,精子入卵数逐渐增多;添加30μM UCHL1抑制剂组的ZP精子粘附数少,没有精子入卵。结果表明UCHL1调节ZP精子粘附及多精入卵。
  结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有影响。随着UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。UCHL1调节ZP精子粘附以及多精入卵。
[硕士论文] 李元志
发育生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在许多动物体和人体中,气管系统(呼吸系统)发育的缺陷会导致致死性的疾病。由于脊椎动物脉管系统和果蝇气管系统发育机制上的相似性,研究果蝇的气管发育可以为脊椎动物脉管系统疾病的产生机理提供借鉴。果蝇是经典的模式生物,在遗传发育生物学史上具有重要地位,可以作为研究气管系统发育的理想的生物学模型。
  果蝇气管是从20团基板前体细胞中发育而来,经历了细胞分裂、分化、迁移、变形、分支融合等多个复杂过程,最终发育成了遍布全身各处的气管网络系统。果蝇气管的发育过程是受到多种因子调控的生物学过程,多种生物分子和信号通路相互协调合作,构成了一个庞大的调控网络来调控气管的正常形成。
  T-box家族转录因子在生物发育的早期起到重要作用,其会在特定的器官或细胞类型中表达,对早期的细胞命运决定、细胞分化和器官形成也是必须的。Midline(Mid)作为T-box家族转录调控因子在果蝇胚胎发育的早期就开始表达发挥作用,对果蝇的肌肉、性腺、眼、腿、翅、心脏和神经系统等多种组织和器官的发育产生重大影响,但是目前关于Mid对果蝇气管发育的调控机制还没有报道过,本研究旨在探究Mid在气管发育过程中发挥的重要功能。
  本课题利用lacZ标记、原位杂交、免疫荧光染色等生物学技术,分析了T-box转录调控因子Mid在果蝇气管发育中的作用,并研究了其表达模式和功能。本研究发现转录调控因子Mid在果蝇的气管中广泛表达,并且对于果蝇气管的发育起到重要的作用。在气管系统中,Mid功能的缺失或者过表达都会引起气管发育的异常或受损,而通过表型拯救的气管则会发育正常。在研究过程中还发现,mid和slit基因的表达在气管系统中存在共定位情况,且先前有文献报道slit基因可调控气管发育过程,进而我们发现mid和slit存在遗传学相互作用,并且Mid直接调控slit在气管上的表达。综上所述,我们提出Mid通过激活slit基因的表达来调控果蝇气管的发育。
  本研究是首次探究了Mid对果蝇气管发育的影响,阐明了Mid控制气管发育的机制,为其他动物体和人体中气管系统(呼吸系统)发育的研究奠定了理论基础,同时为研究气管系统(呼吸系统)疾病提供重要依据,具有重大的意义。
[硕士论文] 赖正发
发育生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:远缘杂交是将两个亲缘关系比较远的物种进行杂交,杂交后代通常具有父母双亲的优良性状,同时还可以增加后代基因重组和突变的频率。在红鲫(Red crucian carp,RCC,♀,2n=100)和团头鲂(Megalobrama amblycephala,BSB,♂,2n=48)的远缘杂交研究中,其中部分F1的雌性和雄性的个体分别能够产生二倍体卵子(2n=100)和二倍体精子(2n=100),筛选出这样的雌雄个体进行自交,在F2中形成了雌性和雄性均可育的同源四倍体鱼(4n=200)群体,并对F2进行繁殖育种,经过不断的传代,最终获得了具有稳定遗传特性的同源四倍体鱼的杂交品系(F2-F13)。
  本文选取雄性的同源四倍体鱼(F8,4n=200)与雌性的红鲫(2n=100)进行杂交,获得了同源三倍体鱼(3n=150)。同时,将同源四倍体鱼(F8,♂,4n=200)和鲤鱼(Cyprinus carpioL,CC,♀,2n=100)进行杂交,杂交后代为异源三倍体鱼(3n=150)。在繁殖期,雌性的同源三倍体鱼和红鲫杂交可以产生二倍体和四倍体的后代;同源三倍体鱼的雌核发育也可以产生存活的后代,这都证明了雌性的同源三倍体鱼是可育的。以前的研究普遍认为,在减数分裂时期,由于三倍体鱼的同源染色体配对行为发生紊乱,无法产生稳定的配子,所以都是不可育的,但是我们获得的雌性的同源三倍体鱼却是可育的,这为探究三倍体鱼的能育性提供了良好的实验材料。为了探究三倍体鱼可育的分子机制,本文比较分析了雌性的同源三倍体鱼和雌性的异源三倍体鱼的生殖特性。本研究的主要内容有:
  1.分别选取一年到两年之间的、雌性的同源和异源三倍体鱼(两年性成熟),对它们的卵巢组织进行连续组织切片观察,结果显示,在非繁殖期,两种鱼的卵巢组织切片中几乎所有的卵母细胞都处于Ⅰ时相时期,两者的发育程度没有差别,还无法判断鱼类的育性。在繁殖期,在同源三倍体鱼的卵巢组织切片中,大量分布Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时相时期的卵母细胞,卵母细胞发育正常。但是,异源三倍体鱼的卵巢组织切片中,几乎所有细胞还是停留在Ⅰ时相时期,这些细胞没有看到卵黄的形成,还有极少数已经退化的Ⅱ,Ⅲ时相时期的细胞,这些特征都说明异源三倍体鱼的卵巢发育不正常。
  2.选取2龄的、雌性的同源和异源三倍体鱼卵巢组织进行转录组测序。分别获得了46,869,254条和43,654,554条clean reads,通过序列组装后分别得到了137,083个和99,836个unigenes,经过转录组数据库注释后分别得到了33,692个和28,755个注释的基因。两种鱼的转录组进行差异分析结果表明,在同源三倍体鱼中差异表达的基因有11,556个,6,729个基因在异源三倍体鱼中差异表达。同时,与异源三倍体鱼比较,有8,311个基因在同源三倍体鱼中高表达,7,382个基因低表达,230个基因在同源三倍体鱼中特异表达,65个基因在异源三倍体鱼中特异表达。
  3.通过对转录本测序数据中的KEGG、COG、NR数据库的比对分析,结果发现两种鱼的转录组中表达基因在功能分类上并没有明显差别,部分基因的表达差异和基因结构差异可能是引起两种鱼生殖特性不同的关键。我们筛选出了16个与卵巢发育相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),10个与减数分裂相关的DEGs。通过分子克隆的方法获得了2个基因的cDNA的部分序列,结果显示在碱基序列和氨基酸序列上存在片段的缺失,单个碱基突变,碱基的突变导致翻译的氨基酸也不一样,这些结果证明了基因的结构和功能相适应。通过RT-PCR和qPCR技术对这8个具有代表性的卵巢发育相关的DEGs进行验证,其中在同源三倍体鱼的卵巢中表达水平上调的基因有PAZ,Lhx8,cdc2,nfr,stAR,在异源三倍体鱼的卵巢组织中表达上调的基因有C1q,cdc28,pla2。对这些基因的功能进行分析,发现它们或与初级卵母细胞的发育,类固醇激素的合成,卵子形成,促进排卵等有关。同时,通过qRT-PCR验证6个与减数分裂相关的具有代表性的DEGs,结果显示大部分的基因都在同源三倍体鱼卵巢中表达上调。
  综上所述,雌性的同源三倍体鱼可育的分子机制或许与卵巢发育相关的部分基因的表达差异和基因的结构有关。同时,减数分裂相关的基因在同源三倍体鱼的卵巢中表达上调,推测其或许会减少同源染色体在减数分裂时期配对紊乱对鱼类育性的影响。
  本研究通过组织水平和基因水平去探究同源三倍体鱼的育性问题,这为以后研究三倍体鱼类育性的分子机制积累数据并提供参考,同时,对于鱼类的繁殖和遗传育种奠定了理论基础。
[硕士论文] 唐孝君
发育生物学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:利用人工形成并且亲缘关系和遗传背景都非常清楚的鱼类杂交品系来研究父母本及其子代的下咽齿和下咽骨的形态和排列,以期揭示远缘杂交后代中下咽齿和下咽骨形态发生和功能适应。本实验鱼品系形成过程如下:
  鲤鲂品系:鲤鱼(Cyprinus carpio L.,2n=100)(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala,2n=48)(♂)F1代中首次形成了四种,可育后代,分别为新型同源二倍体类鲫鱼(2n=100)、雌核发育二倍体鲤鱼(2n=100)、雌核发育二倍体镜鲤(2n=100)、异源四倍体鲤鲂(4n=148)。合方鲫品系:白鲫(Carassius auratus cuvieri,2n=100)(♀)×红鲫(Carassius auratus red var,2n=100)杂交后代合方鲫。鲫鲂品系Ⅰ:红鲫(Carassius auratus red var,2n=100)(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala,2n=48)(♂)F1后代有二倍体(2n=100)三倍体(3n=124)、异源四倍体Ⅰ(4n=148)。异源四倍体再自交会产生同源四倍体。鲫鲂品系Ⅱ:白鲫(Carassius auratus cuvieri,2n=100)(♀)×团头鲂(Megalobrama amblycephala,2n=48)(♂)F1后代异源四倍体Ⅱ(4n=148),异源四倍体自交后代产生同源四倍体(4n=200)。
  1.通过观察发现实验所用的4种杂交品系的下咽齿都满足鲤形目的1-3行咽齿模式,每行的咽齿数目也各异。杂交品系的咽齿齿式大多数偏向于母本,但是杂交后代中还是出现既不偏向母本也不偏向父本的情况。咽齿齿式偏向母本:雌核发育二倍体镜鲤、雌核发育二倍体鲤鱼、异源四倍体Ⅰ、合方鲫、异源四倍体Ⅱ。既不偏向母本也不偏向父本:新型同源二倍体类鲫鱼、同源四倍体。研究发现同一种鱼的不同个体的齿式有时不一样但大部分趋同。团头鲂的齿式为2.3.5-5.3.2(大多数个体)或2.4.4-4.4.2(少部分个体),造成这个现象可能是在鱼体的发育过程中,鱼类食性的转换使得肌肉的活动影响了下咽骨的形态发育,下咽骨的形态制约着咽齿的发育,并最终影响鱼类咽齿的系统演化。
  2.实验中的所有品系的鱼咽齿形状可以分为5种类型:圆锥型、臼齿型、侧扁型、粗壮侧扁型和极扁侧扁型。下咽骨形态又可以分为三种:粗壮型、中间型、狭长型。主行齿组成有单一型和混合型两种。下咽骨和下咽齿有多种组合类型,这种组合类型是与不同的生态环境和食性相适应的。其中中间型的下咽骨与下咽齿组合方式最多。中间型的下咽骨与臼齿型、粗壮侧扁型下咽齿组合(普通鲤鱼、异源四倍体鲫鲂Ⅰ)。中间型的下咽骨与侧扁型、粗壮侧扁型的下咽齿组合(团头鲂);中间型的下咽骨还能与臼齿型、侧扁型的下咽齿组合(红鲫、白鲫、合方鲫);最后中间型的下咽齿还能与臼齿型、圆锥型的下咽齿组合(同源四倍体鲫鲂,异源四倍体鲫鲂Ⅱ);粗壮型的下咽骨与臼齿型、粗壮侧扁型下咽齿组合(雌核发育二倍体鲤鱼);狭长型的下咽骨与臼齿型、侧扁型下咽齿组合(新型同源二倍体类鲫鱼);下咽齿和下咽骨形态对应的有关食性可以分为草食性、肉食性、杂食性。这些组合方式可以提高鱼类对环境的适应能力。
  3.为了进一步描述4种杂交品系的下咽骨的形态,在下咽齿上选定测量位点进行详细的测量,选定4个下咽骨形态变量、1个咽齿形态变量、4个比值变量,将数据矫正后,采用SPSS22.0统计软件,统计方法主要采用主成分分析(PCA),主成分分析结果显示下咽骨9个变量可以提取3个因子,可以解释原始变量总变异的97.201%,反映了变量之间的关联程度。下咽骨变量提取的少数因子可以对多个自变量做出解释。而且初步建立一个数学模型来综合评价鱼的下咽骨的形态变量与其环境适应力的关系。
[硕士论文] 常浩亚
临床兽医学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻技术是辅助生殖技术的重要组成部分,其广泛应用于优良家畜、珍稀和濒危动物的保种和人类不孕不育症的治疗等领域。随着科研人员的不断努力,玻璃化冷冻技术日趋成熟,应用也越来越普遍。但是,近年来的研究发现,玻璃化冷冻不仅对其细胞超微结构以及细胞膜等造成不良影响,还对其卵母细胞或者胚胎DNA甲基化水平、发育基因的表达、DNA损伤和印记基因等产生影响,对胚胎发育以及后代存在潜在风险。本研究使用卵母细胞单细胞凝胶电泳、免疫荧光染色、qRT-PCR和TUNEL染色等方法,分析了卵母细胞玻璃化冷冻对MⅡ期卵母细胞及胚胎DNA损伤的影响;同时使用qRT-PCR和亚硫酸氢盐测序法,检测了卵母细胞玻璃化冷冻对MⅡ期卵母细胞及受精后代印记基因H19和Gtl2差异甲基化区域(DMRs) DNA甲基化状态及表达的影响。获得了如下研究结果:
  1、卵母细胞单细胞凝胶电泳实验研究表明,冷冻组和对照组的尾部DNA和OTM值差异不显著;免疫荧光染色显示,冷冻组和对照组MⅡ期卵母细胞中γ H2AX水平差异不显著,而5hmC水平显著升高;冷冻卵母细胞激活发育到2-cell,冷冻组的γ H2AX位点数与对照组比较显著升高(P<0.05),5hmC水平也显著升高(P<0.05);在MⅡ期卵母细胞中,53BP1、Casp3、Fas、Gadd45a和Ddit3中表达水平差异不显著;在2-cell中,Casp3和Fas的表达水平变化差异不显著,53BP1、Gadd45a和Ddit3表达水平显著升高(P<0.05);冷冻组卵母细胞孤雌激活后卵裂率和囊胚率显著降低(P<0.05),囊胚凋亡细胞数显著上升(P<0.05)。
  2、在MⅡ期卵母细胞中,冷冻组和对照组的H19甲基化状态没有显著差异(P>0.05),冷冻组Gtl2差异甲基化区域的平均甲基化水平(5.83%)显著低于对照组(9.22%)(P<0.05);冷冻后卵母细胞印记基因H19的表达水平无显著变化(P>0.05),而GTl2表达水平显著下降;在冷冻卵母细胞体外受精和胚胎移植后,对获得的性成熟仔鼠的心脏、脾脏、肺脏和肾脏进行检测,发现Gtl2差异甲基化区域DNA甲基化水平与对照差异不显著(P>0.05),肝脏检测发现,冷冻组Gtl2差异甲基化区域DNA甲基化水平显著高于对照组(P<0.05);实时定量的结果显示,在脾脏和肾脏中Gtl2表达水平变化不明显(P>0.05),心脏、肝脏和肺脏中Gtl2表达水平显著上升(P<0.05)。
  结论:MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻-解冻后,未检测到明显的DNA损伤,但是冷冻卵母细胞发育到2-cell期,可以检测到DNA损伤的发生,并且检测发现53BP1、Gadd45a和Ddit3表达上调。卵母细胞玻璃化冷冻后早期胚胎发育卵裂率和囊胚率降低,囊胚凋亡细胞数上升。卵母细胞玻璃化冷冻会影响MⅡ期卵母细胞印记基因Gtl2的表达和差异甲基化区域DNA甲基化水平,也会对获得的仔鼠器官中印记基因Gtl2的表达和差异甲基化区域DNA甲基化水平造成影响。
[硕士论文] 屈鹏祥
临床兽医学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:MicroRNA在胚胎合子基因转换、胚胎致密化、DNA甲基化和染色质重塑等方面发挥重要作用;精子中的microRNA可通过调控早期胚胎转录水平,直接参于胚胎的发育,并在跨代遗传中发挥重要作用。相比体外受精胚胎,体细胞核移植胚胎表现出较低的发育潜能。目前多认为这是技术层面不足和异常重编程导致的,而精子携带进入卵母细胞的RNA的作用一直被忽视。本试验以精源性microRNA为切入点,研究了其对早期核移植胚胎发育的影响。主要研究结果如下:
  Bta-miR-202在精子中高表达,并且在受精胚胎原核时期的表达水平高于卵母细胞以及2细胞时期的受精胚胎。
  本课题组前期研究证明SEPT7是bta-miR-202的一个靶基因,生物信息学方法分析显示SEPT7在细胞胞质分裂中发挥重要作用;对SEPT7进行蛋白互作分析,结果提示SEPT7可能与HDAC6相互作用。SEPT7蛋白在类原核期核移植胚胎的表达水平高于原核期体外受精胚;获得bta-miR-202核移植胚胎的SEPT7表达水平低于对照组,但仍高于体外受精组;获得bta-miR-202核移植胚胎的α-tubulin乙酰化水平高于对照组,但仍低于体外受精组;获得bta-miR-202核移植胚胎第一次卵裂发生碎片率低于对照组,但仍高于体外受精组。Bta-miR-202靶向卵源SEPT7,可能通过SEPT7与HDAC6的互作,调控a-tubulin乙酰化水平从而影响核移植胚胎的第一次卵裂。
  综上所述,bta-miR-202靶向SEPT7调控牛核移植胚胎第一次卵裂。
[硕士论文] 田华香
水产学、水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:鱼类早期异速生长是优先发育那些对个体生存有重要作用的器官,不同器官有不同的异速生长特征,是鱼苗为了适应栖息环境要求的一种重要生长策略。淇河鲫源自淇河,具有生长速度快、味道鲜美及优质的经济效益等特点,为河南特色珍贵鱼类。本文通过对淇河鲫从孵化出膜到生长20日龄的异速生长特征进行研究,探讨淇河鲫早期生长发育模式,同时对不同种群淇河鲫的骨骼形态学进行分析,得到区分不同种群的特征变量。本研究填补了淇河鲫异速生长从孵化出膜生长特征的基础数据,完善了对不同种群骨骼形态学的研究,为淇河鲫在生产养殖过程中的早期管理、种质鉴定等积累基础资料。试验材料为河南淇县淇河鲫仔鱼和成鱼;按常规方法制备骨骼标本;依据文献选择淇河鲫形态变量进行测量;测量变量包括全长、头长、眼径、吻长、躯干长、头高和体高等;数据处理采用SPSS22.0统计软件,方法采用单因素方差分析、多元回归、主成分分析、判别分析和曲线拟合等。
  本研究主要内容包括:⑴试验用鱼来自河南师范大学水产学院水产养殖基地人工近交繁育。试验时间为2015年5月至6月。研究淇河鲫从孵化出膜到生长20日龄的早期生长。结果表明,18-22℃条件下仔鱼生长最快。日龄与周龄比较的结果显示,0-20日龄的仔鱼更适合线性生长模型。各变量的异速生长研究结果显示,仔鱼期头部的生长快于躯干部。仔鱼眼径、吻长等头部变量的正异速生长为仔鱼的呼吸和摄食提供了便利条件,躯干部生长缓慢,呈现负异速生长,但头高和体高呈现正异速生长,这可能与仔鱼消化系统为满足其迅速生长的营养需求有关。结果提示,淇河鲫仔鱼早期发育阶段对温度的影响敏感,部分器官的优先发育对其生长生存起关键作用。⑵试验材料来自淇河林县段、淇县段和新乡市3个种群的淇河鲫。选择全长、体长、体高、体厚等10项可量性状变量进行测量。结果显示:体长/全长、体高/全长、头长/全长、眼径/全长、尾柄长/全长和背鳍基长/全长在各群体间的差异有统计学意义(P<0.05)。逐步判别分析提取体高/全长、尾柄长/全长和背鳍基长/全长共3项变量建立2个判别函数,对判别函数有效性的检验使用回代检验和交互检验,判别率分别为100.0%和97.5%。主成分和因子分析结果提取3个因子,累计贡献率为76.7%。通过因子得分值可知,淇县和林县种群的淇河鲫在形态学的差异较小,而新乡种群的与这两者的差异较大。结果提示3个地理种群淇河鲫在形态上产生一定程度差异,不同群体的归属可以通过某些形态性状进行判定。⑶选择林县、淇县和新乡3个种群淇河鲫成鱼。选择下咽骨、鳃盖骨和匙骨等15个线性变量测量。结果显示,大部分变量(13/15)在组间存在差异,主要表现在新乡或淇县与林县的淇河鲫,新乡和淇县组一般没有差异;少部分变量(2/15)在3个组之间没有统计学差异,这2个变量都来自下咽骨。结果提示下咽骨变量相对稳定,一般不容易发生变异。通过PCA将多变量降维,找出不同种群淇河鲫头部骨骼形态差异的主要因子,结果提取3个因子,累计贡献率为88.8%。
[硕士论文] 朱晋生
动物遗传育种与繁殖 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:miRNA是一类具有调控作用的非编码小RNA,它通过与靶基因mRNA的3'UTR区结合调控基因的表达。已有研究表明miR-382参与调控多种细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的侵袭。为了探究miR-382对小鼠精原细胞的增殖调控作用,本研究使用生物信息学预测了miR-382-5p的潜在靶基因,并使用双荧光素酶报告系统进行验证;通过转染miR-382-5p的类似物与阻抑物,使用CCK-8与EdU试验检测了miR-382-5p对小鼠精原细胞的细胞活力与增殖能力的影响;通过RT-qPCR检测了猪睾丸中Kmt5a基因在不同发育阶段与不同细胞类型中的表达情况;使用分子克隆测序与生物信息学分析探究了Kmt5a基因剪接变体的分子结构差异。主要结果如下:
  1、miR-382-5p的预测靶基因为Kmt5a、Top1,通过双荧光素酶试验证明了Kmt5a是miR-382-5p的一个靶基因,而Top不是。
  2、细胞活力与增殖能力检测结果表明,与对照组相比,miR-382-5p mimics在120nmol/L的条件下能降低GC-1spg细胞的活力13.4%(p<0.05),并降低GC-1spg细胞的增殖能力8.6%(p<0.05),而miR-382-5p inhibitor不能显著提高GC-1spg细胞的活力和增殖能力(p>0.05)。
  3、RT-qPCR与Western Blotting试验表明,miR-382-5p mimics在120nmol/L的条件下能下调靶基因Kmt5a在GC-1spg细胞中的mRNA相对含量39.8%(p<0.05),下调KMT5A蛋白表达量36.5%。
  4、Kmt5a在7日龄猪睾丸支持细胞中的mRNA表达量显著高于间质细胞和性原细胞(p<0.05),在5月龄猪睾丸中相对含量显著高于7日龄与2月龄(p<0.05)。
  5、DNA测序结果表明Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,即Kmt5a-X1,Kmt5a-X2,蛋白二维结构分析表明KMT5A-X1缺少N端的PIP(PCNA-interacting motifs)box1。
  综上所述,本研究发现Kmt5a基因是miR-382-5p的一个靶基因,miR-382-5p能够调控GC-1spg细胞的增殖。因此,miR-382靶向Kmt5a基因调控小鼠精原细胞的增殖。同时,在不同发育阶段的猪睾丸中,Kmt5a的表达量随着年龄的增加而上升;Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,其中剪接变体KMT5A-X1缺少N端的PIP box1。本研究结果丰富了miRNA在精原细胞增殖过程中的调控网络,为进一步解析雄性动物精子发生提供初步的实验依据。
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