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[硕士论文] 祝岩波
动物学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原体(Mycoplasma pneumoniae)、泰泽氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)等七种病原体是我国实验动物微生物质量控制需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体。
  目前对实验动物携带的病原体主要依靠分离纯化培养、菌落形态、镜下观察及生化试验等方法进行鉴定,检测周期长,费用高,并且需要有经验的检测人员进行判定,漏检、误判时有发生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技术以其简便、快速、准确等优点已广泛用于医疗和卫生行业,但实验动物的微生物质量控制还未将PCR检测方法纳入,更没有多重PCR方法,这已成为多种病原体或大样本简单、快速、准确鉴定的掣肘。
  多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等优点。用于实验动物病原微生物检测,可以同时检测多种病原体,适合大样本的检测与鉴定,具有高灵敏性、高特异性和低成本等优点。多重PCR在其他行业应用较多,然而,目前应用在实验动物病原微生物检测的研究很少。
  本研究目的是针对七种实验动物病原菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌、肺炎克雷伯杆菌,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法或血清学方法比较,验证多重PCR检测方法的可操作性和准确性。
  方法:
  1、标准菌株的培养和DNA提取:将金黄色葡萄球菌标准株接种到SP琼脂培养基,绿脓杆菌标准株接种到NAC琼脂培养基,肺炎克雷伯杆菌接种到DHL琼脂培养基,37℃培养18-24h;多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌接种到血琼脂培养基,37℃培养24-48h;肺支原体接种到液体培养基中,一周后进行观察收集。按照细菌提取试剂盒方法提取各种病原体的DNA,泰泽氏菌DNA由中国食品药品检定研究院惠赠。
  2、引物的设计:通过查阅文献和Primer5.0软件设计金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌的特异性引物,使用Blast分析引物特异性;进行PCR扩增,测序鉴定。
  3、特异性实验和敏感性实验:PCR扩增非目的菌进行特异性实验;将模板DNA按照10倍的比例进行梯度稀释,检测PCR敏感性。
  4、四组多重PCR检测方法的建立和初步应用
  4.1.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,同时加入16S rRNA的引物作为内质控,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性。应用该多重反应体系检测人工感染的粪便样本和76例新鲜大、小鼠粪便样本,同时采用传统检测方法进行检测。
  4.2.将多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体三种病原微生物在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  4.3.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体五种病原微生物在同一个反应体系中扩增,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系,应用该多重反应体系检测人工感染病原菌的粪便、气管分泌物、棉拭子和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  4.4.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽氏菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测112例实验动物粪便样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  结果:
  1、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌在琼脂培养基上生长,肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。
  2、获得10对特异性引物,并通过Blast比对验证引物的特异性,扩增产物大小分别为金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)、通用引物(520 bp)、多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、肺支原体(266 bp)、泰泽氏菌(639 bp)、绿脓杆菌(197 bp),扩增产物测序结果均与Genebank中相应序列一致。
  3、PCR特异性和敏感性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性。敏感性实验:金黄色葡萄球菌DNA检测最低限为1pg;绿脓杆菌DNA检测最低限为10pg;肺炎克雷伯杆菌DNA检测最低限为10pg;多杀巴氏杆菌DNA检测最低限为1pg;支气管鲍特杆菌DNA检测最低限为10pg;肺支原体DNA检测最低限为1pg;泰泽氏菌DNA检测最低限为100 pg,对应的拷贝数600 copies/μL。
  4、四组多重PCR检测方法:
  4.1.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、肺炎克雷伯杆菌(368bp)和16S rRNA(520bp)的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测人工感染病原菌样本,检测结果均阳性;76份大、小鼠粪便样本多重PCR检测结果显示1份小鼠粪便样本绿脓杆菌阳性,其余样本检测阴性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR检测结果一致。
  4.2.建立多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)、肺支原体(266bp)的多重PCR检测方法;应用多重PCR方法检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔棉拭子样本多重PCR检测结果19例兔棉拭子样本多杀巴氏杆菌阳性,9例大鼠棉拭子肺支原体阳性;多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌传统培养检测方法检测结果全部阴性,肺支原体血清学方法检测9例阳性。
  4.3.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)和肺支原体(266bp)的多重PCR检测方法;应用多重PCR方法检测人工感染的粪便、气管分泌物和棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔粪便和棉拭子样本多重PCR检测结果1例小鼠粪便绿脓杆菌阳性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR结果一致,肺支原体血清学方法检测肺支原体全部阴性。
  4.4.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(197bp)和泰泽氏菌(639bp)的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测112例大小鼠、兔粪便样本检测结果全部阴性,传统培养鉴定方法检测金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌结果阴性,血清学方法检测泰泽氏菌全部阴性。
  结论:
  针对七种病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌和肺炎克雷伯杆菌,根据病原菌特点和检测取材方法,分别建立了四组多重PCR检测方法。四种组合均有良好的敏感性和特异性,人工感染的样本均检测结果阳性。多重PCR检测方法的初步应用显示,多重PCR具有良好的可操作性和准确性,检测结果与传统培养或血清学检测方法一致,有些样本传统培养方法或血清学检测方法未检测出的,但多重PCR体系检测出阳性结果。本方法的建立为今后多重PCR应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。
[硕士论文] 李雅婵
动物学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:导盲犬培训成本高,成功率低,目前导盲犬数量还远远不能满足视障人士的需求。如果能在导盲犬培训前期进行有效的筛选,预先甄别出待训犬中不适合成为导盲犬的犬,将能够提高导盲犬培训的成功率,降低培训成本。本研究拟通过气质测试联合心率分析来考察导盲犬培训对犬社会性及胆量的影响,以期探究出能够作为导盲犬培训前期筛选指标的有效变量,为导盲犬培训前期筛选适宜犬提供科学参考。
  方法:本研究选取中国导盲犬大连培训基地的45只犬,其中拉布拉多犬42只(雌性18只,雄性24只),金毛猎犬3只(雌性1只,雄性2只),这些犬在进行导盲犬培训前为8~12月龄,在导盲犬培训结束后为24~32月龄。采用犬的心理评估测试(dog mentality assessment,DMA)对这些犬进行行为学测试,在这些犬进行导盲犬培训前后各进行一次测试。DMA测试含有10个子测试,共含有33个变量。本研究选取能够反映犬社会性的社会接触测试中问候、合作、触摸变量,距离测试中探索、拔河、游戏邀请变量,扮鬼测试中接触变量及能够反映犬胆量的突然出现测试中惊吓、探索、躲避变量,金属响声测试中惊吓、探索、躲避变量,扮鬼测试中探索变量共14个变量。并实时记录测试过程中犬的心率变化。在测试结束后根据评分标准对犬的行为进行评分,进行培训前后行为分数及心率值的对比。
  结果:1.导盲犬培训对犬社会性影响:
  (1)社会接触测试中问候、合作、触摸变量在培训前后得分比较后差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析测试中变量的得分分布情况发现,在社会接触测试中的问候,合作,触摸3个相关变量培训前得分3分的犬最多,分别为19只,32只,26只,培训后犬得分集中于3分的趋势更加明显,培训后3个变量得分3分的犬分别为31只,37只,35只,均有所增加。培训后,大多数的犬在面对陌生人的问候时,与陌生人合作散步时以及与陌生人接触时表现出更加适中的社会性,既不会过分排斥,也不会出现过分依赖和热情的行为。
  (2)距离测试中探索和游戏邀请变量在培训前后犬只得分比较后差异无统计学意义(P>0.05),而拔河变量得分情况在培训前后差异有统计学意义(P=0.014)。分析培训前后得分分布情况发现,拔河变量得分在培训前1分最多(14只)而培训后更集中于4分(14只);探索变量培训前后均集中于3分(培训前:19只,培训后:24只);游戏邀请变量培训前后均集中于1分(培训前:31只,培训后:27只),且3分犬数量有所增多。距离测试中探索、拔河、游戏邀请变量得分1~5分分别对应犬对陌生人不感兴趣、不玩拔河、不邀请陌生人进行玩耍到犬与陌生人热情、积极的玩耍碎布、积极的邀请陌生人玩耍。
  (3)扮鬼测试中接触变量得分在培训前后差异没有统计学意义(P>0.05)。其培训前后得分分布情况显示,培训前更多的犬得2分(19只),而培训后犬得分更集中于4分(17只)。扮鬼测试中接触变量得2分的犬对陌生人主要表现出较警惕的行为,而得分4分的犬主要表现较为自然,会主动靠近陌生人进行嗅闻。
  2.导盲犬培训对犬胆量影响:
  (1)突然出现测试中除躲避变量外,惊吓和探索变量在培训前后的得分差异均有统计学意义(P=0.009和P=0.047)。分析导盲犬培训前后犬得分分布情况结果显示,培训前后惊吓变量中犬得分均集中于4分(培训前:15只,培训后:20只);探索变量培训前集中于3分(16只)而培训后更多的犬评分为4分(15只);躲避变量培训前后犬得分均集中于5分(培训前:20只,培训后:21只)。在培训后,更多的犬在面对突然拉起的衣服时会立即接近嗅闻,到周围探索,重复经过衣服时会呈现放松状态。
  (2)金属响声测试中惊吓、探索及躲避3个变量在培训前后得分差异无统计学意义(P>0.05)。进一步分析犬得分在培训前后的分布情况,结果显示,惊吓变量在培训后得分为3分的犬相对减少(培训期:15只,培训后:11只)而得5分的犬相对增多(培训前:7只,培训后:13只);探索变量培训前后得分均集中于4分(培训前:20只,培训后:19只);躲避变量培训前后均集中于5分(培训前:26只,培训后:27只)。金属响声测试中惊吓、探索、躲避变量犬只得分从1~5分分别对应着犬的行为从听见响声后惊吓逃跑,不敢接近声源,与声源保持一定距离到不在意声源,立即接近声源进行探索嗅闻及重复经过声源时身体放松,完全不逃避。
  (3)扮鬼测试中的探索变量在培训前后犬得分差异具有统计学意义(P=0.014)。得分分布情况显示,培训前犬得分1分或2分的较多(9只和9只),而培训后得分更集中于5分(11只)。培训后,更多的犬会立即主动接近陌生人进行探索,且表现出热情的行为
  3.导盲犬培训对测试中犬只心率影响:5个测试中犬心率值在培训前后比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
  结论:培训前后两次测试对犬的刺激程度相对稳定;社会接触测试中的问候、合作、触摸变量,距离测试中的探索、游戏邀请变量,突然出现测试中的躲避变量,金属响声测试中的惊吓、探索、躲避变量及扮鬼测试中的接触变量可作为导盲犬前期筛选的有效变量;距离测试中的拔河变量,突然出现测试中的惊吓、探索变量及扮鬼测试中的探索变量更适宜作为考察犬培训后期合格性的变量。本研究可为完善导盲犬前期筛选方法提供支持。
[硕士论文] 张玉红
运筹学与控制论 华中科技大学 2016(学位年度)
摘要:随着生物数学的发展,关于种群动态的模型研究有了长足的发展,尤其对于捕食模型的研究越来越深入,含有杂食性动物的捕食模型进入我们的研究视野,因此我们在经典捕食模型的基础上,研究含食腐动物的捕食模型,对三维捕食模型进行深入的数学上的分析与探讨。
  首先由于含食腐动物的捕食模型在坐标平面上是不变的,因此我们将三维模型限制在坐标平面上,讨论其平衡点的稳定性以及坐标平面内的全局渐近稳定性,即讨论当某一种群消亡时,在不同参数条件下另外两种群的种群数量发展趋势。接下来讨论了三维捕食模型的平衡点的存在性,利用线性化方法研究平衡点的稳定性,并给出稳定条件,借助Lyapunov方法考察全局渐近稳定性等。并且详细讨论了当第一卦限内不存在平衡点时,三种群数量发展趋势。当第一卦限内存在平衡点时,借助Matlab仿真,观察参数变化时产生的Hopf分叉现象。
  最后引进控制理论,证明该三维捕食模型在平衡点是可控的,因为可控,所以极点任意配置,从生物学意义上说,即利用控制手段,将平衡点附近的状态控制到平衡点上来,且在这种反馈控制下,此时平衡点是稳定的,这对于采取相应措施维持种间平衡进而维持生态系统的稳定具有较大的指导意义。将控制论的思想应用到生物数学模型中,进而对生物模型的人为控制提供方向性的指导,这具有特别重大意义。
[硕士论文] 李静
工业设计工程 西南交通大学 2016(学位年度)
摘要:在国外,动物园、公园、博物馆等园区的导览系统已经相对开放、自由和先进。而我国现有的动物园导览仍处于起步与发展阶段,管理方式传统、落后,实现形式单一陈旧。其中动物园作为城市建设和城市文化发展的标志,其配套设施的完善性和合理性不仅体现城市的精神面貌还能传达出文明社会对于文化产业的重视。在我国,园区管理和服务相对落后的现状下,实现科学、智慧的管理和服务是非常有必要的。
  本课题以重庆动物园为例,通过收集、整理相关资料,探讨动物园移动智慧导览和其周边产品的目标用户需求。旨在设计出一套针对手机用户学习和使用的移动智慧导览APP,并配套相应的儿童智能手表作为移动导览的周边产品设计。本文中笔者主要运用了目标导向的交互设计流程方法,采用用户访谈、调查问卷、用户角色模型等用户研究法对移动智慧导览及其周边产品的目标用户需求进行了概括,搭建出产品信息架构。在充分考虑用户需求和产品功能的基础上,寻找设计切入点,归纳出了移动智慧导览的设计要素和儿童智能手表的设计原则。利用产品测试总结设计的不足,并提出改进。完成了移动智慧导览APP及其周边产品的设计,完善了重庆动物园移动智慧导览系统体系。
[硕士论文] 刘飞
海洋生物学 宁波大学 2014(学位年度)
摘要:枝角类又简称“溞类”、“水溞”,俗称“红虫”,隶属于节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),鳃足亚纲(Babchiopoda),枝角目(Cladocera),广泛分布于淡水、海水和内陆半咸水中。枝角类对食物的选择是关系生长、生殖过程一个极其重要的因素,枝角类传统人工培养中一般以单细胞藻类、酵母、Banta液等作为饵料,比较费工费时,而以微颗粒紫菜粉作为枝角类饵料是一项新的尝试。研究结果可以为今后用紫菜粉大量培养枝角类提供理论依据。
  本研究于2012年6月至2013年9月间,研究了枝角类对紫菜粉的利用机制;探索微颗粒紫菜粉对枝角类的种群变化及生殖的影响;用GC/MS法分析比较了紫菜粉、小球藻、酵母、Banta液(牛粪1.5g+干稻草2g+沃土20g+水1000 cm3)4种食物条件下蚤状溞的脂肪酸组成;分析了紫菜粉投喂下蚤状溞对铜、镉毒性不良环境的适应能力;检测了紫菜粉投喂下的蚤状溞、蒙古裸腹溞SOD与POD酶活力大小。获得的研究结果总结如下:
  (1)实验证实微颗粒紫菜粉在培养枝角类的过程中发生自然酶解,酶解微生物普遍存在于环境中,水源微生物占主导作用,72h时其降解能力是空气和藻源微生物的3倍,是溞源微生物的2倍。
  (2)研究发现,枝角类不能利用紫菜粉酶解后的单糖等营养物质,而是利用粒径小于25um的细胞碎片及原生质体等。
  (3)通过观察紫菜粉及其酶解液投喂后蚤状溞和蒙古裸腹溞种群生长与生殖状态,发现直接投喂紫菜粉0.15mg/ml时蚤状溞种群增长最快,峰值密度为5.5ind/ml,与对照组差异不显著(p>0.05),净生殖力最大为72ind,仅为对照组的70%,蚤状溞的最大内禀增长率也出现在0.15mg/ml组,为1.6ind/d,与对照组无显著差异;蒙古裸腹溞0.075mg/ml组种群增长最快,峰值为0.9ind/ml,只有对照组的1/5(p<0.05),0.75%组净生殖力最大,为14.67 ind,仅为小球藻组1/2,最大内禀增长率在酶解液投喂0.75%组,且与对照组有显著差异(p<0.05)。因此认为紫菜粉可作为蚤状溞的合适饵料,但不能用于蒙古裸腹溞培养。
  (4)用GC/MS法分析比较了紫菜粉、小球藻、酵母、Banta液4种食物条件下蚤状溞的脂肪酸组成。结果表明,蚤状溞的总脂含量依次为39.80mg/g、60.10mg/g、44.60mg/g、52.30mg/g。一共检测出脂肪酸14种,其中8种饱和脂肪酸(SFA),2种单不饱和脂肪酸(MUFA),4种多不饱和脂肪酸(PUFA)。紫菜粉培养组PUFA含量显著高于酵母组和Banta液组(P<0.05),占总脂肪酸的1/3以上,酵母组MUFA含量最高(P<0.05),达55.73%,Banta液组以SFA含量最高(P<0.05),为52.45%。其中紫菜粉组的PUFA中缺乏C18:3,但C20:5(EPA)和C20:4(AA)百分含量高达22.67%和9.02%是小球藻组的1.6倍和4.5倍(P<0.05),而且EPA和 AA的实际含量也显著高于小球藻组(P<0.05),达到9.02mg/g和3.59mg/g;实验证实紫菜粉投喂的蚤状溞脂肪酸营养较高。
  (5)分析Cu2+、Cd2+对紫菜粉投喂下蚤状溞的影响,得到其24h、48h、72h、96h Cu2+对蚤状溞的半致死浓度分别为293.3ug/l、192.4ug/l、127.1ug/l和90.5ug/l;Cd2+的半致死浓度分别为432.1 ug/l、191.4 ug/l、135.7 ug/l、79.8 ug/l;Cu2+、Cd2+96h的安全浓度分别为0.9ug/l、0.798ug/l;蚤状溞的产仔量随 Cu2+、Cd2+浓度增加而逐渐减少,Cu2+达到1.0ug/l时,存活周期、产仔总量、产仔胎数等指标显著降低(p<0.05);Cd2+达到5ug/l时,也出现明显的下降。紫菜粉投喂下蚤状溞对 Cu2+、Cd2+耐受力不及对照组,表明紫菜粉投喂下蚤状溞对环境Cu2+、Cd2+的检测更加敏感。
  (6)通过对紫菜粉投喂下蚤状溞、蒙古裸腹溞SOD、POD活力的检测,发现紫菜粉投喂组的SOD和POD活力显著高于小球藻投喂组(p<0.05);在一定时间范围内紫菜粉投喂的蚤状溞和蒙古裸腹溞随饥饿时间延长SOD活力显著升高,而蚤状溞POD活力下降,蒙古裸腹溞POD活力则无显著变化;紫菜粉投喂下蚤状溞CuZn-SOD基因的相对表达量与SOD活力想对应,显著高于小球藻投喂组(p<0.05)。与认为紫菜粉投喂下蚤状溞抗氧化能力强于小球藻培养。
  综合以上多项研究结果,可以认为微颗粒紫菜粉完全可以替代传统饵料作为蚤状溞的新型合适饵料,并且紫菜粉投喂下蚤状溞的抗逆性更强,对环境变化更敏感,但对于蒙古裸腹溞的人工培养,紫菜粉还不能作为合适饵料。
[博士论文] 胡林林
动物遗传育种与繁殖 广西大学 2014(学位年度)
摘要:细胞基因修饰技术和体细胞核移植技术相结合成为生产转基因动物的一种有效方法。小型猪在体积、新陈代谢、器官组织结构和基因组等方面都与人的极为相似,是人类疾病模型的首选动物。转基因克隆猪的生产对农业、生物医学和基础研究都具有重要的应用价值,目前猪的克隆效率低,限制了其在多个领域的应用。因此,本研究是为建立高效稳定的转基因克隆猪的生产平台,并在此基础上优化转基因克隆猪生产的技术程序,以期提高转基因克隆猪的生产效率,为转基因克隆猪更广泛的应用奠定基础。本研究的试验方法和结果简述如下:
  1.巴马小型猪体细胞的分离培养
  本实验从出生3日的巴马小型猪成功分离出了巴马小型猪肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞。对细胞类型进行免疫组化染色鉴定时,肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维细胞,抗波形蛋白均显阳性,抗角形蛋白显阴性。根据组织来源、细胞的形态及免疫组化结果表明:本实验成功分离出三种组织来源的成纤维细胞。
  2.转基因细胞系的建立及其生物学特性的研究
  转基因克隆胚胎生产中,建立高质量的转基因阳性细胞系是获得克隆动物的关键。本章试验结果如下:细胞转染hGFAP-DsRed基因后,经博莱霉素筛选获得了肾脏、睾丸和耳部细胞转基因克隆斑,PCR鉴定结果与目的片段大小一致,所获得的克隆斑为转基因体细胞。检测了转基因细胞是否被微生物(细菌、真菌、病毒)污染,三种转基因细胞的培养液均未见浑浊现象,结果表明,转基因肾脏、睾丸和耳朵成纤维细胞均未被细菌和真菌污染;用红细胞吸附实验检测转基因细胞系是否被病毒污染,结果未见细胞凝聚成团或者与体细胞吸附,表明3种不同组织来源的转基因成纤维细胞未被病毒污染;采用PCR和Hoechst33342染色检测支原体污染,结果为阴性;分析不同代次转基因细胞的核型,结果表明,随着代次的增大正常2倍体细胞的比率有降低的趋势,但差异不显著;对转基因细胞系进行了长期的传代培养,转基因肾脏成纤维细胞目前已传至56代,转基因耳部成纤维细胞传至30代,转基因睾丸成纤维细胞传至25代。总之,本试验成功建立了3种类型转基因细胞系,为后续的体细胞核移植实验提供了高质量,充足的转基因供体细胞。
  3.转基因克隆胚胎融合/激活条件的优化
  融合/激活是体细胞核移植重构胚胎构建关键的一步,只有经过融合、激活的胚胎才能开始重编程,启动基因表达,继续发育。本实验优化了转基因克隆胚胎融合/激活的参数,结果如下:脉冲时程30μs,1次脉冲,场强1.5kv/cm组,融合率(87.32%)和分裂率(69.79%)显著高于1.0KV/cm(78.63%,45.07%)和2.0kv/cm(63.87%,36.72%)。囊胚率显著高于1.0kv/cm和2.0kv/cm(21.74%vs.9.65%,5.49%,P<0.05);脉冲时程30μs时,融合率(81.92%)和囊胚率(19.56%)显著高于20μs(69.19%,7.51%)和40μs(69.28%,6.51%),(P<0.05);3次脉冲组的融合率(63.32%vs.81.92%,81.59%, P<0.05)、分裂率(38.09%vs.63.40%,67.46%, P<0.05)和囊胚率(5.49% vs.33.15%,12.97%,P<0.05)均显著低于1次脉冲和2次脉冲组;而在相同脉冲次数和脉冲时间下,转基因克隆胚胎需要的场强相对要大。总之,本实验室条件下,最适合于转基因克隆猪胚胎生产的融合/激活参数是1.5kv/cm、30μs和1次脉冲。
  4.供体细胞的细胞周期、细胞种类和细胞代次对转基因克隆胚发育的影响
  供体细胞所处的细胞周期,细胞种类和细胞代次对体细胞核移植胚胎的发育潜能有很大的影响,本实验检测了血清饥饿、Roscovitine和接触抑制法对转基因细胞同期化效果以及三个处理组细胞作为供体核对重构胚胎发育能力的影响;比较了不同类型的转基因供体细胞作为供体核对构建重构胚胎发育潜能的影响;采用第10、20、30代的转基因肾脏成纤维细胞作为供体核,研究细胞的代次对转基因克隆胚胎发育潜能的影响。研究结果如下:三种同期化方法均能将80%以上的细胞处于G0/G1期,接触抑制和roscovitine组显著高于血清饥饿组(92.11%,89.59%vs.80.82%,P<0.05);相反,处于S期的细胞,血清饥饿组显著高于接触抑制组和roscovitine(14.99%vs.2.54%,6.34%,P<0.05);处于G2/M期的细胞,三组之间差异不显著(P>0.05);血清饥饿组、接触抑制组和roscovitine处理组,细胞凋亡率分别为(14.13%,6.71%,2.46%),血清饥饿组细胞凋亡率显著高于另外两组(P<0.05)。检测了三个处理组的细胞BAX,BCL-2的相对表达量,BAX的表达量以血清饥饿组最高,而血清饥饿组BCL-2表达量最低。结果表明:血清饥饿能够增加转基因细胞的凋亡率,roscovitine能够降低转基因细胞的凋亡率;以三种细胞为供体核所获得囊胚率,血清饥饿组显著低于roscovitine组和接触抑制组(14.2%vs.21.30%,20.3%,P<0.05)。转基因肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维作为供体核构建的克隆胚胎囊胚发育率差异不显著(18.08%,10.19%,10.76%,P>0.05)。结果表明:三种类型的转基因细胞均支持克隆胚胎的发育,以肾脏成纤维细胞为供体时囊胚率最高,肾脏成纤维细胞更适合于转基因克隆猪生产的核供体细胞。
  5.Oxamflatin对转基因克隆猪胚胎发育的影响
  体细胞核错误的表观遗传重编程是引起克隆低效率的主要原因,有研究表明,通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂,如oxamflatin能够提高体细胞核移植胚胎的发育潜能,本实验研究oxamflatin对猪转基因克隆胚胎发育的影响。结果如下:用1μM的oxamflatin处理克隆胚胎12h,与对照组相比能够显著提高转基因克隆猪的发育能力(29.63%vs.17.53%,p<0.05),oxamflatin能够改变AcH4K8的表观遗传状态,提高了转基因克隆胚胎2-cell,囊胚期胚胎的组蛋白乙酰化水平,使AcH4K8组蛋白乙酰化水平更接近与体外受精(IVF)胚胎,显著提高了转基因克隆猪胚胎的体外发育能力,oxamflatin能够提高与胚胎发育相关多能基因(Oct-4,Sox-2,Nanog)和抗凋亡基因(BCL-2)的相对表达量,降低促凋亡基因(BAX)的表达。总之,组蛋白乙酰化酶抑制剂oxamflatin能够改变转基因克隆胚胎的表观遗传状态和基因表达,增加囊胚率,提高核的重编程能力和胚胎的发育潜能。
  6.利用本研究建立的体系进行胚胎移植,胚胎移植后获得3头克隆猪,经PCR扩增、制作冰冻切片在荧光显微镜下观察和Western Blotting等方法进行初步鉴定,其中一头被鉴定为转hGFAP-DsRed基因阳性克隆猪。
[硕士论文] 盛俊杰
法律学 山东大学 2013(学位年度)
摘要:实验动物是生命科学发展的基础和重要支撑条件,是现代科学技术不可分割的组成部分,是衡量一个国家和地区科学技术水平高低的重要标志之一。随着生物技术的迅猛发展、生命科学的高速发展和医药生物技术产业的不断进步,实验动物科学得到了前所未有的飞速发展,越来越受到世界各国政府的重视和关注。
  在英美日等发达国家,实验动物的法制化建设已经非常完善,实验动物广泛地与许多领域科学实验研究紧密联系在一起,为人类的科学研究做出了极大的贡献。我国的实验动物法制化管理起步较晚,经过几十年的发展,也取得了长足的进步,但是与发达国家之间尚存在着不小的差距。
  本文首先介绍了实验动物管理与发展的概况,而后通过阐述中外实验动物管理法制化的现状和比较,提出了加强我国实验动物管理法制化建设的必要性以及现实中存在的问题,最后就如何完善中国实验动物管理体系、推动实验动物法制化建设进行了思考和阐述。
[硕士论文] 柯贤福
兽医学 浙江大学 2012(学位年度)
摘要:实验动物(laboratory animal),指经人工培育,对其携带微生物和寄生虫实行控制,遗传背景明确或者来源清楚,用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。作为生命科学研究的四大要素(AEIR,即animal,equipment,information,reagent)之一,实验动物的重要性日益显现。近些年来,无论是国外还是国内,实验动物学科均越来越受到各级政府的重视。要想抢占生物医药产业的制高点,作为支撑条件的实验动物,必须也必将得到快速发展。为全面掌握我省实验动物的现状,充分了解我们的优势,找出我省的不足,有必要对我省实验动物进行详细的调查,并进行对策研究,以期提高该学科的地位,最终促进学科发展,适应经济转型发展的需求。
   1.浙江省实验动物现状调查
   采用问卷调查、电话回访、专家咨询及网络搜索等方式,对我省实验动物基本情况包括从业人员、设施设备等进行统计。分析人员分布情况及不同级别动物设施的构成情况。结果显示,我省大小鼠的生产与使用存在约15%的缺口;而实验兔的缺口较大,约70%左右;大动物如犬、猴等,基本能满足实验需求。我省实验动物从业人员的持证上岗比例达到90%,且有逐年增加的趋势。我国实验动物实行许可证管理制度,通过对来自省动管办的相关数据进行统计,分析我省实验动物许可证的地域分布情况,以及实验动物生产、动物实验的空间分布,为进一步整合资源,合作共享提供依据。结果显示,我省共有56家单位申请实验动物许可证,但地区分布明显不均,其中杭州市约占48%,而金华、衢州、嘉兴等地分别只有1家,占2%。
   2.浙江省实验动物发展对策研究分析
   我省实验动物亟需解决的重大问题,根据专家的意见,结合各行业对实验动物的需求情况,研究制定我省实验动物十二五发展思路。十二五期间,我省应在全面实施实验动物许可证管理的基础上,着重做好实验动物网络化管理工作,同时注重资源整合和共享,抓住我省特有实验动物资源,提升整体实力,促进行业发展。具体包括以下几方面工作:一是继续加强和完善实验动物法律法规体系建设;二是以实验动物许可证管理工作为核心,继续加强实验动物质量检测、完善实验动物技术标准等工作;三是继续加强实验动物资源建设,特别是我省具有优势实验动物资源的研究开发,加强我省实验动物种质资源库建设,推进实验动物资源的整合和共享体系的建设;四是培养一支结构合理、具有创新精神的实验动物科研、生产和管理队伍。实验动物有携带人畜共患病或重要传染病的可能,生物安全工作非常重要。通过研究,制定我省实验动物生物安全的应急预案,确保人民健康。强调突发重大事件的监测、预警、报告与确认,完善快速反应机制;规范突发事件的报告与确认程序;规定应急处理的各项措施。此外,信息化管理有助于实验动物事业的进一步发展,利用信息技术对实验动物生产及使用的全过程进行跟踪,并实现许可证的网上管理,提高工作效率,促进共享互利。
   我省实验动物近年发展迅速,取得较大进步,促进了相关产业的发展。同时也存在不足,如实验动物产能不足,无法满足生物医药产业快速发展的需求;实验动物从业人员整体素质有待提高;实验动物学科地位不高;实验动物信息化建设滞后等。实验动物发展至关重要,今后需要着力解决上述存在的不足,切实提高我省实验动物水平,全面推进我省生物医药等产业快速发展。
[硕士论文] 齐长永
实验动物学 南京农业大学 2012(学位年度)
摘要:随着医学和生命科学等高新技术的飞速发展,人们对实验动物的要求也愈来愈高。目前,国际上已广泛生产和使用标准化的实验动物,我国也逐步实现实验动物的标准化,建立和健全了各项法规,使实验动物工作有了较大发展。实验动物科学的发展趋势,其中一个重要的表现就是实验动物标准化,包括实验动物生产条件的标准化、动物实验条件的标准化。实验动物标准的提高,使得实验数据更加准确可靠。因此,只有采用标准化的实验动物,研究结果特别是药物、生物制剂等的安全性、有效性才能得到国际认可,才能进入国际市场。
   目前,国际上公认的标准化实验动物为SPF级动物。SPF级动物排除了某些特定的病原体,避免了病原体的隐性感染或潜伏感染对实验结果的干扰,避免了条件性致病菌对实验的干扰,因此实验结果准确可靠,在生物医学各个领域的研究中得到了广泛的应用和肯定,适合于微生物学、病理学、肿瘤学、免疫学、药理学等方面的科学研究。因此生产足够数量的、合乎标准的SPF级动物是一项首当其冲的工作。要想获得优质的标准化的实验动物,必须依靠严格的生产与管理。
   本文以南京医科大学实验动物中心SPF级实验动物屏障设施作为研究对象,探讨了屏障系统设施的设计、布局及微生物污染的控制,分析了该中心屏障系统改造前后环境与动物生产的变化。屏障系统改造升级后,经检验,送排风量、温湿度、空气洁净度和区域间的梯度压差等参数合适而稳定,内环境可控性增强,饲养空间得到最大程度的利用,SPF级大小鼠品系扩大,动物年产量有了大幅提高,改造后实验动物产量是屏障系统改造前生产量的4倍左右,且完全符合SPF/VAF(@)标准。另外,改造后屏障环境实验动物设施运行中SPF大、小鼠生产繁殖采用严格的规范化管理及环境控制,生产的实验动物均未检出任何SPF级大、小鼠需排除的寄生虫、细菌和病毒等,符合国标要求。
   SPF级实验动物设施环境控制及饲养管理的标准高,要求严,不论哪一个环节不规范都有可能导致对整个设施的污染,进而影响实验动物质量。因此,在SPF级动物的饲育管理中,严格控制饲育、管理、操作中的微生物状况,可使环境因素更标准化,实验动物质量及动物实验条件更加标准化,动物实验管理更加规范化,从而提高我们的科研质量和水平。
[硕士论文] 朱博
中西医结合 广西中医药大学 2012(学位年度)
摘要:目的:对树鼩Toll样受体1(Toll like receptor1,TLR1)基因进行克隆和测序,对其序列进行分析以了解其蛋白结构及相关功能。为今后应用树鼩作为病毒感染动物模型开展病毒识别机制和防治策略研究提供理论基础。
  方法:在GenBank中查找人类、黑猩猩、猕猴、小鼠、褐家鼠、成都麻羊、野马、野猪、中国荷斯坦牛、家犬共十种物种的TLR1的mRNA基因序列,在其高度保守区设计树鼩TLR1基因的简并引物;运用RT-PCR方法从树鼩外周血总RNA中体外扩增树鼩TLR1的cDNA基因序列;将扩增的目的基因片段纯化回收与T载体连接;转化感受态细菌,筛选阳性克隆子并用菌落PCR验证;转化成功后进行测序,将测序结果用NCBI的BLAST工具进行检索比对序列,确认其为树鼩TLR1基因序列;并用生物信息学软件对序列结构进行分析预测。
  结果:1.在体外成功扩增出树鼩TLR1的cDNA片段,回收获得其目的基因片段;2.成功筛选出阳性克隆子并进行DNA测序,获得树鼩TLR1的cDNA部分基因序列,序列长度为1110bp。
  结论:运用生物信息学软件对树鼩TLR1基因序列进行分析,预测该基因序列编码370个氨基酸,包括了TLR1序列跨膜区、C端富含亮氨酸重复基序(LRR)结构域和部分胞外区,分子量为42.33kDa,等电点为8.24。含有11个丝氨酸(Ser)、3个苏氨酸(Thr)和6个酪氨酸(Tyr)位点可能成为蛋白质的磷酸化位点。氨基酸序列比对分析表明,树鼩TLR1基因序列与人类的TLR1基因序列具有很高的同源性,树鼩作为实验动物模型其实验结果更具参考价值。
[硕士论文] 宋小晶
水生生物学 上海海洋大学 2012(学位年度)
摘要:布氏鲸(Balaenoptera edeni)为主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的暖温水域的大型海洋哺乳动物,成年体长可达11.5-14.5m,体重达12-20吨。布氏鲸在 IUCN濒危物种红色名录的保护级别中属于DD级,但在我国较少见,是国家二级保护动物。布氏鲸体型修长优雅,是生物和环境科普教育的理想教具,但目前国内的同类标本还很少。
  制革业的鞣制技术使鞣剂取代了皮肤中的可溶性蛋白,承担连接结构的中介,增加了胶原结构的稳定性,提高了收缩温度及耐湿热稳定性。鞣制的过程是皮张由生皮变成熟皮的过程,皮张的稳定性提高,不易收缩变形。现代动物标本的制作力求形态逼真,追求真实性与艺术性并存,不仅注重标本的整体形态,而且注重细微结构的体现,对动物标本的制作工艺特别是假体制作提出了更高的要求。
  本研究以2009年搁浅死亡的一头大型布氏鲸为材料,以制革鞣制技术为基础并结合现代假体制作技术,制作了布氏鲸的剥制标本,为鲸类剥制标本的制作提供了一套新方法并希望通过此标本的展示提高人们的环境保护意识和野生动物保护意识。
  1、皮张处理之前,利用组织切片和氯仿甲醇法对布氏鲸皮肤的组织结构和脂肪含量进行了研究。结果表明,真皮厚15-35mm,厚度差2.3倍。除尾部含少量弹性纤维外,其他部位的真皮层仅有胶原纤维,其直径为1.08±0.25μm(n=180),排列疏松呈网状。脂肪充斥于胶原纤维之间,喉、胸、腹和尾部真皮的含脂量分别为19.42%,29.36%,36.89%和13.06%,部位间差异极显著(P<0.01)。
  2、参照一般的制革鞣制工序来处理布氏鲸的皮张,主要包括浸水、脱脂、浸灰与脱灰、软化与浸酸、鞣制与复鞣以及中和与加脂。选用了制革厂常用的各类化学制剂和物理处理方法,但在每道工序中选用的具体化学制剂及其配比、机械处理过程以及工艺条件等,都依据了本研究材料的组织结构特点而进行了特别的设计。处理的重点主要放在鲸皮脂肪的去除,以及喉部和尾部胶原纤维的松散上面。经切片和氯仿甲醇法验证,胸部和腹部真皮的含脂量分别从29.36%和36.89%下降至4.04%和5.57%,总的脱脂率达到了86.24%和84.90%,基本达到了标本制作的脱脂要求。
  3、以重量轻,结构坚固为基本理念,以不锈钢为材料制作了布氏鲸的模型。模型制作好以后无需翻模可直接进行后续的操作。此模型完全按照布氏鲸原来尺寸大小,全部由不锈钢材料焊接而成,里面无需填充任何东西,不仅重量轻,而且结构非常坚固。根据布氏鲸的生活环境以及行为特征,确定布氏鲸为流线型修长的体型,活泼游泳的姿态。最后,布氏鲸的体色确定为喉胸部的颜色黄白色,背部和尾部的颜色深蓝黑色。
  4、标本制作完成以后,一头栩栩如生的布氏鲸将展现在我们的眼前。流线型修长的躯体,背部稍微拱起;纤细的胸鳍张开,像船桨般奋力划水;深叉状巨大的尾鳍向下弯曲,正在积蓄着能量均显示出这是一种体型十分优雅的大型须鲸。裙褶状多皱的喉胸部,镰刀状高耸的背鳍,微微张开的嘴巴把布氏鲸刻画的更加惟妙惟肖。黄白色的喉胸部、深蓝黑色的背部和尾部,显示出布氏鲸体色美丽悦目的一面。整个标本看起来就像一头刚刚跃出水面的深海精灵,闪着两颗灵动的眼睛。布氏鲸活泼的性情,优雅的体态,悦目的体色都得到了淋漓尽致的表现,观赏此标本的时候让我们感觉自己仿佛置身浩瀚的大海而情不自禁地忘返流连。但由于陈列本头布氏鲸标本的上海科技馆静安寺新馆尚未完工,舌和须的安装以及外形的涂饰等工序还未进行。
[博士论文] 刘金
动物学 湖南师范大学 2012(学位年度)
摘要:本研究以昆明小鼠为动物模型(animalmodel),应用行为学、环境生态学、毒理学、生理学、遗传学、发育生物学、蛋白质组学和数理生态学等研究方法,从生理生化、毒理病理、生殖发育和遗传多样性等方面对转Bar基因抗除草剂稻谷的安全性进行了综合评价。
   1.选取6周龄、体重18~22g的SPF级昆明小鼠200只,按编号随机分成5组,每组4个重复,每个重复10只小鼠,雌雄各半。用不同含量(40%和60%)的转Bar基因抗除草剂稻谷及其亲本非转基因稻谷日粮分别喂养小鼠,亲代小鼠饲养90天后开始繁殖子一代(F1),子一代饲养90天后开始繁殖子二代(F2),每代小鼠饲养180天。在180后分别从亲代、子一代和子二代每组按编号随机抓取10只小鼠对其血常规、血生化指标和主要脏器指数进行了检测。结果显示,P、F1和F2三代小鼠中,各处理组间器官指数和血生理生化指标均不存在显著差异(P>0.05),转Bar基因抗除草剂稻谷对小鼠的生长、器官发育以及血生理生化未产生显著影响。
   2.将120只SPF级昆明小鼠分为5组,每组4个重复,每个重复6只小鼠,雌雄各半,分别饲喂含不同剂量转基因稻谷Bar68-1和常规非转基因稻谷D68180天,持续3代。采用SDAP、FARRP和NCBI三大数据库对磷丝菌素乙酰转移酶(PAT)进行致敏原序列对比,并用蛋白质结构模拟SWISS-MODEL预测PAT的三维构象并对其进行分析。每组按编号随机抽样6只小鼠,用ELISA分别检测其肠道粘液免疫球蛋白A(sIgA)、血清二胺氧化酶(DAO)和血清免疫球蛋白E(IgE)。蛋白质生物信息学比对结果表明,PAT酶与数据库中已知致敏原无同源性,三维构象亦表明其与其他N-乙酰转移酶大家族(NATSF)成员相似,无致敏性;转基因组与非转基因组小鼠比较,sIgA、DAO和IgE三项检测指标值均无显著性差异(P>0.05)。结果显示,转Bar基因的稻谷对小鼠无明显致敏性。
   3.选择体重在18~22gSPF级昆明小鼠100只,按编号随机分成5组,分别饲喂含不同剂量(40%和60%)的转基因稻谷Bar68-1和常规非转基因稻谷D68180天,持续2代。180天后每组按编号随机抓取6只小鼠,分别检测其腿肌、肝脏、肾脏、脾脏、小肠中是否含有Bar基因片段和其表达蛋白-磷丝菌素乙酰转移酶(PAT),进而探讨转基因成分在小鼠体内的代谢残留状况;同时,还进行了小鼠消化道内对外源蛋白消化降解情况的初步检测,并对小肠线粒体(mtDNA)基因组12SrDNA和16SrDNA保守区域测序。结果表明:采用定性PCR法检测的实验组小鼠各脏器组织中没有发现Bar基因片段和其表达的PAT蛋白酶;而小鼠消化道外源蛋白检测结果表明PAT酶在胃肠道内无耐受性,外源蛋白成分能够被机体完全消化;小鼠小肠线粒体(mtDNA)基因组12SrDNA和16SrDNA保守区域的测序结果也无异常,没有发现突变点。
   4.选取6周龄、体重18~22g的SPF级昆明小鼠120只,按编号随机分成5组,每组4个重复,每个重复6只小鼠,雌雄各半。用不同含量(40%和60%)的转Bar基因抗除草剂稻谷和非转基因稻谷日粮分别喂养小鼠,亲代小鼠饲养90天后开始繁殖子一代(F1),每代小鼠饲养180天。在180后分别从亲代和子一代每组按编号随机抓取6只小鼠,提取肠道内容物基因组DNA,利用细菌通用引物对细菌16SrDNA的V3区序列进行PCR扩增,并将扩增产物用变性梯度凝胶电泳(DGGE)后进行比较、分析,并对小鼠肠道微生物主要优势菌群进行了鉴别。结果显示,饲喂转Bar基因抗除草剂稻谷和非转基因稻谷日粮的小鼠肠道细菌种类和数量相似度大,无显著差异(P>0.05),转Bar基因抗除草剂稻谷对小鼠肠道微生物区系的种类、数量和分布没有产生显著影响。
   5.通过体外实验评价转基因大米Bar68-1的细胞毒性,分别以25、50、100和200μg/mL转基因大米Bar68-1全蛋白作用于昆明小鼠淋巴细胞,并各孵育2h、6h、24h,然后用CCK-8及中性红摄取试验检测细胞毒性大小。在经过不同的孵育时间段后,阳性对照组淋巴细胞的细胞存活率与空白对照组相比,存在显著差异(P<0.05)。其中,CCK-8试验、中性红试验测得细胞存活率存在着明显的损伤作用-时间效应关系。转基因大米Bar68-1全蛋白暴露组淋巴细胞存活率与非转基因大米D68全蛋白暴露组淋巴细胞相比无明显差异(P>0.05),且与空白对照组细胞差异不显著(P>0.05)。结果显示,转基因大米Bar68-1与非转基因大米D68两者在细胞毒性上性状相似,实质等同,对淋巴细胞无明显毒性作用。
   6.为探测PAT酶长期胁迫下小鼠遗传多态性的变化,应用AFLP技术对饲喂转Bar基因抗除草剂稻谷子二代(F2)小鼠遗传多样性进行了研究分析。36只体重18~22g的F2代小鼠分为实验组(Z2)和对照组(C2),分别饲喂Bar基因稻谷Bar68-1和非转基因稻谷D68。每组3个重复,每个重复6只小鼠,雌雄各半。6对引物组合扩增出108个AFLP条带,其中多态性条带占25.9%。在聚类图上Z2组肝脏和小肠样品和C2组肝脏和小肠样品有微小差异,但差异不明显。结果表明,PAT对小鼠肝脏和小肠的DNA多态性没有明显影响。
[硕士论文] 王淑菁
免疫学 中国食品药品检定研究院;中国药品生物制品检定所 2011(学位年度)
摘要:近年来,随着分子生物学技术的快速发展,实验动物遗传检测方法不断改进和提高,从蛋白到基因组序列,从宏观到微观,以达到准确、快速、高通量的检测要求。目前,国内外对近交系小鼠SNP遗传检测的研究较多,而对大鼠 SNP遗传标记的研究较少,尤其是针对主要组织相容性复合体(RT1)上SNP遗传标记的研究尚未见报道。主要组织相容性复合体(RT1)是决定近交系大鼠免疫遗传品质最主要的基因群,也是进行遗传学检测的一个重要研究领域。本论文主要研究近交系大鼠遗传检测的分子生物学方法,以大鼠 RT1复合物基因组中具有多态性的单个核苷酸(SNP)为研究对象,利用分子生物学技术,建立了三种SNP遗传检测方法,为实验大鼠的遗传质量控制进一步完善我国实验动物提供新的遗传检测技术手段。
  本研究分为三个方面。第一部分是建立近交系大鼠 SNP直接测序分型的遗传检测方法。通过比对NCBI Nucleiotide数据库,查询BN与F344近交系大鼠多态性程度高的区域即RT1区序列,选定多态性信息丰富的5个区域(A区、B区、C区、D区、E区),以国内7种近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ和HFJ)为模板进行扩增,目的片段经直接测序后进行序列比对,结果显示共获得10个SNP多态性位点,即A区序列545位(A/G);B区序列279位(T/C)、548位(A/C);C区序列207位(C/T)、356位(T/C)、386位(C/T);D区序列192位(A/G);E区序列135位(C/T)、425位(A/G)、683位(A存在/缺失)。其中5个SNP位点已在NCBI SNP数据库中公布且获得RS号。此外,3个区域(B区、CD区、E区)的多态性信息丰富,每300bp包含1个SNP位点。不同品系大鼠在这5个区域上拥有不同的基因型,由此建立 SNP直接测序的遗传检测方法,能够对常用近交系大鼠和新培育品系进行遗传检测及鉴定研究。
  第二部分是建立近交系大鼠SNP荧光定量PCR的遗传检测方法。在大鼠RT1区选择9个有效的SNP位点(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591),并设计相应的Taqman MGB探针。制备每个SNP位点不同基因型的质粒对照品,以验证探针的特异性。验证结果显示表明,2个Taqman MGB探针(RS13457316、RS8156941)荧光扩增信号不强并无法准确判定SNP位点的基因型,检测效果较差,另外;7个探针能够准确判定对照品的基因型,特异性强。使用这7个探针检测能够鉴别国内常用大鼠品系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和新培育品系(MIJ、HFJ)的基因型,根据SNP位点基因型的差异鉴别不同品系的遗传背景,建立近交系大鼠 SNP荧光定量 PCR遗传检测方法。实验中对于鉴别LEW/WKY、MIJ/HFJ这种亲缘关系较近的品系,仍需要在研究中扩大检测的SNP位点数目进行区分。
  第三部分是建立高保真酶特异性 SNP遗传检测方法。在单管双向等位基因特异性 PCR中引入高保真酶的校正机制和硫代磷酸化修饰引物的抗外切酶作用,建立高保真酶特异性SNP检测方法。在RT1区1717个SNP位点中选择多态性信息含量丰富的12个SNP为遗传检测位点(RS13458024、RS13457316、RS13456231、RS8159611、RS8149053、RS8156941、RS8166089、RS8160925、RS13448591、RS13451966、RS8158177、RS13458074),经实验优化后得到9个SNP位点的高保真酶检测体系。该体系能够对国内5种大鼠近交系(BN、F344、WKY、LEW、SHR)和2种新培育品系(MIJ和HFJ)进行基因型检测和品系间鉴定,其基因型结果均经测序验证,证实方法的特异性和可靠性。此外其次,使用该方法对国内培育的30只SD大鼠进行遗传检测。在9个SNP位点上,其中4个位点在SD群体中完全纯合,在RS13448591(A/G)、RS13458024(A/G)、RS13458074(T/C)、RS13457316(A/G)、RS13456231(T/C)这5个位点上出现杂合型,群体统计学分析结果显示,观察得到杂合子基因型频率观察值依次为0.1667,0.4333,0.4667,0.2667,0.1000,期望杂合度Nei(1973)依次为0.1528,0.4061,0.4444,0.2778,0.0950,遗传多样性Shannon指数(I)依次为0.2868,0.5961,0.6365,0.4506,0.1985,对这5个多态性位点的群体基因型进行X2检验,显示其P值均大于0.05,群体统计学分析结果显示该群体符合Hardy-Weinberg平衡,样本具有代表性。并使用Shannon指数(I)和期望杂合度(Nei’1973)写出数值对该SD大鼠封闭群内遗传多样性进行描述。
  本研究中,以SNP为遗传标记,分别使用直接测序技术、荧光定量PCR技术及高保真酶特异性检测技术,建立三种不同的SNP基因型遗传标记的检测体系,并把这些方法应用于近交系大鼠常用品系和新培育品系的遗传检测中,。此外,还对封闭群大鼠的SNP位点的基因型进行研究,对其基因频率、基因型频率及杂合性进行了探讨。这些研究不仅为各近交大鼠品系间的鉴定提供了实验依据,而且还为近交系和封闭群大鼠的遗传检测提供了新方法技术。本研究对提高我国实验动物遗传检测技术水平,促进生命科学发展具有重要意义。
[硕士论文] 姜伟伟
动物营养与饲料科学 广西大学 2011(学位年度)
摘要:本实验以竹鼠消化道为出发点,用较常用的生化技术,从酶活和微生物两方面对其进行研究,为以后科学地养殖竹鼠提供理论依据,从而提高竹鼠的繁殖率和生长率,进而扩大整个产业的经济效益,更为重要的是可以利用竹鼠消化道中特殊的微生物和消化酶于实际生产中,最终造福人类。
   第一部分:竹鼠消化道酶活的测定
   结果表明,同一种酶在消化道的不同部位活力相差较大,同一部位的不同酶活力也不尽相同。竹鼠消化道各段蛋白酶活性不同,但均很低,说明竹鼠消化蛋白质的能力较差,因此在人工喂养时应对含蛋白质类饲料进行控制,否则可能会引起消化不良、腹泻等。滤纸酶活性不同,但也偏低,说明虽然纤维素性食物是竹鼠的主粮,但并不能很好的消化吸收所有种类的纤维素,消化某些纤维素的能力较差,因此在人工喂养时应注意对含纤维素的食物选择性的饲喂,否则不但不能提高产量,反而会减产。
   第二部分:竹鼠消化道纤维分解菌的分离筛选及酶活力研究
   竹鼠十二指肠、空回肠、盲结肠的食糜和内壁刮取物富集培养结束后,在初筛培养基上经过反复划线分离,共得到23株单菌落,并接入斜面种子培养基保存。将保藏菌株点种于刚果红平板培养基上,培养结束后测透明圈直径,经过比较,选取直径大的菌株进行下一步的复筛,共得到12株透明圈直径相对较大的菌株,采用摇瓶发酵培养基进一步选出酶活最高的菌株共3株,其中菌株A来自回肠,B和C来自盲肠。
   菌株A在39℃时酶活力较高,为其产酶的最适温度。B在34~39℃时酶活力较高,变化不大,其中39℃为其产酶的最适温度,C在34~44℃时酶活力较高,变化也不大,且44℃为其产酶的最适温度,此时的酶活力达到了36.9U,而34℃时也达到了很高的35.8U。
   三株菌在32h时产酶量逐渐增大,其中40~48h时产酶量增加的非常明显,48h时酶活力最高,其中C的最高酶活力达到了30.8U,48h之后三株菌的产酶能力都普遍逐渐降低。
   第三部分:竹鼠消化道微生物多样性的分析
   竹鼠消化道十二指肠与结肠的同源性最高,达67.8%,与盲肠的同源性也比较高,可达60.9%。空肠与盲肠的相似系数达52.6%,但与结肠的同源性较低,仅为37.8%,回肠与盲肠结肠同源性较高,分别为54.5%和60.1%,盲肠与结肠同源性最高可达66.8%。盲肠与其他部位的相似系数普遍较高,说明竹鼠消化道盲肠部位的微生物多样性最丰富,与其他部位的联系最紧密,而结肠与其他部位的相似系数也普遍较高,应该是与内容物的消化过程有关--消化道前端部分的微生物随着内容物的运动也来到了结肠部位,而空肠的普遍较低,说明与其他部位相比比较特殊,有进一步研究的价值。
[硕士论文] 李伟
动物学 西南大学 2011(学位年度)
摘要:人类是由10%的人体细胞和90%的微生物细胞共同组成的“超级生物体”1。人的肠道中栖息着大约1014个,1000多种微生物,是人和动物体最庞大而复杂的生物群落,其主要分为与宿主共生的生理性细菌(类杆菌、双歧杆菌属、拟杆菌等),与宿主共栖的条件性致病菌(肠肝菌、肠球菌等)以及大多数为过路菌的病原菌(变形杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等),主要分布在结肠部位,正常情况下肠道菌群保持着共生和拮抗关系,从消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、药物代谢和毒性等诸多方面影响人和动物的健康状况2-5。
   对于肠道微生态的研究,传统的方法是通过微生物的选择性培养,或者是通过直接形态学观察来获得部分信息,再进行鉴定和分类。传统培养方法的局限性在于培养过程费时费力,易受操作方法的影响,敏感度低,大多数微生物很难或不能用现有的技术分离培养;培养技术只能定性检测可培养的细菌,不能鉴定未知的细菌,不能正确的反映肠道微生物群体的数量和多样性,使人类不能全面了解肠道微生物之间和与宿主的相互关系,阻碍了人类对肠道微生物的认识。近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,分子生物学技术在微生态学中的应用也日益广泛,其特点是能够快速获得微生物种群定性、定量数据,这使得微生态学现有的研究范围得以进一步扩展。以16S rRNA基因为基础的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术能够快速准确地鉴定在自然环境或人工环境中的微生物种群,并进行复杂微生物群结构演替规律研究,以及生物种群的动态分析6。特别是近几年来国内外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16S rRNA进行研究,已经得到了广泛的16S rRNA序列数据库,为我们进行该比较微生态的研究提供了基础。
   目前用于肠道微生态研究的实验动物主要是用大/小鼠来建立的,其优点是个体小、易于操作、繁殖速度快、价格便宜等等,但是啮齿类动物在解剖、生理和代谢等方面与人之间存在较大的差异,在肠道微生态研究上并不能很好的作为模型动物,而就生理学、解剖学和营养代谢等方面小型猪与人更为相似,并且人的一些疾病如肝硬化,糖尿病、高血压和一些营养代谢症等在其身上也有发生,目前以小型猪作为实验材料的文章也越来越多。本研究利用PCR-DGGE技术对常用实验动物:FVB/n小鼠、BALB/c小鼠、SD(Sprague-Dawley)大鼠、Wister大鼠、巴马香猪、贵州小型猪与人的肠道总菌群、乳杆菌属菌群、拟杆菌属菌群进行了肠道菌群的多样性、丰富度和均匀度以及UPGMA相似性聚类分析。
   研究目的和意义:
   通过比较微生态的方法,间接和直接阐明几种常用实验小鼠、大鼠、小型猪与人的肠道主要菌群在多样性的差异,正确反映它们作为常用模型动物与人之间肠道菌群的差异和相似性,初步分析上述几种常用医学实验动物肠道菌群的特点和差异,期望为肠道微生态研究提供基础性资料,以及在选择肠道微生态研究用模型动物时提供参考依据。
   研究方法:
   1.收集健康成年小鼠(FVB/n和BALB/c)、大鼠(SD和Wister)、小型猪(巴马香猪和贵州小型猪)和人的粪便样品,提取总菌DNA;
   2.分别用V3(总菌)引物,lac(乳杆菌属)、bfr(拟杆菌属)二种特异性引物引物扩增提取到的肠道菌群总DNA、乳杆菌属菌群DNA和拟杆菌属菌群DNA;
   3.分组进行变性梯度凝胶电泳(DGGE);
   4.对每张电泳胶上的条带,利用spss13.0分析软件进行数据分析。
   研究结果:
   利用PCR-DEEG方法,对两个品系小鼠,两种大鼠,两种小型猪,以及小鼠、大鼠、小型猪与人之间肠道总菌群、乳杆菌属和拟杆菌属的多样性、丰富度和均匀度分析,结果显示各种属内没有显著性差异,在种属间存在显著性差异,从肠道菌群同源性分析,小鼠、大鼠、小型猪的肠道总菌群、乳杆菌属菌群与人的比较,小型猪肠道菌群与人的最为接近,拟杆菌属比较实验动物之间比较接近。
[硕士论文] 李婧潇
动物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院(中国医学科学院) 2011(学位年度)
摘要:树鼩作为新兴的医学实验动物之一,因其在进化地位上与灵长类动物较为接近,体型小,繁殖快,易驯养和饲育,以及存在诸多自发性疾病等特性,可作为某些人类重大疾病研究的动物模型,在医学生物学上已呈现出广泛的应用前景。目前,树鼩已被应用于病毒、神经、免疫、肿瘤和神经性疾病的研究,但表现出对其应用研究多于基础研究的状态,遗传背景研究就更为少见,不利于实现树鼩实验动物标准化。微卫星是近十几年来发展起来的一种新的分子标记,它是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次重复的简单序列。由于微卫星遗传标记具有数量大、分布广且均匀、多态信息含量高、检测快速以及适合自动化分析等优点,已被广泛用于动植物基因图谱的构建、标记辅助选择、亲缘关系鉴定、遗传多样性评估及系统进化树的构建等。然而,当前树鼩的微卫星分子标记还很少,因此,筛选出可以应用的微卫星位点是一项非常基础和重要的工作。本研究通过构建树鼩小片段插入文库,利用地高辛标记(AC)15序列作为探针,筛选树鼩微卫星位点,丰富了中缅树鼩的特异性遗传标记,为进一步筛选大量的树鼩微卫星遗传标记奠定了基础,也为开展树鼩繁育工作与实现实验动物标准化提供一定的理论基础和遗传检测方法。
   提取树鼩总DNA,限制性内切酶Sau3AⅠ酶切,回收300~1000 bp之间的片段,连接质粒,转化入Top10感受态细胞中,蓝白斑筛选后培养扩增,建立中缅树鼩基因小片段插入文库。利用5’端地高辛标记的(AC)15探针进行菌落原位杂交,从约1500个菌落中选出36个阳性克隆。对这些克隆进行测序,发现其中15个含有重复序列,其中1个为重复克隆,1个因两端序列太短而不能设计引物。用Primer3软件设计13对引物。对树鼩种群进行PCR验证引物有效性,13对引物均有条带。退火温度分布在44℃到52℃之间。阳性克隆率为2.4%,微卫星克隆率为1%。本研究所使用的地高辛标记探针筛选树鼩微卫星分子标记所得的微卫星克隆率,可达到传统放射性同位素标记探针同等的效果,并可避免放射性危害。树鼩微卫星分子标记的筛选将为下一步进行基因组结构的分析、树鼩遗传连锁图谱的构建、分子进化和标记辅助选择等提供大量的微卫星标记。
   为了进一步研究中缅树鼩微卫星位点多态性特征,结合微卫星DNA标记具有高度的多态性、共显性遗传、易于PCR稳定扩增等特点,用新筛选的13个微卫星座位对32只中缅树鼩进行PCR扩增及12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星DNA的扩增产物,并计算其等位基因数、等位基因频率、多态性信息含量(PIC)、基因杂合度等指标。13个微卫星基因座共检测到77个等位基因,平均等位基因数为5.9231。TBC13座位的杂期望合度值(He)最高,为0.8646,最低为TBC11的0.5060,平均期望杂合度为0.7894。各微卫星座位的多态信息含量值(PIC)在0.3740~0.8324之间,平均值为0.7396,表明该树鼩种群具有较高的遗传多样性。结果表明,筛选的13个微卫星基因座具有较丰富的遗传多态性,可用于中缅树鼩的遗传多样性分析。
   研究表明,该树鼩种群具有较丰富的遗传多态性;本研究建立树鼩小片段插入基因组文库,筛选出13个微卫星位点,并对这些位点进行了特征分析和多态性评估。多态性较高的树鼩种群有利于动物的繁殖育种,但要广泛应用于生物医学研究中还需要进一步推进实验动物标准化进程,以保证实验结果的一致性和可靠性。
[博士论文] 徐龙进
兽医学 南京农业大学 2011(学位年度)
摘要:从山东省的实际情况出发,通过对山东省疾病预防控制中心屏障环境实验动物设施的检测、标准操作规程(SOP)的制定与实施、设施的动态运行管理和高压灭菌设备消毒效果的鉴定等方面的研究,探讨了符合国家标准的屏障环境实验动物设施运行管理机制。形成了较为规范的屏障环境实验动物设施的管理制度和标准操作规程(SOP)。
   为了检验标准操作规程的实施效果并进一步改进,山东省实验动物管理委员会委托山东省实验动物检验检测中心对山东省疾病预防控制中心屏障环境设施进行了跟踪监测。通过“屏障环境实验动物设施动态检测实验”、“屏障环境实验动物设施高压灭菌效果检测实验”、“普通环境、屏障环境实验动物设施静态与动态空气落下菌数对比检测实验”、“济南市部分屏障实验动物设施环境参数监测实验”对标准操作规程(SOP)的应用进行了评估。
   1、屏障环境实验动物设施动态检测实验
   依据国标GB14925-2001每季度进行一次环境设施动态检测,共4次。结果显示:屏障设施静态运行时达到国家标准;动态运行时,检测结果经对比,虽然各项检测指标相对于静态检测结果均有不同程度的升高,(温度3.45℃、相对湿度17.15%、气流速度0.02m/s、噪声1.28 db、氨浓度10.25 mg/m2、落下菌数0.86个/皿)但除了尘埃粒子数超标外,其它指标均符合静态运行时的国家标准[39]。
   2、屏障环境实验动物设施高压灭菌效果检测实验
   按照相关设备的标准操作规程(SOP)操作,对饲料、垫料、饮水和工作服等采用高压灭菌方式,对笼具采用高压灭菌和消毒液渡槽浸泡消毒。目的是在屏障环境实验动物设施运行过程中检验SOP的规范性和可操作性,并寻找一种合理的微生物控制措施,既达到国家实验动物与环境设施的质量控制标准,又减少设施运行成本以及劳动强度。实验结果:实验动物饮用水121℃高压灭菌30min后在洁净物间存放4d,细菌总数为0个/皿。
   饲料132℃灭菌7min后在屏障环境洁净室内存5d内能保证饲料无细菌。
   真空132℃条件下灭菌7min后放置7d,垫料仍然无菌生长,达到灭菌效果。
   132℃条件下对工作服灭菌5min后在屏障环境洁净储藏室内存放7d也无细菌生长。
   饲养盒经过高压灭菌或在常用的几种消毒液中浸泡消毒,效果都比较好,可达到无菌效果,且消毒液的使用周期能够维持7d。
   3、普通环境、屏障环境实验动物设施静态与动态空气落下菌数对比检测实验
   为了检验并改进人员、动物、物品进出屏障环境设施的标准操作规程(SOP),每半年(持续三年)对普通环境设施和屏障环境设施分别在静态和动态下检测一次落下菌数。结果显示,普通环境中静态好于动态(静态2.57±0.95;动态18.47±5.43);在用垫料饲养和相近的饲养密度情况下,高效过滤器堵塞,屏障环境远不如普通环境(静态0;动态∞)。屏障更换高效过滤器后,才凸显出其优势;在只考虑落下菌的情况下,干养远好于垫料饲养。屏障环境中静态好于动态;屏障环境在静态下能维持一个很好的状态;屏障环境自净能力随着高效过滤器的堵塞而减弱,更换高效过滤器后,自净能力恢复;IVC能显著降低屏障环境内落下菌,极大地改善饲养人员的工作条件]。
   特别值得注意的是,更衣室位于屏障与外界之间,要严把入口。风淋室在第3、4次检测时有落下菌,我们积极排查原因,通晓风淋工作原理后,彻底科学保洁。内走廊在第3、4、5次检测中有落下菌,发现各室通往内走廊的门、门锁有的有松动,关不严,影响了气密性。清洁准备室在第5次检测中发现了落下菌,多方排查后发现双扉高压锅与屏障墙体间有一道细小的裂缝。缓冲间是连接屏障与外界的通道,在第3、4、5次检测中有落下菌,自查后发现门下封条、门锁影响气密性,高效气幕可能失效,更换了高效过滤器后,第6次检测结果为0cfu/皿。
   4、标准操作规程的应用和评估
   2007年山东省实验动物检验检测中心在山东大学医学院安评中心,山东中医药大学实验动物中心,山东省疾病预防控制中心进行了为期一年的“屏障环境实验动物设施管理的标准操作规程(SOP)”试点运行,进行了“济南市部分屏障实验动物设施环境参数监测实验”。检测项目主要包括屏障环境设施内的温度、相对湿度、气流速度(换气次数)、压力梯度、噪声和氨浓度并做了相关的数据对比,并结合以上实验的数据全面考虑,验证了标准操作规范的实施和运行效果,也发现了操作规范需要改进和完善之处,研究取得了预期效果。
[硕士论文] 罗小红
人文地理学 西南大学 2011(学位年度)
摘要:野生动物园的建立与发展是人类社会文明进步、人民生活水平提高与经济发展到一定阶段的产物。动物园最初起源于公元前2300年前的中国与埃及,当时的动物仅限于国王、皇帝和王公贵族们收藏。随着人类文明的进步,动物收藏开始变得广泛和普遍,动物园的发展也经历了笼养时代、哈根贝克理念式动物园、沉浸式景观类动物园、野生动物园四个阶段,而“动物保护中心”则是动物园努力和发展的方向。野生动物园作为新型的动物园,开创了“人在笼(车)中,动物在笼(车)外”的全新动物园游览模式,深受旅游者的喜爱。
   目前为止,我国各地区修建了30多家大型的野生动物园。研究者们对野生动物园的经济管理模式、建设、选址和搬迁、可持续发展等进行了广泛而深入的研究。这些研究多以定性的描述为主,缺乏定量的分析,而且缺乏对野生动物园时空分布的研究。对我国野生动物园的时空分布进行研究,可为野生动物园今后的建设、选址等问题提供重要的参考。
   论文采用图表法、年际变化指数、最邻近指数、地理集中指数、基尼系数、地理联系率等模型,依托数据库的查询、网络资料的收集整理、GIS软件制图,对我国野生动物园的时间和空间分布状况,以及野生动物园的分布与我国4A级风景区、区域经济发展水平、客源地市场条件等因素的相关度进行了分析。研究表明:
   (1)在时间分布方面,自1993年我国首家野生动物园开业以来,已有19年历史。根据这19年的变化情况,可以将我国野生动物园的发展划分为3个阶段:1993~1996年的探索起步期,1997~2004年的高速发展期,2005~2011年的平稳发展期。同时,我国1993~2011年间开业的野生动物园的年际集中指数y=0.039,年际差异性较小,开园时间较为分散。
   (2)在空间分布方面,我国各个野生动物园的最邻近点指数R≈1,表明我国野生动物园的空间分布类型属于随机型;野生动物园在各省级行政区间分布的地理集中指数G=22,表明其空间分布较为分散;在八大区域间分布的基尼系数(Gini)为0.973,表明其分布较为集中;我国野生动物园在八大区域间的空间密度差异较大,其中北部沿海地区、东部沿海地区、南部沿海地区和长江中游地区密度较高。
   (3)在与我国4A级风景区、区域经济发展水平、客源地市场等因素的相关性方面,我国野生动物园在八大经济区的分布与客源市场具有较高的重合性,与区域城镇人口数量的相关率V为87.83,50万以上人口的大中型城市数量与野生动物园的相关率V为86.86,符合野生动物园以市场为导向的规律;野生动物园的区域分布与4A级景区的分布也有一定的耦合性,4A级景区较多的区域,野生动物园的数量也较多。此外,野生动物园所在区域的经济发展水平、政府的政策扶持也对野生动物园的分布起到一定的引导作用。
[硕士论文] 周冬梅
临床兽医学 南京农业大学 2010(学位年度)
摘要:在生命科学研究蓬勃发展的今天,实验动物在科学研究中的作用日益突出。小鼠是应用最为广泛的实验动物之一,C57BL/6J品系小鼠作为一种近交小鼠,因其遗传背景稳定,成为生殖生物学、肿瘤学、生理学、免疫学和遗传学研究中常用的品系,大多数转基因小鼠均以C57BL/6J小鼠为遗传背景制作出来。如何对这些基因工程小鼠进行科学保种,建立一套有效的小鼠种质资源保存方案显得尤为重要。目前,利用体外受精技术结合胚胎冷冻保存对小鼠进行资源保存已经得到长足的发展,而卵母细胞体外成熟属于体外胚胎生产的基础环节,卵巢异体原位移植也是保存雌性小鼠生殖功能并获得自然妊娠子代的有效手段,两者都是小鼠资源保种工作中必不可缺的基础环节;在研究不孕症治疗模型方面也有着广阔的应用前景。因此,研究小鼠卵母细胞体外成熟及卵巢移植具有重要的实际意义。本实验以C57BL/6J小鼠为研究对象,旨在通过对该品系小鼠卵母细胞体外成熟体系的研究提高体外成熟卵子受精后的卵裂率及胚胎的继续发育能力,通过卵巢异体原位移植得到自然妊娠,产生供体卵巢后代,为小鼠种质资源保存奠定基础,为相关的实验研究提供参考。
   1.小鼠卵母细胞体外成熟研究
   本试验以C57BL/6J小鼠为研究对象,研究小鼠卵母细胞体外成熟与体外受精的多种影响因素,包括PMSG处理、小鼠周龄、培养液、卵巢组织液(mOTF)添加、培养时间、卵丘细胞、激光破膜和精子获能时间等,旨在建立适当方法以获得试管小鼠。以小鼠卵母细胞体外培养成熟、体外受精后的卵裂率来评价成熟效果。结果表明:(1)PMSG处理对小鼠卵母细胞体外成熟具有促进作用,处理组的卵裂率显著高于对照组(73.10%对68.73%,P<0.05);(2)4~9周龄小鼠分离到的未成熟卵母细胞不仅数量多,而且无论卵丘-卵母细胞复合体(COC)还是裸卵(DO)其卵子成熟后比其他组具有更高的卵裂率,虽然1年龄小鼠卵裂率与4~9周龄无差异,但其卵巢上分离得到的卵子数量显著少于4~9周龄(14枚/只对116枚/只);(3)3种培养液添加胎牛血清(FBS)后,M16培养液比DMEM和MEM-α更适合小鼠卵母细胞的体外成熟,3组卵裂率分别为51.56%,45.58%和38.10%;(4)在M16+FBS基础上添加小鼠卵巢组织液(mOTF)能显著提高卵子成熟效果,添加或不添加mOTF所获卵裂率分别为80.07%和51.56%,两组间差异显著(P<0.05);(5)卵母细胞体外成熟培养时间以18 h为最佳;(6)COC比起DO有更好的成熟效果和较高的卵裂率,卵裂率分别为79.82%和53.86%,两组有显著差异(P<0.05);(7)体外成熟的裸卵,在体外受精前,挑选有pbI的卵子进行激光破膜后的卵裂率都明显较不处理组为高(69.91%对58.75%;P<0.05);(8)精子获能4 h,可提高卵子体外受精卵裂率,显著高于传统上2 h获能的卵裂率(83.87%对49.51%;P<0.05).本试验结果表明,选择4周龄C57BL/6J小鼠,腹腔注射10IU/只PMSG处理48 h后,分离卵母细胞以M16+10%FBS+10%mOTF培养18 h,并以获能4 h的精子进行体外受精,为小鼠卵母细胞最佳体外成熟方案,所获卵裂率与体内成熟卵母细胞对照组卵裂率无显著差异(85.14%对90.19%;P>0.05)。将获得的2-细胞进行胚胎体外培养获得囊胚发育,进行胚胎移植后成功获得2只试管小鼠。
   2.卵巢异体原位移植研究本研究以3个转基因品系小鼠及其背景
   鼠作为研究对象,转基因小鼠Ptet-mPTA1与LAP/rtTA的背景鼠为近交系小鼠C57BL/6J,HBV-x小鼠的背景鼠为封闭群小鼠ICR/JCL。试验以此3个品系的转基因小鼠作为卵巢供体,异体原位移植到其背景鼠的卵巢包膜内,移植前切除1/2~2/3受体卵巢,饲养2个月后与背景鼠的雄鼠合笼,自然怀孕生产出子代,采集子代中尾尖提取基因组,结合PCR、电泳检测目的基因。出现阳性条带者判定为来源于供体卵巢,阴性判定为来源于受体卵巢。结果表明:(1)4只10日龄Ptet-mPTA1小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔;基因检测表明,有阳性子代出现;4只10日龄LAP/rtTA小鼠作为供体,卵巢移植给4只背景鼠,4只均成活、怀孕并产仔,经基因检测证明有阳性子代出现;10日龄和4周龄HBV-x品系小鼠分别移植4只和17只,均成活,其中19只怀孕并产仔,经基因检定,无阳性结果出现;(2)对无阳性后代出现的受体解剖发现,卵巢移植体未得到生长,有的甚至坏死,有的与周围组织粘连、无血供或移植体丢失;(3)对有阳性结果出现的受体小鼠,进行解剖发现,移植体在卵巢包膜内有生长、有血供,显微镜下分离移植体,能观察到有卵泡生长,能够分离到未成熟的卵母细胞,包括COC和DO,按卵母细胞体外成熟的方法对分离到的卵母细胞进行体外成熟培养并作体外受精,能够得到形态正常的2-细胞胚胎,两组卵裂率分别为59.57%和52.08%。
[硕士论文] 姚一琳
基础兽医学 南京农业大学 2010(学位年度)
摘要:斑马鱼(Brachydanio rerio)具有个体小、易养殖、繁殖能力强、生殖周期短、遗传背景清晰、体外受精且胚胎发育透明等特点。广泛应用于遗传发育、药物筛选、毒性试验以及分子生物学等领域的研究。斑马鱼已经成为继小鼠、果蝇和线虫之后的又一模式动物。肠道是斑马鱼消化吸收营养物质并且抵御外来有害物质入侵鱼体内的主要场所。迄今为止,一些学者主要从基因水平探究斑马鱼肠道的发育、内分泌情况以及疾病建模。本研究则从形态学角度来阐述和解读斑马鱼肠道的组织构造及其肠粘膜屏障的结构基础,为进一步研究斑马鱼肠道的物质吸收与免疫奠定基础。
   试验Ⅰ斑马鱼肠道的显微与超微结构应用光镜和透射电镜技术对斑马鱼肠道的组织形态和超微结构进行了观察。发现斑马鱼肠道可分为前、中、后三段,肠壁由内向外分为粘膜层、肌层和浆膜层三层。粘膜层分为粘膜上皮和固有层,上皮下可见清晰的基底膜,无粘膜肌层,无肠腺。柱状上皮细胞胞体为高柱状,连接复合体发达。上皮细胞之间分布有数量众多的杯状细胞,而淋巴细胞主要出现在上皮下基底膜附近,游离端偶然可见,为上皮内淋巴细胞(IELs)。基底膜附近还观察到肥大细胞。固有层由结缔组织组成,较薄。肠道的粘膜层向肠腔内折叠形成肠绒毛,多呈分枝状、指状。肌层分为内环外纵两层平滑肌,浆膜层很薄。对前肠、中肠和后肠在肠绒毛纵截面积、肠绒毛高度、柱状上皮高度和肌层厚度四个指标进行测量,其结果为:前肠绒毛纵截面积平均为12384.00±1923.95μm2,肠绒毛高度平均为157.72±12.62μm,柱状上皮的高度平均为38.39±3.53μm,肌层厚度平均为11.29±1.31μm;中肠绒毛纵截面积平均为6839.59±853.02μm2,肠绒毛高度平均为79.2±12.49μm,柱状上皮的高度平均为33.71±1.95μm,肌层厚度平均厚度为8.67±0.84μm;后肠绒毛纵截面积平均为7018.86±1148.40μm2,肠绒毛高度平均为82.69±16.25μm,柱状上皮的高度平均为33.62±3.99μm,肌层平均厚度为9.50±1.69μm。从结果可看出前肠与中肠、后肠差异极显著,而中肠与后肠之间差异不显著。各指标从前肠到中肠和后肠呈逐渐降低趋势。说明前肠是斑马鱼消化道执行消化吸收的主要场所。上皮内淋巴细胞(IELs)广泛分布于前、中、后所有的肠道中,而肥大细胞在后肠上皮的基底膜附近发现提示斑马鱼粘膜免疫组织结构较为简单,需要免疫细胞在分布位置上的改进来提高鱼体免疫机能。
   试验Ⅱ斑马鱼肠道粘膜屏障应用透射电镜技术、免疫组化以及组织化学方法,系统观察斑马鱼肠粘膜屏障的组织结构和超微结构。发现斑马鱼肠道具有完整的机械屏障、化学屏障和免疫屏障结构。吸收细胞之间有发达的连接复合体,机械屏障十分完整;肠腔表面的粘液层里既含有杯状细胞分泌的中性粘多糖,又存在胃肠激素、细胞因子和免疫球蛋白等物质,为粘膜提供润滑和保护的作用;肠道上皮组织内的IEL和肥大细胞为斑马鱼粘膜主要免疫细胞,通过细胞免疫和体液免疫的方式实现免疫屏障的功能。
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