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[硕士论文] 马天宇
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:分娩启动是一个复杂的生理过程,影响因素有很多,包括机体内部环境和外界环境两方面。外界因素包括摄入食物、不当的机械运动等;内在调节主要包括激素、免疫炎症以及细胞凋亡等。目前关于分娩启动过程具体分子机制的研究鲜有报道。在本实验室大白猪分娩前后胎盘组织转录本测序中筛选出GPX1差异表达基因,有研究表明GPX1可以缓解氧化应激反应,GPX1缺乏会导致非正常分娩。本试验旨在探究谷胱甘肽过氧化物酶GPX1在分娩启动的进程中的作用。
  为了探究GPX1是否在分娩启动中发挥作用,我们在怀孕15.5天孕鼠腹腔注射LPS构建小鼠早产模型,检测胎膜中ROS水平、氧化标志基因HSP90、炎症因子TNFα、IL1β以及分娩相关基因COX2的表达变化。在WISH细胞中分别转染干涉片段si-GPX1和超表达质粒,检测分娩相关基因HSP90、COX2、Caspase3、IL1β以及NFκB。为了判断GPX1发挥作用的通路,采用NFκB通路抑制剂CAPE处理WISH细胞,通过细胞免疫荧光检测NFκB以及COX2的表达变化。通过ELISA检测清平猪有无分娩征兆的羊水中PGE2的浓度。在WISH细胞中转染重组质粒pCMV-GPX124小时和48小时后,分别检测细胞上清液中的PGE2浓度。最后,通过PGE2处理WISH细胞,检测对GPX1、NFκB和COX2的影响。试验主要研究结果如下:
  1)小鼠早产模型中实验组小鼠胎膜ROS水平显著增强,氧化应激标志基因HSP90表达水平显著高于对照组,同时炎症因子TNFα、IL1β和COX2呈现高表达,蛋白结果表现一致。表明分娩启动时,氧化应激水平加剧,并出现炎症反应。在三类抗氧化标志基因GPX1、Catalase和SOD2中,实验组与对照组相比,表达水平分别是1.80、1.27和1.18倍。其中GPX1相对变化最剧烈,推断GPX1作为主要抗氧化基因。
  2)在长妊娠期及短妊娠期清平猪种中,有分娩征兆组羊水中PGE2浓度均显著高于无分娩征兆组,结果表明PGE2对分娩启动发挥重要作用。高水平GPX1可以降低HSP90的水平,表明GPX1可以降低氧化应激反应,同时激活NFκB通路上调COX2的表达,在24以及48小时后,PGE2水平均显著上升。低水平GPX1使HSP90水平升高,氧化应激水平加剧,上调炎症因子IL1β水平。GPX1从激素水平以及免疫炎症两方面参与妊娠以及分娩启动的调节。
  3)PGE2处理WISH细胞后,对GPX1产生促进作用,对NFκB以及COX2有负反馈抑制作用。这种机制可以防止PGE2水平通过NFκB通路进一步升高,避免PGE2高峰提前引发早产。GPX1的稳定表达是正常妊娠分娩的必要条件。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 尹晓燕
化工过程机械 山东大学 2017(学位年度)
摘要:马蹄蝙蝠有一个积极的超声波声纳系统,允许动物在结构丰富的自然环境中导航和捕捉猎物。这种生物声纳系统的组件包含一个不寻常的动态系统,在实现动物的优良的感官性能中起着关键性作用。马蹄蝙蝠生物声纳采用精心设计的挡板形状来对传出和传入的超声波进行衍射,超声从被鼻叶包围的鼻孔发出然后被大外耳接收。当超声衍射发生时,鼻叶和耳朵就被驱动。在发射端,两鼻叶即前叶和鞍,已被证明是与超声发射同步运动。在接收侧,外耳已显示在约100毫秒内发生高达20%的相对于耳朵总长度的形变。由于这些形变的产生,传入和传出超声的衍射变成了一个动态的过程。动态的衍射过程导致类似的动态装置特性,如果这种额外的动态维度被发现在本质上提高了感官信息的编码,那么马蹄蝙蝠生物声纳可以作为一个动态的过程应用于传感技术。本文将会介绍目前已知的关于蝙蝠生物声纳的动态效果,同时将会对生物声纳和类似工程的感官系统如声纳和雷达进行对比。
  蝙蝠种群中的马蹄蝠(Rhinolophidae)和相关的旧大陆鼻叶蝠(Hipposideridae)都显示出将明显的耳朵动作作为其生物体行为的一部分。在当前的工作中,通过耳朵上标记点的三维重建来定量分析这些耳朵运动。在两种物种中观察到的耳朵运动都分为两类:在“刚性旋转”运动中,耳朵的几何形状保持不变,仅仅改变在空间中的旋转方向。在“柔性运动”中,耳朵的几何形状发生变化,这在标记点之间的距离变化中是明显的。线性判别分析结果表明,两种类型的运动可以在分析的数据集中没有任何重叠的情况下分离。因此,来自两个物种的蝙蝠有两种独立类型的耳朵运动,它们之间显然没有过渡。两种不同运动在动物生物体行为中的作用仍有待确定。
  已知蝙蝠通过多普勒频移补偿机制来进行捕猎和追踪,本文将通过实验的方法来探究快速耳朵运动能否对回声产生较大的多普勒频移值,从而激发蝙蝠启动其多普勒频移补偿机制。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 许铁龙
动物学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:本研究至2016年12月止共对贵州省包括毕节市、大方县、盘州市、威宁彝族回族苗族自治县、纳雍县、水城县、兴义市、道真仡佬族苗族自治县、务川仡佬族苗族自治县、绥阳县、赤水市、习水县、金沙县、遵义县、凤冈县、兴仁县、惠水县、关岭布依族苗族自治县、开阳县、修文县、安顺市、长顺县、清镇市、贵阳市花溪区、贵阳市乌当区、贵定县、织金县、息烽县、龙里县、平坝县、黔西县、余庆县、荔波县、榕江县、从江县、三都水族自治县、独山县、丹寨县、江口县、印江土家族苗族自治县、松桃苗族自治县、施秉县、黎平县、雷山县、凯里市、沿河土家族自治县、思南县、安龙县、贞丰县、望谟县、罗甸县在内的共计51个县、市、区进行了野外翼手目动物标本采集,采集翼手目动物标本共计2036号,结合文献记录,现贵州省共有翼手目动物7科18属59种。与《贵州兽类志》相比增加19种。其中,中国特有种8种。经过实地调查,贵州省分布最为广泛的大蹄蝠Hipposiderideros armiger,其在贵州省的分布地共计47个县市。在贵州高原山区省的5个动物地理亚省中均有分布的翼手目物种分别为:托氏菊头蝠Rhinolophusthomasi、菲菊头蝠Rhinolophus pusillus、皮氏菊头蝠Rhinolophuspearsonii、贵州菊头蝠Rhinolophusrex、云南菊头蝠Rhinolophusyunanensis、大蹄蝠Hipposiderosarmiger、黄大蹄蝠Hipposiderospratti、三叶蹄蝠Aselliscusstoliczkanus、西南鼠耳蝠Myotisaltarium、中华鼠耳蝠Myotischinensis、中华山蝠Nyctalusplancyi、南蝠Iaio、印度伏翼Pipistrelluscoromandra、东亚伏翼Pipistrellus abramus,共计14种。五个动物地理亚省之中,翼手目种类最多的是黔东南低山丘陵盆地亚省,共计48种,占贵州省总数59种的81.4%;另黔西高原中山亚省共有翼手目动物31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔北中山峡谷亚省的翼手目种类为31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔中山原丘陵亚省的翼手目共计38种,占贵州省总数59种的64.41%;黔南低山河谷亚省的翼手目种类共计33种,占贵州省总数59种的55.93%。贵州省翼手目分布型以东洋型为主要类型,为27种,南中国型13种排列第二,云贵高原及附近山地型6种,东亚季风区型4种,旧大陆热带-亚热带型3种,古北型2种,东北型、岛屿型、喜马拉雅-横断山区分布型各1种,不易归类的分布型1种(由于其分布比较广泛,不能视为某一类),即大耳黄蝠Nycticeiusemarginatus。
[硕士论文] 赵焕乐
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:机场及其周边鸟类种类调查及其多样性研究对于新建机场开展鸟击防范工作具有重要意义。2015年1-12月,采用样线法和固定半径样点法对内蒙古扎兰屯成吉思汗机场及其周边8km范围内的区域进行鸟类多样性调查。调查结果如下:
  (1)调查期间共记录到鸟类有15目31科82种。
  (2)扎兰屯成吉思汗机场围界内麻雀、喜鹊、家燕、白鹊钨为主要鸟类。鸟类四季活动的共同高峰期为早晨6点到8点,其中春季4点到6点的鸟类种类最高,为6种,夏季的6点到8点鸟类数量最多,为363只。
  (3)根据对鸟类的群落结构分析:机场围界内春季的鸟类多样性指数(0.740)和均匀度指数(0.819)最高;冬季的优势度(0.683)最高;夏季的平均密度(2.826ind· hm-2)最高。机场围界外:夏季湿地的多样性指数最高,为1.576;冬季的草地均匀度指数最高,为0.902;冬季的居民区优势度最高,为2.113;春季的湿地平均密度最高,为28.600 ind·hm-2。
  (4)本文在前人研究的基础上综合鸟类的体积、数量、出现次数、飞行高度、与机场的距离、出现的样带数以及是否集群7个因子对鸟类的危险值重新赋值并计算得出危险值。严重危险鸟类有普通鸬鹚Phalacrocorax carbo、麻雀、赤麻鸭Tadorna ferruginea等14种。
  根据调查结果提出不同季节,不同区域以及不同鸟种的针对性防范措施以及机场管理对策,为今后的扎兰屯机场鸟击防范工作提供重要的科学依据。
[硕士论文] 杨峰
水产学、水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:在目前集约化水产养殖模式下,草鱼(Ctenopharyngodon idella)作为我国产量最大的经济鱼类,在实际养殖过程中,特别容易出现肝脏脂肪过度蓄积进而导致脂质代谢紊乱等症状,免疫力也下降,严重者则表现为脂肪肝。因此,如何提高鱼类肝脏对脂肪利用能力及肝脂质蓄积调控的研究已显得非常迫切和必要。近年来,关于microRNA(miRNA)的研究越来越深入。研究显示miRNA参与陆上动物的胆固醇、甘油三酯和脂肪酸代谢等,因而在脂质代谢调控中发挥重要作用。目前,有关miRNA调控鱼类脂质代谢的研究还不深入,相关机理还不明晰。本研究主要以草鱼和草鱼肝细胞系(L8824)为实验材料,采用基因克隆、基因过表达及干扰、qRT-PCR、酶活性测定及腹腔注射等营养学、生物化学、分子生物学和细胞生物学相关技术与方法,在活体与细胞水平上较系统地研究了miR-33/122调控草鱼肝脏脂质代谢的作用及初步机理。研究结果为丰富鱼类脂质代谢调控机理提供了基础资料,为防治鱼类营养性脂肪肝等代谢性疾病及提高机体免疫力提供了思路及理论基础,进而为促进鱼类健康生长提供了科学依据。
  本研究主要内容包括:⑴采用RT-PCR技术,克隆了miR-33的前体序列,并进行了同源性比对和组织分布规律分析。结果显示,miR-33的前体长度为65bp,和其它物种的同源性较高;构建系统进化发育树也显示草鱼miR-33和鱼类miR-33的进化关系最近;组织分布规律显示在脑、眼睛、肝脏、肌肉和肠道中表达量较高,而在肾脏、脾脏、心脏和脂肪中的表达量较低。⑵采用miR-33 mimic(miR-33模拟物)转染草鱼肝细胞L8824的方法,开展了miR-33的功能研究。实验设置三个组,空白对照组、阴性对照组和miR-33 mimic转染组,处理24h后收集细胞。采用油红O染色提取法检测了L8824细胞中甘油三酯(TG)含量,qRT-PCR技术检测了与脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。结果显示,相对于空白对照组和阴性对照组,miR-33 mimic转染细胞24h使miR-33超表达后,显著增加了细胞中TG含量(P<0.05),且和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著增加(P<0.05)。为进一步验证miR-33在肝脂质代谢中的功能,本研究亦在活体水平上进行了腹腔注射miR-33 antagomir(miR-33拮抗剂)实验。实验共设置三个组,空白对照组,注射0.65%生理盐水组和注射miR-33 antagomir组(12.5 nmol/尾.次)。实验采用连续注射的方法,即在每天上午9:00注射1次,连续注射3天。在实验进行的第4天上午9:00进行取样。实验采用全自动生化分析仪对草鱼血清相关生化指标进行了分析,qRT-PCR技术对脂质代谢和免疫相关基因转录水平进行了检测。结果显示,注射miR-33 antagomir组比空白对照组和生理盐水组血液中的总胆固醇和甘油三酯含量显著减少(P<0.05);进一步在基因转录水平的研究发现,和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著降低(P<0.05);和免疫有关的促炎因子(TNFα,IL-1β,IL-6和NF-κB)水平降低(P<0.05),而抗炎因子(TGF-β1和IL-10)的表达量升高(P<0.05)。以上结果表明miR-33通过调节脂代谢相关基因和免疫相关因子等的表达在草鱼肝脏脂肪代谢紊乱引起的脂肪肝(炎)过程中发挥重要作用。这一工作也是国际上对鱼类miR-33调节脂质代谢机制的首次阐述。⑶采用和miR-33实验相同的方法,本节实验首先获得了miR-122前体基因序列。结果显示,miR-122前体序列长度为99bp。和其它物种的同源性较高,说明miR-122具有很高的保守性;系统进化关系分析也显示草鱼miR-122和斑马鱼miR-122的进化关系最近;而组织分布规律则说明miR-122仅在草鱼肝脏中特异性高表达,而在其它组织中尚未检测到其表达。采用在肝细胞L8824中转染miR-122agomir(miR-122激动剂)方法来研究miR-122的功能。实验分组、实验时间及实验方法等都和miR-33的实验相同。结果显示,和空白对照组及阴性对照组相比,转染miR-122激动剂后,miR-122在L8824细胞中的相对含量明显增加(P<0.05),TG含量显著升高(P<0.05),表明超表达miR-122后促进了脂肪的合成。进一步检测发现,与脂质合成有关mRNA的表达水平也显著增加(FAS,ACC,PPARγ);为进一步研究miR-122的功能,本节研究在活体水平也开展了腹腔注射实验。分组及注射时间和miR-33的实验相同,只是注射剂量变为了5 nmol。结果显示,注射miR-122激动剂后,草鱼肝脏中miR-122的含量明显增加(P<0.05);进一步在基因表达水平的研究显示,注射miR-122 agomirs后,PPARγ,SREBP-1c,ACC,FAS和H-FABP等和脂质合成有关mRNA的表达量显著升高(P<0.05),说明miR-122促进脂肪合成的作用是通过调节脂肪合成基因进行的;检测免疫有关基因的转录水平发现,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的相对表达量出现显著地升高(P<0.05),而抗炎因子IL-10和TGF-β1的相对丰度则明显降低(P<0.05),表明miR-122在促进肝脏脂肪过量增加的基础上可能进一步降低了其免疫力。⑷开展了GSPE对肝脏脂质代谢及miR-33/122影响的实验。在细胞水平研究GSPE对肝脏脂质代谢调控的作用及对相关基因和miR-33/122表达的影响;在活体水平上进一步验证GSPE的上述作用。在细胞水平上,首先利用不同浓度的油酸构建草鱼脂肪肝细胞模型。然后设置两个实验组,即添加GSPE组和未添加GSPE组。取样的时间设置为0h、1h和3h。实验结束后检测细胞中脂肪含量的变化、miR-33/122的表达水平以及脂质代谢合成相关基因的mRNA水平。在活体水平上,一共分三组,即空白对照组,灌喂生理盐水组和灌喂GSPE组(250mg/Kg),分别在0h、1h和3h取样。检测血清生理生化指标、miR-33和miR-122的表达变化、脂质代谢和免疫相关基因mRNA表达水平的变化。结果显示,添加GSPE后不论在活体还是细胞水平TG含量都显著降低(P<0.05),miR-33和miR-122的表达水平也都受到抑制(P<0.05);检测脂代谢相关基因的表达水平发现,灌喂GSPE1h时,脂肪分解相关的基因(CPT-1,ATGL及PPARα)表达量显著升高(P<0.05),而脂合成及转运相关的基因PPARγ及H-FABP表达则显著降低(P<0.05);当灌喂GSPE3h时,更多脂肪合成基因的表达受到抑制(SREBP-1c,PPARγ,ACC,FAS和H-FABP);对免疫相关基因mRNA表达的检测发现,在脂肪肝细胞中添加GSPE1h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κB的表达量都显著下降(P<0.05),而抑炎因子IL-10和TGF-β1的表达显著上升(P<0.05),表明GSPE能够通过调节脂肪肝细胞相关免疫基因的表达而提高机体免疫力的作用,且这种作用是快速和短暂的,因为在添加GSPE3h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κ3以及抑制炎症因子的表达水平都发生了反转。而在活体水平上,GSPE在灌喂1h时除显著降低促炎因子IL-1β外,对免疫相关的其他基因没有显著性影响;而在灌喂3h时,则显著降低了促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的转录水平(P<0.05),而抑制炎症的因子IL-10显著上升(P<0.05),表明GSPE在活体水平需要较长的时间才能发挥作用,也可能是因为机体内慢性代偿反应的缘故。结果表明, GSPE能改善鱼类的肝脂肪代谢紊乱症状,这可能和GSPE能抑制miR-33和miR-122的表达进而调节一系列脂代谢和免疫相关基因有关。研究结果为在生产实践中改善饲料配方进而预防脂肪肝(炎)等代谢性疾病提供了理论基础。
[硕士论文] 田士靖
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物寄生线虫作为一种重要的病原物,其分布广泛,寄主较多,给农林业生产带来巨大的危害,有报道指出全世界每年因为植物寄生线虫直接造成的损失高达上千亿美元。植物寄生线虫危害日趋严重,人们也越来越重视植物寄生线虫的防治。目前最常用的线虫防治方法为施用化学类杀虫剂,化学杀虫剂杀虫虽然简单有效,但它会污染土壤和水源,对人畜健康产生潜在威胁,不符合绿色生态环保的防治理念。因此,对环境友好的线虫生物防治手段得到了越来越多的重视及研究。其中,微生物作为重要的线虫生物防治资源,和传统的线虫防治方法相比有着很多优势,例如安全性高、效果好、持效期长、环保经济等,用于防治线虫的微生物农药也陆续投入市场。
  本实验室在大规模筛选具有杀线虫活性的细菌过程中,发现不动杆菌MB44具有较强的杀线虫能力。不动杆菌MB44是本实验室从植物冻伤组织样品中分离出来的,经鉴定为约氏不动杆菌,约氏不动杆菌通常被认为是非病原菌,几乎没有关于其引起人类感染的临床研究报道。
  为了更深一步了解和认识氏不动杆菌的特性,我们完成了MB44基因组草图,并分析了其杀线虫能力相关的基因组特征。MB44的基因组大小为3.36 Mb,包括3636个预测的蛋白编码基因和95个RNA基因。MB44基因组的G+C含量为41.37%。用MP3软件预测MB44基因组中的毒性蛋白,结果发现了108个可能的毒性蛋白。这108个预测的毒性蛋白中有一些蛋白与鲍曼不动杆菌中已知的毒性蛋白表现出较高的同源性。这些毒性蛋白包括外膜蛋白A、磷脂酶D和盘尼西林结合蛋白7/8。此外,MB44基因组中发现的一个铁载体合成基因簇和一个荚膜多糖基因簇被推测可能是对秀丽隐杆线虫很重要的毒性因子。目前的研究这为后期进一步确定MB44的杀线虫毒性因子提供了数据基础,也为MB44杀虫分子机制的研究提供了理论基础。
[硕士论文] 张汾
生态学 广西师范大学 2017(学位年度)
摘要:本文对桂林漓江流域的洞穴进行调查,以洞穴马陆作为研究对象,对其类群、数量、分布状况及与所在环境进行了初步调查分析。共调查31个洞穴,在其中的17个洞穴中采到马陆,共计129只,分属于3目5科共15个类群。其中雌性105只,雄性14只,分别占81.40%和18.60%。
  酒精保存马陆标本形状有蜷曲呈齿轮形、圆球形、蠕虫状以及扁平带状;颜色有白、浅褐、棕褐、深褐、黑红、粉红不等。洞穴马陆体长介于8.94-112.94mm之间,头宽为0.81-5.03mm,触角反转最多可达第7体节,颈板宽为0.60-6.43mm,触角长度为0.92-8.70mm,步足数量为14-114对,步足长度为0.70-8.33mm,躯干中间环节直径为0.85-7.00mm,侧突形状有鹿角状、乳突状、刺棘状、蝶翼状、鸟翅状等
  洞穴马陆所处光带的温度在15℃-26.1℃;湿度在52.7%-93.1%。水平分布方面,15只分布于有光带,占11.63%;114只分布于黑暗带,占88.37%;弱光带未记录到马陆个体。垂直分布上,1只采于洞顶,占0.78%;45只采集于洞壁,34.88%;83只采于洞底,占64.34%。马陆具体位置环节方面,7只所在位置干燥,占标5.43%;122只所在位置湿润,占94.57%;微生境有土壤、岩石、木板、蝙蝠粪便及动物尸体,70只采于岩石表面,54.26占%;42只采于土壤表面,占32.56%;剩余的采于木板、蝙蝠粪及动物尸骸,数量各为7只、7只及3只,各占5.43%、5.43%和2.33%。
  根据研究结果,在水平分布上,马陆更倾向在黑暗带活动,光照可能是造成洞穴马陆水平分布格局的主要因子;垂直分布方面,更多马陆选择在洞底活动,可能与马陆个体大小及食物丰富程度有关;洞穴马陆数量在一定程度上与其所在光带温度有关,即一定范围内温度越高,数量越多;湿润环境对马陆更具吸引力,马陆数量与湿度的Spearman相关系数为0.602,呈显著相关。在微生境选择方面,马陆在木板、蝙蝠粪便及动物尸体上的呈集群状态,但主要仍分布于岩石。土壤相关元素含量与马陆数量的相关性不显著,与Cu呈负相关。
[硕士论文] 何玉晓
生物学、动物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:臭蛙属(Odorrana)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae),是一类生活在山涧溪流中的两栖动物,全球已知58种,中国有36种,分布范围遍及中国秦岭以南、琉球群岛、印度东北部和东南亚地区,为亚洲特有。臭蛙属是蛙科动物中从真蛙类向水蛙类进化的重要过渡类群,重建其系统发育关系及起源和扩散历史一直是两栖类系统发育研究的热点,然而由于前期研究依据的物种数量有限、分子标记较少,臭蛙属在蛙科中的分类地位、属内物种组成、种组划分及系统发育关系存在广泛争议。本研究通过广泛野外考察和数据收集,获得臭蛙属86%样本,基于线粒体12S、16SrRNA基因和16个核基因及16053 bp大数据,运用贝叶斯法(BI法)、最大似然法(ML法)、松散分子钟模型、RASP软件S-DIVA和BBM模型,重建臭蛙属的系统发育关系、探讨臭蛙属地理分布格局、揭示其起源、分化、扩散机制。
  本研究主要内容包括:⑴臭蛙属为高支持率的单系群,分为8个支系(即A-H支系)。⑵荔浦臭蛙最早从臭蛙属中分化,为A支系。⑶沙巴臭蛙和越北臭蛙聚为一支,为B支系。⑷构成C支系的13个臭蛙属物种主要分布于云贵高原。龙胜臭蛙、宜章臭蛙和安龙臭蛙聚成的C1支和云南臭蛙种组构成的C2支,前者在臭蛙属中的地位不稳定,基于核基因序列C1支与广义花臭蛙种组形成姊妹群关系。⑸来自琉球群岛的石川臭蛙镶嵌在臭蛙属内,形成独立的一支D,但在臭蛙属内的位置未很好解决。⑹广泛分布于秦岭-大巴山-巫山一线和东南丘陵的广义花臭蛙种组与海南臭蛙、滇南臭蛙、封开臭蛙等构成高支持率的支系E,支系内物种间的关系尚未解决。⑺圆斑臭蛙、墨脱臭蛙镶嵌在广义大绿臭蛙复合体内,形成高支持率的F支系;大绿臭蛙复合体广布于横断山区、秦岭-大巴山、东南丘陵及中南半岛。⑻凹耳臭蛙与竹叶臭蛙种组聚为一支,构成高支持率的东南丘陵支系(G支系)。⑼除了石川臭蛙,分布于琉球群岛的臭蛙与台湾的台岛臭蛙和棕背臭蛙形成高支持率的岛屿物种支系(H支系)。⑽臭蛙属起源于约21.62 Ma B.P.(中新世早期),从19.25~8.69 Ma B.P.(中新世中期和后期)发生了快速分化,A支到H支依次形成。⑾各支系内部物种的分化事件主要发生在第四纪更新世以后(2.6 Ma),占本研究50个臭蛙物种的60%;物种分化主要发生在云贵高原(10个)、其次在东南丘陵(9个),台湾和琉球群岛的7个臭蛙中的5个物种在2.6~1.6 Ma B.P.分化。⑿臭蛙属分为8个支系。⒀臭蛙属起源于新近纪中新世早期,自中新世中期至后期8个支系依次分化,在更新世臭蛙属物种经历了一个快速成种和分化时期。⒁云贵高原是臭蛙属的起源中心,受青藏高原持续隆升的影响,向东南丘陵、台湾和琉球群岛扩散;横断山的形成,为臭蛙向北扩散至喜马拉雅南缘、秦岭-大巴山-巫山一线,向南扩散至中南半岛建立了通道。⒂青藏高原隆起、第四纪冰期与间冰期气候波动及冰期避难所的形成,导致更新世臭蛙属物种快速分化。
[硕士论文] 鲍淼
海洋生物学 汕头大学 2017(学位年度)
摘要:由于气候变化、人类活动的加剧,全球生物多样性和生态环境遭到较为严重的破坏,人们的环保意识与保护生物多样性的要求越来越高,保护生物学者需要及时更新专业知识与技能,用最前沿的技术与专业的素养为管理者制定保护措施、做管理决策提供更多的帮助。珍稀濒危野生动物的保护是保护生物学中最重要的内容之一,中华白海豚作为近岸海洋生态系统的旗舰濒危物种,又是国家一级重点保护动物,对其开展的保护生物学研究具有重要意义。一个物种灭绝的风险与其栖息地的大小和质量有关,生态学和保护生物学的一个关键问题是确定物种如何在空间中分布,并保护其可能的潜在栖息地。尽管过去二十多年来我国对中华白海豚实施了相当多的研究,获得了丰富的种群生物基线信息,但是目前我们对中华白海豚分布范围的了解仍然局限在少数区域。由于传统生态考察的局限性,我国沿海仍有许多未经考察的区域,这使我们所得到的基线信息存在着缺口,包括宏观尺度下中华白海豚分布区域以及栖息地结构的信息缺口,关于中华白海豚分布与环境特征的关联性的信息缺口,以及关于核心(关键)栖息地环境特征的缺口,面对这三个主要的信息缺口,我们有必要用新的理念与技术手段进行研究,填补基线信息缺口,进而为保护中华白海豚及其栖息地提供决策建议。
  本研究基于汕头与厦门实地考察的中华白海豚出现位点,使用叶绿素浓度、海水表面温度与海水深度3个环境变量的遥感数据,利用物种分布模型中的最大熵值模型预测我国闽粤沿海中华白海豚潜在栖息地的分布,预测结果如下:
  1、我国闽粤沿海中华白海豚栖息地的总面积约为24963.91km2,核心栖息地(Likely core habitats,LCH)面积约为14525.38km2,潜在栖息地(Likely potential habitats,LPH)面积约为10438.53km2。
  2、我国闽粤沿海中华白海豚的栖息地呈现出不连续的岛状结构,在雷州湾,珠江口,汕头以及厦门等水域具有较大的栖息地面积,在这些区域之间存在小型不连续分布的潜在栖息地,如惠东、汕尾、陆丰等沿海的港湾水域。
  3、关键栖息地的主要特征是高叶绿素浓度与浅的海水深度,即我国闽粤沿海的中华白海豚主要分布在具有较高叶绿素浓度(3.5~4.5mg/m3为可能的阈值值域)和水深小于十米的浅水沿岸海域,而海水表面温度对其分布的影响甚微。
  以上结果暗示:
  1、中华白海豚在我国闽粤沿海可能是不连续分布的。从栖息地面积来看,除湛江与珠江口水域可能存在数量庞大的群体外,其它地区则可能存在由许多小群体所形成的“集合种群(metapopulation)”,然而不同水域间是否存在个体交流仍然有待进一步研究证实。
  2、在宏观尺度下,中华白海豚分布与叶绿素浓度和水深有关,叶绿素浓度作为海洋基础生产力的指标,与水深因子协同影响饵料鱼的分布与获取,这暗示着食物资源的丰富度与可获得度,可能是影响中华白海豚分布的最主要因素。
  本研究在一定程度上弥补了传统生态考察的不足,提供了一种利用有限信息建立较为完整的基线信息并避免信息缺口的方法与思路,虽然模型预测从来都不能代替实地考察,但可以为之后进一步的研究指明方向:
  1、加强不同水域关键栖息地之间被预测为潜在栖息地水域的考察,确定其栖息现状,若有白海豚出现则可以为填补基线信息缺口提供更多的数据支持,若确定没有白海豚出现则可以研究在基本环境条件具备的前提下没有白海豚出现的原因,为潜在栖息地之间廊道的修复与现有栖息地的保护提供建议。
  2、我们现有的数据很可能低估了我国中华白海豚的分布范围,现有的保护区不足以完全保护中华白海豚的潜在栖息地,保护潜在栖息地中具有高生产力的生物多样性热点区域应当是优先考虑的保护原则。
  3、未来可以考虑利用更多其它区域的实地考察数据做更多更精细的模型预测,用分辨率更高、时间尺度更精细、片段更多的预测结果来描绘出更加精确的潜在栖息地分布图,为更合理地设置保护区提供支持。
[硕士论文] 苟士正
生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:日本三角涡虫属扁形动物门涡虫纲的一种淡水涡虫,因其具有超强的再生能力,是研究动物再生的良好模式动物之一。涡虫的再生是由其体内唯一具有分裂增殖和分化能力的成体干细胞neoblasts介导的。因此,neoblasts生物学特性研究对揭示涡虫再生及修复机制具有重要的意义,如何鉴别neoblasts是研究前提。早期neobalsts的鉴别主要依赖形态学特征—细胞呈圆形或椭圆型,体积较小,具有较大核质比,细胞质内含有不均匀分布的拟染色质,形态学鉴别对仪器设备要求较高,需要一定的经验,鉴定结果不准确,无法对neoblasts进行精细鉴别;随着分子生物学的发展,根据neoblasts是“涡虫体内唯一具有分裂增殖和分化能力的细胞”这一特征,采用细胞分裂过程中特异的分子作为neoblasts的特异性分子标记,采用的方法一般为原位杂交或抗体介导的免疫组化,但这些分子标记均为细胞内标记,操作过程繁琐,所需时间长,对细胞损伤大。为简化日本三角涡虫neoblasts的标记过程,建立简便、快捷、特异的标记方法,本文选取neoblasts特异性间隙连接蛋白DjINX-11为标记的目标蛋白,用DNASTAR Lasergene软件和在线工具TMHMM Server v.2.0对DjINX-11的抗原性、亲水性及跨膜域进行分析,选择该蛋白第1个胞外环中抗原性较强的序列(55-111位氨基酸)为靶序列,构建该片段原核表达载体,转化BL21感受态细胞,用终浓度为0.4 mM的IPTG37℃诱导表达3h,对诱导产的进行SDS-PAGE分析,纯化抗原,制备相应的多克隆抗体。通过细胞荧光实验结合DjINX-11的编码基因Djinx-11和neoblasts特异性标志基因DjpiwiA双色荧光原位杂交实验对制备抗体的特异性进行检测。结果显示:所制备的多克隆抗体标记的阳性细胞具有较大的核质比,符合neoblasts的形态学特征;Djinx-11与DjpiwiA双色荧光原位杂交显示,DjpiwiA阳性细胞与Djinx-11阳性细胞完全重叠,Djinx-11阳性细胞中仅部分细胞为DjpiwiA阳性,但Djinx-11阳性细胞均具有neoblasts的形态学特征,因此,DjINX-11除标记标记neoblasts外,还标记具有neoblasts特征但DjpiwiA阴性的其它细胞。总之,本研究成功制备了抗DjINX-11多克隆抗体,为研究该蛋白功能及相关细胞生物学特征奠定了基础。
[硕士论文] 杨文志
生物化学与分子生物学 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:基因组印记是一种表观遗传现象,是指基因组中的部分基因能够以依赖亲本来源的方式实现单等位基因表达。印记基因通常成簇存在,并且在物种间相对保守。Dlk1-Dio3印记域在细胞分化和胚胎发育过程中发挥着重要作用,该区域内印记长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的表达与诱导全功能干细胞的发育潜能有关。
  长非编码RNA是指长度大于200bp的一类非编码蛋白的RNA,因其在基因组中的含量巨大及具有重要的生物学功能而引起了学术界的广泛关注。根据长非编码RNA在基因组中的位置,可以将其分为反义lncRNA,基因间lncRNA,增强子lncRNA和内元lncRNA。最近,在小鼠的Dlk1-Dio3印记域内发现了一些位于基因间和基因内元的lncRNA,然而牛Dlk1-Dio3印记区域内的lncRNA研究还很少。
  为了鉴别牛Dlk1-Dio3印记区域内的长非编码RNA,本研究选取位于Meg8基因内元上及Meg8与Meg9基因间的4组EST序列,经RT-PCR扩增,得到3个内元lncRNA和1个基因间lncRNA,分别命名为Meg8-IT1,Meg8-IT2,Meg8-IT3和Linc24062。分析这4个lncRNA基因在成年牛8个组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪和大脑)中的表达,发现其在被检测的组织中均表达。利用基于SNP的PCR产物直接测序法,发现Meg8-IT1,Meg8-IT2,Meg8-IT3和Linc24062在牛被检测组织中均为单等位基因表达,说明它们在牛中是印记的。
  Mico1和Mico1os基因是在鼠Dlk1-Dio3印记域内被发现的两个母源表达的印记lncRNA。在此研究中,首先用RT-PCR的方法获得牛Mico1和Mico1os基因的cDNA序列,并通过链特异性RT-PCR确定两个基因的转录方向,证明两者是来自同一区段的双向转录物。检测Mico1和Mico1os基因在来自围产期死亡的体细胞核移植牛和自然繁殖牛的组织中的表达情况,发现在自然繁殖牛6个被检测的组织(心、肝、脾、肺、肾和大脑)中,Mico1和Mico1os基因均呈现单等位基因表达,而在体细胞核移植牛组织中发现多种异常的表达模式。为揭示DNA甲基化是否调控Mico1和Mico1os基因的单等位基因表达,针对Mico1和Mico1os基因正常和异常表达的组织,选取Mico1和Mico1os基因内部和上游的6个区域进行甲基化分析。结果显示在自然繁殖牛和体细胞核移植牛的组织中,被检测的6个区段均呈现高甲基化状态,推测DNA甲基化修饰可能未参与调控Mico1和Mico1os基因的单等位表达。在Mico1和Mico1os基因异常表达的体细胞核移植牛组织中,3个下游已知的印记基因(Gtl2,Meg9和Dio3)均呈现正常单等位基因表达,表明Mico1和Mico1os基因紊乱并未影响Dlk1-Dio3印记域内下游基因Gtl2,Meg9和Dio3的印记表达。
[硕士论文] 孙士涛
设施园艺学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:近年来随着设施园艺产业的发展,土壤盐渍化问题日趋严重,制约了我国设施蔬菜产业的发展,黄瓜是设施蔬菜栽培生产中主栽的蔬菜作物,耐盐性较弱。课题组前期研究表明采用耐盐性强的南瓜砧木嫁接黄瓜能提高耐盐性,脱落酸(ABA)在盐胁迫响应中有重要作用,关于嫁接黄瓜耐盐性中ABA作用机制尚不明晰。嫁接植株作为一种复合体,砧木与接穗如何进行信号交流仍有待进一步研究。本研究以黄瓜(Cucumis sativus L),南瓜(Cucurbita Moschata Duch)为材料,采用黄瓜自根(Cs)、南瓜自根(Cm)、南瓜砧木嫁接黄瓜(Cs-Cm)、黄瓜自嫁(Cs-Cs)植株,从表观形态、光合、气孔开闭、脱落酸(ABA)对气孔调控、气孔对ABA敏感性等方面研究了盐胁迫下ABA在提高嫁接黄瓜耐盐性中信号调控作用,主要结论如下:
  1.南瓜砧木嫁接黄瓜在盐胁迫下较自嫁黄瓜能快速关闭气孔。以Cs-Cs和Cs-Cm,测定了南瓜砧木嫁接黄瓜、自嫁黄瓜在0和75 mM NaCl处理下气孔开闭、光合参数、ABA含量以及H2O2含量变化情况。研究发现,早期NaCl处理下(0 h-6h),两种材料叶片ABA含量逐渐升高,而且南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜能够快速、彻底关闭气孔,降低植株蒸腾速率,因此减少了叶片水分散失,缓解了盐胁迫下叶片萎蔫。
  2.南瓜自根材料在盐胁迫下较黄瓜自根材料能快速关闭气孔。研究了黄瓜自根和南瓜自根在0和75 mM NaCl胁迫下气孔导度、蒸腾速率、ABA含量和H2O2含量变化情况。结果表明,早期盐胁迫处理下(0h-6h),两种材料叶片ABA含量逐渐升高,而且与黄瓜自根材料相比,南瓜自根材料气孔关闭更快速和彻底。
  3.盐胁迫下根系产生的ABA可能通过木质部转运到地上部叶片中调控气孔关闭。通过分析盐胁迫下嫁接黄瓜和自根材料根系和叶片ABA含量及ABA相关基因表达情况,发现盐胁迫下嫁接黄瓜和自根材料叶片ABA含量均显著高于根系,然而植株根系ABA合成、转运相关基因显著上调,而且采用ABA抑制剂(50μM Fluridone)预处理叶片对植株叶片气孔导度、蒸腾速率无明显影响,而使用ABA抑制剂预处理根系显著降低了地上部叶片ABA含量,引起叶片气孔导度和蒸腾速率升高,表明盐胁迫下叶片ABA可能更多来源于根系。
  4.ABA和H2O2在嫁接黄瓜气孔快速关闭过程中起到重要作用。通过ABA抑制剂(50μM Fluridone)和H2O2抑制剂(100 mM DPI)预处理Cs-Cm植株和Cs-Cs植株根系和叶片,检测了75 mM NaCl胁迫下两种材料叶片气孔导度、蒸腾速率、ABA含量的变化。研究发现,ABA抑制剂和H2O2抑制剂预处理植株根系时,显著降低了两种材料叶片ABA积累,引起叶片气孔导度和蒸腾速率升高,表明ABA和H2O2参与了盐胁迫诱导嫁接黄瓜气孔快速关闭过程。采用外源ABA(20μM)预喷施Cs-Cm植株和Cs-Cs植株叶片,实验结果表明,外源ABA预喷施处理,降低了盐胁迫下嫁接黄瓜叶片气孔导度和蒸腾速率,缓解了植株叶片萎蔫情况。
  5.南瓜砧木提高了嫁接黄瓜叶片气孔对ABA敏感性。以南瓜自根、黄瓜自嫁和南瓜砧木嫁接黄瓜植株为材料,在不同浓度ABA(0μM、10μM、20μM、50μM、100μM)处理下,检测了三种材料离体叶片气孔关闭情况。结果表明,南瓜砧木提高了嫁接黄瓜叶片气孔对ABA的敏感性。
  6.等渗PEG胁迫下南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜更彻底关闭气孔,缓解植株萎蔫,表现出与盐胁迫处理一致性。通过分析盐胁迫和等渗的PEG溶液胁迫处理下嫁接黄瓜的响应,研究还发现,相比于盐胁迫处理,在相同时间点渗透胁迫下两种材料气孔导度和蒸腾速率略高于盐处理,表现出与盐胁迫处理的差异性。
  综合上述研究结论,NaCl胁迫下南瓜砧木嫁接黄瓜较自嫁黄瓜提高了叶片气孔对ABA敏感性,引起气孔快速关闭,降低蒸腾作用,减少水分散失,缓解了植株萎蔫,增强了嫁接黄瓜盐胁迫适应性,ABA和H2O2在盐胁迫下叶片气孔关闭的响应中发挥了重要作用。
[博士论文] 曹婧
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物中,卵泡闭锁是卵泡发育过程中一个复杂且不可避免的退化过程,受到激素、生长因子等多种因素的调控,而颗粒细胞在卵泡的发育中扮演至关重要的角色,其凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因。Aurora B(丝氨酸/苏氨酸激酶)作为染色体乘客蛋白的一员,参与调控染色体的排列、纺锤体的组装以及胞质分裂等有丝分裂过程。此外,SUMO修饰参与蛋白质互作、信号转导、核质运输、转录调控以及调节基因组稳定性等方面,虽已有文献报道Aurora B可以被SUMO修饰,但是对于Aurora B及其SUMO修饰对卵泡发育的影响方面,仍然是个未解之谜。因此,本课题将以小鼠卵泡及其颗粒细胞为研究模型,主要研究Aurora B及其SUMO修饰对卵泡及其颗粒细胞发育的影响,初步探索可能存在的调控机制。本实验分为两个部分,具体内容和结果如下:
  实验一:Aurora B对小鼠卵泡及其颗粒细胞发育的影响研究
  1、AuroraB在卵泡及颗粒细胞中的定位与表达模式。获取不同发育阶段卵泡及颗粒细胞,检测Aurora B的定位及表达。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核,当胞质分裂时,位于围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的发育,Aurora B在各级卵泡和颗粒细胞中的表达水平上升,在有腔期达到最大;
  2、Aurora B影响卵泡的发育。体外分离获得次级卵泡,添加Aurora B抑制剂培养,观察记录卵泡的生长情况。研究结果显示,抑制AuroraB活性后,卵泡生长速度成下降,闭锁率增加,卵泡的发育受到抑制;
  3、Aurora B影响颗粒细胞的生长。选取有腔期颗粒细胞(pre-GCs),进行抑制剂培养,检测细胞周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,抑制Aurora B后,G0/G1期细胞比例显著增加、S期细胞比例显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻;
  4、初步探索Aurora B调控颗粒细胞生长的分子机制。选取pre-GCs进行抑制剂培养,检测调控细胞增殖与凋亡相关基因和蛋白水平。研究结果显示,Aurora B参与调控p38MAPK与Fas/FasL信号通路,下调G1期向S期转化的细胞周期蛋白CDK4、增殖相关蛋白PCNA以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,上调细胞死亡蛋白Fas、凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表达量,最终参与颗粒细胞的生长调控。
  实验二:Aurora B的SUMO修饰验证及其对卵泡颗粒细胞的影响
  1、SUMO修饰验证。成功构建几种真核表达质粒,选取pre-GCs体外分离培养,利用免疫共沉淀法检测SUMO修饰。研究结果显示,在颗粒细胞中,Aurora B可以被SUMO2修饰,Lys207为主要的SUMO2修饰位点;
  2、SUMO2修饰影响Aurora B的生物功能。体外分离培养pre-GCs,首先利用免疫细胞化学法检测Aurora B的定位分布。研究结果显示,Aurora B定位于颗粒细胞核内,而Aurora BK207R主要定位在细胞核,部分定位在细胞质中;其次利用Westernblot法检测Aurora B的蛋白稳定性。研究结果显示,SUMO2可以在一定范围内促进Aurora B的蛋白表达水平。表明,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的定位与蛋白稳定性;
  3、SUM02修饰影响颗粒细胞的生长。体外分离培养pre-GCs,分别转染对照组(HA)、正常组(HA-Aurora B)和突变组(HA-Aurora BK207R),检测细胞的周期、增殖和凋亡情况。研究结果显示,突变组G0/G1期细胞比例显著增加、S期和G2/M期细胞比例均显著下降,细胞被明显的阻滞在G1-S期,增殖率显著下降,凋亡率显著增加,致使细胞生长受阻。
  综上,本研究发现在小鼠卵泡中,Aurora B定位于颗粒细胞核,胞质分裂时,转定位至中间体和围绕细胞核的胞质中,且随着卵泡的成熟,Aurora B在卵泡和颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,在有腔期达到最大。抑制Aurora B后卵泡生长受阻、凋亡增加,并通过p38MAPK和Fas/FasL信号通路,下调CDK4、PCNA和Bcl-2的水平,上调caspase-8、caspase-3水平,影响颗粒细胞生长。此外,发现AuroraB可以被SUMO2修饰,Lys207为主要修饰位点,SUMO2修饰可以维持Aurora B在颗粒细胞中的亚细胞定位和稳定性,影响颗粒细胞的生长。本研究结果将为卵泡的发育和闭锁提供一定的理论依据,同时也为更好的治疗卵巢疾病奠定基础。
[硕士论文] 陈红苗
动物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:为了研究镉胁迫对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)的生殖毒性作用,以及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对其氧化损伤是否具有缓解作用,本学位论文采用急性和慢性镉胁迫相结合的方法进行了设计。急性组设置了对照组、7.25和14.5 mg/L镉浓度组,分别处理3 d、5 d和7 d;慢性组设置了对照组、0.725和1.45 mg/L镉浓度组,分别处理7 d、14 d和28 d。NAC实验则设置了对照组、镉(0.725 mg/L)单独作用组以及镉(0.725 mg/L)和NAC(0.1、0.2、0.4 g/L)联合作用组,分别处理7 d、14 d和28 d。
  实验内容包括三部分:
  1.镉对河南华溪蟹卵巢的影响研究了急性与慢性胁迫下,镉在河南华溪蟹卵巢组织的积累;同时,对卵巢超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)活性,脂质过氧化水平(malonyldialdehyde, MDA含量)和金属硫蛋白(metallothionein, MT)的表达水平进行了检测。结果显示,卵巢组织的镉含量在慢性和急性条件下显著增加,均具有浓度效应;慢性条件还具有明显的时间效应。慢性条件下,SOD、CAT和GPx活性在7 d或14 d开始下降,在14和28 d显著升高。MDA和MT含量整体呈现增加趋势。但急性条件下,抗氧化酶活性、MDA含量和MT水平均无显著性变化。
  2.镉对河南华溪蟹副性腺的影响研究了镉在河南华溪蟹副性腺组织的积累,镉对副性腺组织细胞显微与亚显微结构改变,抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性,MDA含量,蛋白质羰基化(PCO含量)和DNA-蛋白质交联(DPC)的影响。结果显示,镉在副性腺组织中的积累显著或极显著高于对照组,且随着时间的延长和浓度的增加,副性腺组织镉的积累逐渐升高。副性腺组织细胞结构发生了不同程度的改变,主要表现在:上皮细胞与基膜分离甚至破裂导致细胞核丢失。镉浓度0.725 mg/L和1.45 mg/L处理28 d,基膜结构发生明显改变,上皮细胞和基膜之间出现较大空腔,上皮细胞细胞核变形。电镜结果显示,细胞器结构改变,例如染色质凝集固缩,核膜消失;线粒体嵴断裂,出现空泡化;粗面内质网和高尔基体肿胀形状不规则,髓样体增多。SOD和GPx活性先升后降,而CAT的活性则随着镉浓度的增加逐渐升高。PCO含量和DPC均随着时间和浓度的增加而显著升高。MDA含量也呈明显的升高趋势。但在28 d有所下降。
  3. NAC对河南华溪蟹卵巢镉氧化损伤的影响研究了镉在河南华溪蟹卵巢组织中的含量,SOD、CAT和GPx活性,MDA含量和卵巢组织细胞结构的变化。结果显示,镉单独作用下,卵巢组织镉含量和MDA含量显著高于对照组;SOD、CAT和GPx活性在不同时间段显著升高;组织显微结构随着时间的延长而损伤严重。NAC和镉联合作用下,卵巢组织镉含量在14 d和28 d显著降低;SOD活性于14 d显著降低;CAT、GPx活性和MDA含量在28 d均降低,并逐渐恢复到正常水平;随着时间的延长和NAC浓度的增加,卵巢组织细胞损伤出现改善,核膜逐渐完整,仅有少量染色质凝集,细胞内及细胞核内空泡化现象基本消失,卵巢组织结构趋于正常化。NAC对镉诱导河南华溪蟹副性腺氧化损伤的缓解作用有待于进一步研究。
  通过实验研究得出以下结论:
  (1)急性和慢性镉暴露均可导致镉在河南华溪蟹卵巢组织中积累,但只有慢性镉暴露会引起卵巢的氧化应激反应,对卵巢损伤较大,损伤河南华溪蟹雌蟹的生殖功能。
  (2)慢性镉胁迫对河南华溪蟹副性腺组织特别是管壁上皮细胞层造成了损伤,并且对抗氧化系统产生了氧化损伤。使河南华溪蟹雄蟹正常的生殖功能受到影响。
  (3)作为重要的抗氧化剂,NAC可以有效地缓解镉对河南华溪蟹卵巢的氧化损伤,进一步证明氧化损伤是镉对蟹体毒性作用的重要机制之一。同时也说明NAC对镉污染的动物具有保护作用。
[硕士论文] 司马应许
生物学、动物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),在动物系统演化中占有重要地位,并且具有极强的再生能力。目前,虽然已克隆大量与涡虫再生相关的基因,但其具体的再生机制及相关基因的功能仍不清楚。
  本文从日本三角涡虫转录组数据库中筛选出再生过程中持续上调表达但表达量较低的热休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因。利用整体原位杂交、RNA干扰和Real time-PCR等分子生物学技术对四基因的时空表达模式和功能进行分析,结果如下:
  (1)通过Real time-PCR技术对切割损伤、离子液体暴露、冷应激和热应激环境下日本三角涡虫体内四基因的表达量进行分析,结果显示:在应激条件下,四基因的表达量均明显上调,并且随着切割损伤时间的延长、离子液体浓度的升高,四基因的表达量逐渐上升。
  (2)日本三角涡虫Djhsp70e基因的cDNA长度为1982bp,5'端有180bp非编码区,3'端有38bp的非翻译区,其中包含一个长度为1764bp的最大开放阅读框(ORF),编码一个由587个氨基酸构成的蛋白质,含有两个热休克蛋白70家族所特有的标签序列。原位杂交结果显示:在整体中,该基因在除脑及咽部以外的身体各部分广泛表达,身体两侧和肠支处杂交信号较强;再生个体的芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫出现严重头部溶解且不能再生,而头再生尾片段也出现严重的溶解现象。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (3)日本三角涡虫Djhsp90a基因cDNA长为3212bp,包括5'端1039bp的非编码区和3'端22bp的非编码区,其中包含一个长度为2151bp的ORF,编码一个由716个氨基酸构成的蛋白质。其中包含6个热休克蛋白90家族所特有的序列标签。原位杂交结果显示:在整体涡虫中杂交信号主要分布在除脑及咽以外的大部分实质组织中;在再生个体中的芽基部位有较强杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫出现明显的头部溶解现象并伴有身体持续性皱缩;头再生尾片段再生被抑制;尾再生头片段与对照比没有明显变化。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (4)日本三角涡虫Djhsp90b基因的cDNA长度为2636bp,5'端有94bp的非编码区和3'端有132bp非编码区,含有2409bp的最大开放阅读框,编码一个由802个氨基酸构成的蛋白质。该基因所推导的氨基酸序列含有5个HSP90家族所特有的标签序列。整体原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫实质组织中广泛表达且身体两侧有较强的杂交信号;再生个体的芽基部位杂交信号较强。RNA干扰该基因后,整体涡虫身体出现明显的皱缩;头再生尾和尾再生头片段再生速度缓慢。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后,Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
  (5)日本三角涡虫中Djhsp90c基因的cDNA长为2573bp,其中包含一个长度为2394bp的最大开放阅读框,编码一个由797bp氨基酸编码的蛋白质,5'端有114bp的非编码区,3'端有65bp的非编码区。包含6个HSP90家族基因所特有的标签序列。原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫中杂交信号主要分布在身体两侧及尾部;再生片段芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后,整体涡虫口部两侧出现膨胀现象;头再生尾和尾再生头片段再生受到抑制。Realtime-PCR结果表明干扰该基因后,Djpiwi-1、Djpiwi-b和Djh2b基因的表达量显著下调。
  以上结果表明:涡虫体内Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因在应激条件均具有细胞保护作用;四基因通过调控干细胞维持涡虫体内组织平衡,并在再生过程中起重要作用。除此之外,Djhsp90c基因通过调节Djpiwi-b和Djh2b基因调节涡虫体内干细胞的增殖和分化,是涡虫再生过程中重要的调节因子。
[博士论文] 黄纯杰
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会进步,人类生殖障碍已成为全世界令人堪忧的医学和社会学难题。其中一个重要因素就是由各种已知或未知原因导致的女性卵子数量和/或质量恶化。恶化的卵子往往无法完成减数分裂或在减数分裂过程中染色体更易发生异常分离产生非整倍体配子,进而导致女性不孕、流产和新生儿先天缺陷。因此,从分子水平阐明调控卵子减数分裂和胚胎发育的机制对于提高和改善人类生殖能力具有重要的医学和社会学意义。SENP7是一种去SUMO化蛋白酶,作用于多聚SUMO链的剪切,从而维持SUMO化修饰的动态平衡。体细胞中,SENP7参与调控染色质稳态和DNA损伤修复。然而,SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的作用仍有待研究。本研究以小鼠为模型,通过敲低卵子和早期胚胎中内源性SENP7的表达以研究其在哺乳动物卵子成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制。主要研究结果如下:
  (1)敲低GⅤ期(减数第一次分裂前期)卵子内SENP7的表达后卵子减数分裂进程受到明显抑制。表现为卵子恢复减数分裂(GVBD)和第一极体排放(PBE)受阻,导致成熟卵子的产生显著减少;
  (2)敲低SENP7表达后,组蛋白H3K9和H3K27表观修饰状态的改变(乙酰化上调和三甲基化下调),以及Cdc14B/C表达水平上调伴随着的CyclinB1和CyclinB2降解导致卵子恢复减数分裂受阻以及卵子内纺锤体组装异常;
  (3)y-tubulin定位紊乱以及泛素化修饰介导的γ-tubulin表达量下调也直接引起SENP7缺失型卵子内纺锤体组装异常;
  (4)纺锤体组装异常使恢复减数分裂的SENP7缺失型卵子后续发育受阻;同时持续活化的纺锤体组装检验点将这些卵子的发育进程阻滞在MⅠ期之前,导致这些卵子无法进入AⅠ期,进而无法排出第一极体;
  (5)敲低受精卵内SENP7表达后,胚胎发育同样出现明显缺陷。表现为胚胎卵裂受阻,大部分胚胎甚至无法发育到2细胞时期,导致囊胚发育率趋于零水平。同时,伴随着时间的延长,胚胎会发生凋亡;
  (6) SENP7缺失型胚胎内组蛋白H3K9和H3K27表观修饰的紊乱(乙酰化水平上调和三甲基化水平下调)以及DNA5hmC修饰水平的下调导致DNA损伤位点邻近的染色质无法维持DNA修复所需的理想空间结构;HP1α在常染色质上的分布导致DNA修复蛋白Rad51C的表达量下调;胚胎有丝分裂过程中纺锤体组装同样出现异常。这些因素共同导致缺失母源性SENP7的胚胎无法修复其基因组中存在的DNA损伤,因而胚胎发育出现缺陷甚至胚胎发生凋亡;
  综上,本研究揭示了母源性SENP7在哺乳动物卵子和胚胎发育过程中的关键作用及其分子机制。另外,本研究将SUMO化修饰与染色质上的其他修饰在生殖生物学的一些事件中联系起来,有助于认识生殖发育过程中蛋白质水平的复杂调控网络,为提高动物繁殖和人类生殖健康提供重要理论依据。
[硕士论文] 董艳萍
生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:日本三角涡虫(Dugesia japonica)隶属扁形动物门(Platyhelminthes),涡虫纲(Turbellaria),在动物系统演化中占有重要地位,并且具有极强的损伤修复及再生能力。但目前,其再生机制并不清楚。本文利用生物信息学、Real-time PCR、原位杂交和RNA干扰等技术对日本三角涡虫转录组中表达量较高的热休克蛋白70家族基因Djhsp70a、Djhsp70b、Djhsp70c、Djhsp70d进行了定量、定位和功能分析。
  本研究主要内容包括:⑴对四基因进行温度、切割损伤和离子液体应激处理,结果表明:涡虫在培养温度低于或者高于20℃,切割损伤和离子液体处理应激条件下,四基因表达量均明显上调。⑵Djhsp70a生物信息学分析发现:DjHSP70a蛋白是稳定的亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点和糖基化位点,含有HSP70家族标签3和末端高度保守的EEVD序列;整体原位杂交结果显示:Djhsp70a基因在整体以及再生涡虫中广泛表达,其中整体涡虫身体两侧有较强杂交信号,再生涡虫芽基处有杂交信号且再生5d和7d时杂交信号最强;Djhsp70a基因干扰后,2/3整体涡虫咽后部膨大,全身皱缩,头部有缺刻,体表开裂,体色加深;3/5再生涡虫的再生速度明显变慢;Real-time PCR检测结果表明:干扰后涡虫Djhsp70a基因,Djpiwi-1,Djpiwi-b,Djh2b的表达量显著下调。说明该基因在涡虫体内干细胞维持、分化和增殖中起重要作用。⑶Djhsp70b生物信息学分析发现:DjHSP70b蛋白是一种亲水性蛋白,包含3个HSP70家族标签序列和末端高度保守的EEVD序列;原位杂交结果显示:Djhsp70b基因在整体涡虫中的头部和身体两侧有较强杂交信号,在再生涡虫芽基处均有较强的杂交信号;Djhsp70b基因干扰后,3/5整体涡虫背侧中线部位发生缺口、咽部发生断裂或者尾部有缺刻,4/5的再生涡虫再生速度变慢;特别是尾再生头片段至再生5d时仍没有出现眼点;Real-time PCR检测表明:干扰后涡虫Djhsp70b和Djpiwi-1两基因的表达量显著下调,说明该基因在涡虫体内在干细胞的维持及组织分化如眼点分化中起重要作用。⑷Djhsp70c生物信息学分析表明:DjHSP70c蛋白是一种亲水性蛋白,包含3个HSP70家族标签序列和末端高度保守的EEVD序列,具有多个磷酸化位点和糖基化位点,是一种稳定的亲水性蛋白;整体原位杂交结果显示:Djhsp70c基因在整体以及再生涡虫中广泛表达,其中在整体涡虫的头部边缘和身体两侧有较强杂交信号,再生涡虫芽基处均有杂交信号;Djhsp70c基因干扰后,7/10整体涡虫咽前和尾部有明显损伤,直到后期损伤部位发生断裂;4/5的涡虫切割后再生停止;Real-time PCR检测表明:干扰后Djhsp70c,Djpiwi-1,Djpiwi-b的表达量显著下调。说明该基因在涡虫体内对于干细胞维持、分化起重要作用,同时在涡虫再生过程中起重要的调控作用,是再生过程所必需的关键调控因子。⑸Djhsp70d生物信息学分析表明:DjHSP70d蛋白是一种亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点和糖基化位点,包含热休克蛋白70家族标签3;整体原位杂交结果显示:Djhsp70d基因在整体以及再生涡虫中广泛表达,其中在整体涡虫中的身体两侧,接近表皮有较强杂交信号,再生涡虫的芽基处均有杂交信号且再生5d的芽基杂交信号最强,再生7d信号减弱;Djhsp70d基因RNA干扰后,1/2整体涡虫背部中线出有溃烂,尾部有明显损伤,直到后期损伤部位发生断裂;Real-time PCR检测表明:干扰后Djhsp70d,Djpiwi-1,Djpiwi-b的表达量显著下调。说明该基因参与了涡虫体内干细胞的维持,可能参与涡虫体内蛋白质相关内质网降解途径。
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