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[博士论文] 吴成超
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:人类基因组计划发现,人类基因组中超过98%的区域是非编码区域。ENCODE、Roadmap epigenomics等后续计划进一步发现,非编码DNA中包含如DNA甲基化位点、启动子、增强子等众多DNA调控元件。DNA调控元件通过激活或抑制转录事件,精准地调控目标基因的表达量。一方面,这些DNA调控元件正是由于其环境序列的特异性才能够参与转录调控;另一方面,DNA序列在数学上可被视为有限字母表上的有限词,研究其复杂度特征可以挖掘DNA的序列特异性。这激发我们通过序列复杂度数学工具来量化识别DNA调控元件。本研究分为以下三部分:
  第一部分,我们详细描述两种序列复杂度的数学定义,重点研究其计算算法,并通过特征选择筛选出有效特征。首先根据不同序列长度确定因子复杂度的算法获取原始特征,随后根据二阶差分工具筛选拓扑熵特征,并最终确定因子复杂度的有效特征。同时,我们研究了abelian复杂度的数学定义和计算算法,并通过对abelian复杂度特征进行特征筛选确定出其有效特征。
  第二部分,我们应用因子复杂度有效特征构建CpG甲基化水平预测模型。我们首先获取人类胚胎细胞的甲基化实验数据,并筛选其中的CpG甲基化位点。在将位点扩增至合适长度之后,我们提取序列因子复杂度特征和序列的基本组成特征,并构建了基于支持向量机算法的CpG甲基化水平预测模型,该模型在不同染色体上的平均分类准确率为94.7%。与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后我们利用已构建的预测模型预测全基因组水平不同功能元件中的CpG甲基化平均水平,通过与实验数据的对比,进一步验证了该模型的预测能力。
  第三部分,我们应用abelian复杂度特征构建增强子预测模型。我们从FANTOM5计划的数据库中获取人类基因组的增强子数据,通过提取序列abelian复杂度特征和序列基本组成特征,构建了基于随机森林算法的增强子预测模型,其中正负样本1∶1模型的分类准确率为93.1%,正负样本1∶10模型的分类准确率为96.0%。在与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后利用该模型在人类基因组22号染色体进行步长为100bp的扫描预测,成功预测到5,123条增强子区域。以不同细胞系和组织的组蛋白修饰信号为佐证,扫描预测准确率最高可达42.8%。
  综上所述,我们通过研究序列的因子复杂度特征和abelian复杂度特征,结合基本序列组成特征,成功构建了DNA甲基化、增强子等DNA调控元件的精准预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小和降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关研究工作提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 张蕾
计算机技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:DNA测序是生物信息学的一项重要内容。从一代测序到二代测序,测序技术历经了方法和效率的巨大改变。在二代测序中,一次测序就可以获得GB级别的大规模测序数据。高通量测序产生的海量RNA-seq对数据分析技术提出了更高的要求。在分析RNA-seq数据的流程中,读段定位是分析RNA-seq数据的第一步,也是最重要的一步;读段定位直接影响着下游一系列数据分析的结果;已有大数据分析和计算技术为读段定位在运行时间和定位灵敏度上进一步提升提供了可能。以Hadoop为计算平台,本文开展了以下三个方面的研究工作:RNA-seq读段定位算法的研究;RNA-seq可变剪接识别算法的研究;RNA-seq数据分析结果的可视化。
  Hadoop作为大数据分析的主流计算平台,其计算特点可用来分析RNA-seq数据,本文设计了一个基于Hadoop的RNA-seq读段定位算法,以期提高读段定位过程运行效率,并使用种子扩展算法保证定位的灵敏度。算法主要学习了SeqMap的空位种子索引算法和mrFAST/mrsFAST的FastHASH方法,同时本文提出一个新的使种子定位到参考序列上的方法,新方法利用种子会连续定位的特点对定位规则做出了改变。实验证明:与传统读段定位工具相比,本文的基于Hadoop的读段定位算法不但可以在提升时间效率的同时,还可以保证读段定位过程的灵敏度。
  可变剪接是读段定位的下游的分析工作之一,对于以RNA-seq数据作为输入的可变剪接识别工具,往往需要依赖读段定位的结果才能进行可变剪接的识别分析,并且这些可变剪接识别工具需要依赖多个工具的支持以及注释文件才能进行识别,安装使用过程比较繁琐,能在并行环境下工作的可变剪接工具也较少,所以本文在读段定位的基础上设计了基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法,算法是根据工具SpliceMap和Tophat的思想设计而成,并提出一个新的跨越剪接位点的读段定位方法,新方法利用GT-AG剪切信号与读段种子间的规律辨别出剪接位点,进而实现跨越剪接位点的读段定位。实验证明:与ASTD可变剪接数据库相比,本文提出的基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法识别准确率可以达到50%以上,具有一定的实际应用价值。此外,基于本文算法开发的可变剪接识别工具具有使用过程简单,不依赖注释文件的优势。
  为了更加直观地展示可变剪接的识别结果,本文利用Servlet和Tomcat技术实现了可变剪接识别结果的可视化,可变剪接的识别结果可直接以网页的形式展示,参考序列上可变剪接发生的具体位置可以清晰显示,一目了然。
  读段定位的实验中,在2G以上的数据条件下,本文的读段定位算法的时间效率经过与Bowtie对比,可以提高将近40%,并且能识别出更多的读段,证明了基于Hadoop的读段定位算法可以提高时间效率并保证灵敏度。可变剪接实验中,本文算法通过与标准数据库对比,可以识别出参考序列五个可变剪接事件中的四个,准确率达到50%以上,可以证明本算法具有一定的实际应用价值。
[硕士论文] 李永飞
应用化学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:DNA是一种携带遗传信息的生物大分子,也是一种具有超强组装能力的纳米基元。二十世纪八十年代,Nadrian C Seeman教授率先提出采用DNA分子作为组装基元构筑高级有序结构,发展了DNA纳米技术这一重要新兴领域。迄今为止已经发展了多种组装策略,主要包括DNA模块自组装(tile-base assembly)、DNA折纸术(DNA Origam(1))和单链瓦片自组装(single-strand tile)。DNA纳米自组装的发展不仅大大丰富了微纳米结构的多样性与复杂性,在分析检测、生物医学等应用领域也展现出了巨大的应用潜力。本论文主要围绕DNA自组装开展了以下两方面研究:
  1.发展基于乙二胺的“无金属离子”缓冲体系,应用于DNA自组装。DNA自组装采用缓冲溶液大多为TAE/Mg2+,即需要金属阳离子(如:Mg2+)以屏蔽来自负电荷磷酸骨架的DNA链间静电斥力。但是,在某些应用中,镁离子或者其他金属阳离子的存在可能会带来不利影响,比如:增大金属离子依赖酶对DNA自组装纳米结构的影响。为了拓展DNA自组装的应用,本章节基于乙二胺分子开发出一种新的“无金属离子”缓冲体系用于DNA自组装,具体如下:(1)在乙二胺缓冲体系中,分别基于DNA双交叉模块和三臂模块成功组装得到二维纳米阵列和三维纳米笼—DNA四面体,表明这一新的缓冲体系适用于DNA自组装;(2)研究DNA自组装结构在新缓冲体系中的生物稳定性。研究表明:在新缓冲体系中,由于缺失镁离子,DNase I对DNA自组装结构的酶降解减弱;(3)基于新缓冲体系发展通用型pH调控手段。乙二胺分子具有pH响应性质,因此,基于乙二胺,可以实现DNA四面体组装与解组装的动态可逆调控。这种不依赖于DNA序列的pH响应调控,为DNA动态体系的开发提供了新的手段与思路。
  2.开发平行交叉四臂DNA模块,并组装得到DNA一维纳米管状结构。DNA自组装模块通常采用反平行交叉结形式,为了增加设计手段以及丰富DNA自组装结构多样性,本章节基于平行交叉结形式设计出一种新型四臂DNA自组装模块,并成功组装得到一维纳米管状结构。进一步探索了模块刚性、相对翻转角度等对自组装的影响。
[硕士论文] 程爱民
结构生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:基因的表达调控是一个发生在多时空、多层次的精细调控过程,包括表观遗传水平和翻译水平。组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传调控方式之一,涉及写入器、阅读器、擦除器的相互作用。BAP1是一种重要的泛素擦除器,可以被ASXL1激活,对H2AK119ub1去泛素化,从而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的机制以及BAP1定位在染色质上的机理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一种识别H3K56ac的组蛋白乙酰化阅读器,其识别的机理、识别的环境、识别的功能也不明确。除了组蛋白翻译后修饰,核糖体RNA的加工、成熟直接关系到蛋白质翻译机器核糖体的装配,也是重要的基因表达调控方式。U3 snoRNP核心复合物对rRNA进行2'-O-methylation修饰,促进rRNA的加工和成熟。目前对真核生物的U3 snoRNP核心复合物的装配研究较少。本文从三个方面对基因表达调控过程进行探究。
  BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在细胞核的成员,自身具有较低的酶活。ASXL1的DEUBAD结构域能够激活BAP1,并与BAP1形成PreDUB复合物对H2AK 119ub1去泛素化。我们在大肠杆菌中尝试多种方法成功表达和纯化了BAP1与ASXL1 DEUBAD结构域的复合物,生长的晶体最高衍射分辨率为2.6埃。我们发现BAP1单独存在时趋向于寡聚状态,而被ASXL1DEUBAD结构域激活后会形成稳定的异源二聚体,与报道的胞内研究结果一致。此外,我们用GST pull-down实验发现BAP1通过CTE结合在完整的核小体上,但不能作用于核小体酸性区、核小体DNA及游离的组蛋白,解释了BAP1/ASXL1复合物定位在染色质的机制。
  U3 snoRNA属于box C/D snoRNA,起引导核糖体RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58组成,其中fibrillarin是RNA甲基转移酶。复合物装配起始于snu 13与U3的box B/C、boxC/D,然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我们克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58,并表达纯化了snu13和fibrillarin。通过体外转录U3、box B/C和box C/D,用EMSA实验证实了snu13与U3的相互作用。snu13结合在U3的box B/C,亲和力为2.2μM,暗示snu 13还需要结合boxC/D以提高亲和力。此前有研究报道boxB/C自身为环(loop)结构,与snu13结合才能形成扭结(Kink-turn,K-turn)结构。我们利用RNA imino氢特殊的化学位移,发现在溶液状态下U3 box B/C也能形成K-turn结构。结合以前的研究,我们认为snu13通过构象选择机制而不是构象变化来结合U3 box B/C。
  H3K56ac是一个位于核小体核心区的乙酰化修饰,在转录、DNA复制、DNA损伤修复等过程发挥重要作用,而根据报道,CREBBP bromodomain可能是H3K56ac的阅读器,但作用机理不清楚。与徐莉同学合作,我们解析了CREBBP bromodomain与H3K56ac复合物的晶体结构。晶体结构表明,CREBBP bromodomain识别H3K56ac的方式类似于其他bromodomain与乙酰化赖氨酸的相互作用,都是通过一个疏水口袋、水介导的氢键网络和保守的天冬酰胺结合赖氨酸乙酰化侧链。有意思的是,H3αN在核小体上形成α-helix,而在CREBBP bromodomain中为伸展状态。GST pull-down实验发现,CREBBP bromodomain不能结合H3K56乙酰化的重组核小体,但是能识别H3/H4 dimer上的H3K56ac,证明了伸展状态的H3αN的确存在,与之前报道的H3/H4 tetramer上H3αN构象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明显促进HAT结构域乙酰化H3K56。根据上述研究结果,我们提出,CREBBP bromodomain从HAT活性中心捕获H3K56乙酰化的H3/H4 dimer,促进HAT进行下一轮H3K56乙酰化,随后H3K56乙酰化的H3/H4在CAF1的帮助下参与核小体组装。
[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 欧阳杉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究用含20%PEG6000的MS液体培养基模拟生理脱冰胁迫处理扁蓿豆幼苗,以上述胁迫处理6h的扁蓿豆幼苗叶片总RNA为模板进行反转录,运用RACE技术和RT-PCR方法,克隆得到扁蓿豆抗逆相关RNA剪切因子MrSKIP基因cDNA全长。序列分析结果显示,MrSKIP基因cDNA全长为2280bp,含有一个1833bp的完整开放阅读框,序列推测编码610个氨基酸含一条S-N-W-K-N的多肽,分子量为68.86145 KDa,等电点为8.95,生物信息学分析表明MrSKIP含有该家族的典型结构域SNW SKIP。进一步克隆得到了扁蓿豆基因组的MrSKIP基因,序列分析表明,该基因无内含子。
  利用tasiRNA技术和发根农杆菌转化法,在截形苜蓿108R根部干扰MrSKIP同源基因的表达,对转化外源基因的截型苜蓿根系进行干旱、高盐和低温胁迫处理,鉴定MrSKIP基因的功能,结果显示胁迫处理下干扰MrSKIP同源基因的的转基因根系样品,其根长和根鲜重均显著小于对照。研究结果初步表明MrSKIP基因表达量的降低影响植物对干旱、低温和高盐胁迫的耐受性,特别对干旱胁迫耐受性的降低尤为显著。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 胡双双
生物医学工程 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究江苏十个地区小家鼠的基因多样性和遗传进化关系,为国境口岸鼠形动物遗传进化规律和溯源的研究提供了确凿的技术支持,并为物种种内基因差异比较分析提供了重要的实验数据。通过生物信息学分析探索小家鼠种内差异与地理位置之间关系。
  方法:基于对江苏十个地区线粒体控制区基因和线粒体全基因组的研究,通过基因的扩增、测序和比对,研究小家鼠线粒体组成,结合GenBank的小家鼠线粒体基因组信息,对小家鼠进行遗传多态性分析和系统发育树研究。
  结果:获得小家鼠的线粒体控制区序列和线粒体全基因组序列,小家鼠线粒体基因组全长16,302 bp,由13种蛋白质编码基因、2种rRNA基因、22种tRNA基因、1个轻链复制起始区和1个控制区组成。经生物信息学分析发现小家鼠线粒体基因多态性丰富,其遗传进化规律域地理位置有一定的联系,不同地区小家鼠之间的分化程度大于同一地区小家鼠之间的分化程度。
  结论:小家鼠的种内差异程度与个体所处地理位置有很大的联系,我国的小家鼠大致可以长江为界限进行划分。江苏地区的小家鼠也显现出这种规律但并不明显。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 袁亚洲
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:基因识别是对DNA序列进行分析,获取其中重要信息的第一步。目前测序技术的发展使得测序数据呈爆发式增涨,然而实验方法无法快速有效的从海量信息中获取知识,基于此运用计算机技术来识别基因的方法应运而生。在2015年,我们课题组研发了原核生物基因识别程序ZCURVE3.0,该算法是基于Z曲线理论,采用新的机器学习算法SVM,增加新的特征变量,并且对内部参数进行进一步的优化,使得该识别算法更加快速准确高效。在预测出基因后,还需要知道其相应编码的蛋白质,于是我们基于ZCURVE3.0算法,对其进行进一步的升级,添加相关的功能,使得其成为完善的可视化集成系统。
  在本基因识别可视化系统中,第一部分是对ZCUREV3.0的功能进行可视化(BAGA)实现,其保留了相应识别算法的所有功能。在通过对50个原核生物的全基因组进行测试,选取比对阈值,排除伪基因,同时使得删除的正确基因数尽可能少,那样基本保持正确的基因数不变。在与GenBank提供的总的基因数相比,BAGA的预测基因识别率为97.60%,预测结果的特异度为96.74%,与ZCURVE3.0的特异度94.21%相比有2%的提升。BAGA附加预测率为3.34%,比ZCURVE3.0(6.08%)下降接近3%。附加预测率的降低,表明其预测错误的基因数目相比ZCURVE3.0有更进一步的减少。第二部分是对于ZCURVE3.0和Prodigal两个基因预测软件联合方法(BAGA2.0)的实现,通过保留两者预测相同的基因,对不同的基因进行序列比对,调节合适的参数,保留比对得分较高的基因,将这两部分的基因作为最终联合预测的基因。BAGA2.0对应的识别率为98.73%,特异度为96.09%。这两者性能,都比ZCURVE3.0效果要好。另一方面,BAGA2.0的附加预测率为4.08%比ZCURVE3.0(6.08%)要低。综合来看,联合两者来识别细菌的基因性能要更优。此外,虽然BAGA2.0的特异度比BAGA要低,其附加预测率要大,但是其识别率和准确度却更佳。
  在本文中采用BLAST序列比对实现了对于预测的基因进行功能注释,对于系统中实现的两部分的预测结果都能够实现注释,而且能够选择快速注释和完全注释两者不同方式。同时,集成基因组岛预测程序。我们将此完善的集成软件编译成各种不同系统的版本,使用者能够访问http://cefg.cn/zcurve-visualization/下载,并免费使用。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
[硕士论文] 赵柯郁
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(the mechanistictarget of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex1(mTORC1)和mTOR complex2(mTORC2)。mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nMAZD8055处理12h,100nMAZD8055处理24h,200nMAZD8055处理12h和200nMAZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200nM处理24h组效果最显著(p<0.05); Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p<0.05); ELISA结果显示对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和258.75±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055处理24 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml和188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61 mmol/L、19.54±1.53 ng/ml和183.82±26.94 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑵利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为5.42±0.08 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和403.3±11.17 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和297.82±20.8 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑶靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml和527.99±32.67 pg/ml,Raptor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46ng/ml和331.84±48.02 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑷靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14 ng/ml和109.47±7.46 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07mg/kg; Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24mmol/L、6.93±0.14 ng/ml和55.74±6.01 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑸三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2> mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA抑制率,对TG和DHA作用 mTORC2>mTORC1,对PA作用 mTORC1>mTORC2。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[博士论文] 殷路
计算机软件与理论 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:如何快速从大规模基因表达数据中挖掘相关基因信息,实现高通量基因表达数据的精准分析,成为基因表达数据分析的关键问题。基因表达数据的双聚类分析能有效弥补传统聚类分析在搜索并确认基因局部表达模式的不足。
  本文以基因表达数据的双聚类分析为切入点,以提高双聚类体积、覆盖率、均方残差等质量评价指标和生物意义为主要目标,基于布谷鸟搜索算法,从单目标优化、多目标优化和集成学习等方面开展双聚类分析研究,解决现有双聚类分析方法存在的双聚类的质量差、多样性不足和生物意义不明显等问题。论文的主要工作包括:
  (1)提出基于布谷鸟搜索双聚类分析算法(Cuckoo Search Biclustering, CSB)。针对现有双聚类分析的低覆盖率和高均方残差等问题,该算法提出初始双聚类优化选取的策略提高解多样性,同时在搜索过程中采用服从莱维飞行的随机搜索策略解决解早熟。CSB算法可有效提高搜索范围和速度,并能稳定跳出局部最优解,同时可找到包含不同基因的双聚类,避免基因过于集中问题。与CC、FLOC、ISA、BIC-aiNet、SEBI、SAB和SSB等算法比较,实验表明CSB算法的双聚类质量和生物意义更优。
  (2)提出基于遗传算法和布谷鸟搜索的混合双聚类分析算法(Genetic Algorithm and Cuckoo Search hybrid Biclustering, GACSB)。通过引入遗传算法的锦标赛选择和精英保留等策略,GACSB算法可在计算代价不大幅增加的条件下拓展搜索范围和深度从而提高双聚类的多样性。与 CC、FLOC、ISA、SEBI、SSB和CSB等算法的对比实验表明 GACSB算法在双聚类的多样性和生物意义上有大幅提高。通过ACV、MSR和VE等指标对比分析,说明GACSB算法可搜索到不同类型的双聚类,具有较强可扩展性。
  (3)提出基于多目标布谷鸟搜索的双聚类分析算法(Multi-Objective Cuckoo Search Biclustering, MOCSB)。通过将双聚类分析转化为多目标优化问题,该算法把多目标布谷鸟搜索算法引入双聚类分析来同时优化双聚类的均方残差和体积等质量评价指标。MOCSB算法把搜索占优解集操作与布谷鸟巢搜索和宿主弃巢操作结合,可根据实际需要灵活使用各种双聚类评价指标。与 CC、SEBI、SMOB和CSB等算法比较表明MOCSB算法能提高双聚类的质量和生物意义。
  (4)提出基于谱聚类的集成双聚类分析算法(Spectral Ensemble Biclustering, SEB)。针对双聚类集成问题中双聚类的质量不高且多样性不足,一致函数计算复杂度高和双聚类结果的生物意义不明显等问题,SEB算法使用不同双聚类质量评价指标获得多个基双聚类,然后基于谱聚类的一致函数进行集成获得一致双聚类。与VC、BGPC、MMMC和COAC等算法对比分析表明SEB算法在计算效率、双聚类的质量评价指标和生物意义等方面获得提高。
[硕士论文] 张香媛
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:细胞核是真核生物特有的,最大的细胞器。染色质是遗传和表观遗传信息的载体,并且是最大的生物大分子。大约2m长的染色质被折叠进直径小于10μm的细胞核。染色体构象捕获(3C)技术以及一系列它的衍生技术(4C、5C、Hi-C)的发展促进了核结构的研究。这些技术揭示了一些蛋白如CTCF,Cohesin等在染色质折叠和相互作用中发挥重要的作用。最近发现一些lncRNAs也参与了染色质的相互作用。lncRNAs通过与DNA、蛋白质,甚至与RNA本身相互作用,参与了染色质相互作用并调控了核结构的形成,比如XIST,Firre等。因为基因组的大部分编码为ncRNA,我们猜测也许很多lncRNA参与了核结构的调控。但是直到现在,也没有任何系统的关于lncRNA参与染色质相互作用的报道。
  为了在全基因组范围内筛选可能参与染色质相互作用的lncRNAs,我们建立了一种基于Hi-C技术的高通量筛选的方法,它是通过对比RNase处理前后基因组范围的染色质相互作用来实现的。建立高质量的Hi-C文库是整个课题的关键。Hi-C技术是一个多步骤、耗时较长的分子生物学技术,需要多种试剂和仪器。这个技术还不是很成熟,到现在为止它的重复性还不是很好很稳定。通过优化复杂的Hi-C实验中最核心的步骤如交联、酶切、限制性内切酶的失活和原位连接等,我们建立了一个成熟的、稳定的Hi-C建库流程。在初始Hi-C文库进行扩增之后,将GM12878细胞的RNase处理前后的两组生物学重复Hi-C文库进行了高通量测序。在初步的生物信息学分析之后,文库的质量及生物学重复的重复性得到检验。平均来说,原始数据中大概有90%的比对率,72%的配对率。
  此外,在去除自连片段和dangling-ends后,能够获得超过96%的有效相互作用对。相关性分析显示,两组生物学重复的bincoverage和allbinpairs的相关性都极强。所有这些结果进一步证明了优化了的Hi-C建库流程是可靠并且稳定的。在获得了高质量并且高度重复性的文库后,我们进一步对照分析了RNase处理前后样品文库的结果。对比分析显示,在RNase处理之后很多相互作用减弱甚至是消失了。
  在建库过程中也发现,和RNase处理组相比,同样细胞量的正常组得到了1.58倍的初始Hi-C文库(相互作用片段)。在两组生物学重复的正常组和RNase处理组扣减后,我们选择正值前10000对差异相互作用进行下一步的分析。最后发现在RNase处理后消失或减弱的染色质相互作用位点附近存在4081个lncRNAs编码基因。GO注释显示,这4081个lncRNAs编码基因附近的基因主要和细胞膜、Pleckstrinhomology-likedomain、铵离子转运、可变剪接等生物学结构或功能相关。筛选到的这4081个lncRNAs是潜在的可能参与染色质相互作用的,这为进一步研究它们的分子机制和功能提供了一个很好的基础。
[硕士论文] 田聪慧
生物化学与分子生物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:科学研究中构建稳定表达细胞株,抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现,然而实践中常面对许多问题。因此,有必要开发单个载体实现多基因共同表达。MDCK细胞作为流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一,广泛应用于多种病毒的扩增与纯化。但是MDCK细胞贴壁依赖性强,需要表面粘附来进行增殖。因此实现MDCK细胞于悬浮培养中增殖,将简化病毒生产过程,并极大地促进流感病毒的生产规模。
  本文对多基因共稳定表达筛选载体与siat7e稳转MDCK细胞株的构建进行了研究。本研究分为两个部分:
  第一部分:IRES序列的多基因共稳定表达筛选载体构建。
  目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。
  方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。
  结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。
  结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。
  第二部分:siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株的构建。
  目的:构建表达siat7e的MDCK细胞株,用以解决MDCK细胞的悬浮培养问题。
  方法:利用PCR技术,从MDCK细胞基因组中扩增出全长1011 bp的siat7e基因,并将该基因分别克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表达载体中,三种真核表达载体转染MDCK细胞后,筛选siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株,以期实现MDCK细胞适应无血清悬浮培养。
  结果:成功构建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三种表达质粒。pBflag-siat7e重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得四个克隆,蛋白质印记和基因组PCR未见siat7e目的条带,推测可能未筛选到siat7e阳性克隆,且细胞未见明显表型。pLV-siat7e-Puro重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得MDCK耐药细胞池。基因组和转录水平PCR都证明目的基因siat7e稳定整合到MDCK细胞基因组。同样细胞未见明显表型,降低血清或者无血清培养基培养耐药性MDCK细胞,未获得适应悬浮培养的MDCK细胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重组载体,融合表达EGFP和siat7e蛋白,荧光定位siat7e蛋白。荧光倒置显微镜下观察EGFP荧光蛋白表达情况,验证siat7e基因成功转染至MDCK细胞。基因组和转录水平PCR验证,证明siat7e基因稳定整合到MDCK细胞基因组。蛋白荧光定位验证siat7e表达的唾液酸转移酶蛋白定位在内质网上。
  结论:成功构建了三种表达质粒,并成功筛选获得两种稳定表达siat7e基因的MDCK耐药细胞池,且成功验证唾液酸转移酶蛋白定位,但细胞未见明显表型。接下来,将进一步研究重组质粒转化后MDCK细胞适应悬浮培养的特性。
[硕士论文] 赵雪梅
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:移码发生在从大肠杆菌到哺乳动物的所有生物体中,移码有两种主要类型:一种是基因中非3倍数的核苷酸的插入或缺失导致核苷酸序列与相对应的氨基酸序列的正常关系发生改变,产生无功能的蛋白。另一种是编程性核糖体移码(PRF)。PRF是一种重编码现象,是指翻译中的核糖体在特定的位置从起始的0读框转换到+1或-1读框并继续翻译的过程,产生的蛋白是有功能的。研究表明,-1 PRF在病毒和细胞内基因表达中起非常重要的调控作用。+1PRF基因也陆续在细菌、酵母以及人等真核生物中被报道,之前的研究表明在纤毛类原生动物游仆虫中一些蛋白的合成需要+1PRF。
  八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是一种典型的原生动物淡水纤毛虫,实验室前期对八肋游仆虫转录组进行了分析,发现大约有11.4%的+1PRF基因,将预测的3700个+1 PRF基因进行分析鉴定,发现其中3489条+1PRF基因具有典型的游仆虫移码模体序列(5′-AAA-TAR-3′),此外还有211条是含有不同类型滑动序列的新型+1PRF基因,其中最多的滑动序列为5′-TTT-TAR-3′,有54条基因。为了进一步研究八肋游仆虫中新型的+1PRF基因的序列、移码机制以及移码对其基因功能的影响,本研究从八肋游仆虫基因库中选取了一个滑动序列为TTT-TAA-C的+1PRF基因,即ADP核糖基化因子1(ARF1)基因进行进一步的分析,获得的主要结果如下:
  1.八肋游仆虫ARF1基因的克隆与序列分析。根据预测的八肋游仆虫ARF1基因(EoARF1)序列,设计特异引物,以游仆虫基因组和cDNA为模板进行PCR扩增,得到EoARF1基因的开放阅读框序列,接着利用端粒引物扩增,最终获得 EoARF1基因全序列。利用软件对全序列进行分析,结果显示,EoARF1基因全长为984 bp,其中5’UTR长39bp,3’UTR长318 bp,基因编码区全长为565 bp,无内含子,编码区有两个开放阅读框,第一个读框编码ARF1的前109个氨基酸,而从328 bp起的第二个开放读框编码ARF1剩余的78个氨基酸。两个读框衔接处为七核苷酸滑动序列TTT-TAA-C。氨基酸序列比对分析显示EoARF1基因在移码前编码的蛋白只包含GXXXXGKT和DLGG两个保守结构域,而NKAD和CAL结构域位于移码位点之后,因此序列分析表明该基因翻译过程中只有通过一次+1移码才会产生一个包括所有结构域的完整蛋白。
  2.八肋游仆虫ARF1基因表达的分析验证。为了验证EoARF1是+1PRF基因,将EoARF1基因编码区插入到双荧光素酶报告基因中,构建了能在酵母中进行表达的重组质粒pDB722-ARF1,同时构建了阳性对照pDB722-ARF1-T和阴性对照pDB722-ARF1-S,使其通读或终止。利用双荧光素酶报告检测体系进行移码效率的测定,结果显示,pDB722-ARF1的移码效率约为5.86%,阴性对照的移码效率<0.01%。初步证明,EoARF1基因确实是在翻译过程中需要通过+1 PRF来编码合成完整的 ARF1蛋白。此外对七核苷酸滑动序列TTT-TAA-C进行突变,结果表明,滑动序列破坏之后,移码效率明显降低,证明移码发生在该区域。
  3.八肋游仆虫ARF1重组蛋白的表达纯化。为了对EoARF1的功能进行研究,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,并在大肠杆菌BL21中进行了表达,利用亲和层析和凝胶柱层析进行纯化,获得了高纯度的EoARF1蛋白,经Western blot检测为阳性。
  4.八肋游仆虫ARF1重组蛋白与嘌呤核苷酸的相互作用。利用荧光光谱法检测了 EoARF1重组蛋白与嘌呤核苷酸的相互作用。结果显示,表达纯化的 EoARF1蛋白能够与嘌呤核苷酸相互作用,且与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTP>GDP>GMP,此外EoARF1蛋白与GDP的结合强度大于与ADP的结合。进一步表明,EoARF1基因通过+1 PRF表达的蛋白具有与嘌呤核苷酸结合的活性。
  本研究首次从八肋游仆虫中克隆了ARF1基因,证实了+1 PRF候选基因EoARF1在游仆虫体内的真实存在,并且有转录产物;利用双荧光素酶报告体系,证明了EoARF1基因确实是在翻译过程中通过+1 PRF编码合成了完整的 ARF1蛋白;将EoARF1在大肠杆菌中进行了表达纯化,表达出的蛋白能够与嘌呤核苷酸相互作用,从功能上说明了EoARF1只有通过+1 PRF才能产生结构域完整的有功能的蛋白。为进一步研究游仆虫中的编程性移码机制提供了实验数据。
[硕士论文] 张宇良
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:真核生物的细胞周期通过连续激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。在哺乳动物细胞周期中,周期蛋白A和周期蛋白B通过泛素化降解途径使靶蛋白去磷酸化,促进有丝分裂中期向后期转化;周期蛋白D通过磷酸化Rb蛋白终止G1期,促进细胞G1/S期转化。
  不同的生物体包含的周期蛋白类型不同,单细胞真核生物纤毛虫表现出周期蛋白多样性,表明单细胞生物体内存在精细的调控机制。嗜热四膜虫含有1个小核和1个大核,小核为二倍体,在营养生长期转录沉默,大核为多倍体,转录活跃,营养充足时细胞进行无性生殖,饥饿条件下进行有性生殖。有性生殖过程中,小核进行减数分裂,产生4个原核,其中3个降解,另外1个原核进行有丝分裂产生配子核,配子核交换,融合产生合子核。合子核通过有丝分裂产生新的大核和新小核,完成有性生殖。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白,其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜虫小核减数分裂期特异表达,Cyc2调控了小核减数分裂的起始,而Cyc17对减数分裂后期的起始和同源染色体的分离是必需的,但是Cyc28的功能目前并不清楚。
  本研究首次从嗜热四膜虫鉴定了有性生殖特异表达的周期蛋白基因CYC28,对其功能进行了分析,主要结果如下:
  1. CYC28生物信息学分析基于四膜虫大核基因组数据库(http//:www.ciliate.org)和功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn)分析表明嗜热四膜虫 CYC28(TTHERM_00082190)基因全长1174 bp,开放阅读框801 bp,预测编码266个氨基酸。RT-PCR产物测序分析表明CYC28序列正确。序列比对分析N端有一个由121个氨基酸组成的保守性周期蛋白框,周期蛋白框后有一个由9个氨基酸残基组成的破坏框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能属于周期蛋白B3亚家族。Microarray表达谱和实时荧光定量检测结果表明CYC28在营养生殖期和饥饿期不表达,在有性生殖期特异表达,4 h时表达量最高。
  2. HA-Cyc28的细胞定位及表达分析为研究Cyc28的功能,构建带有HA标签的表达载体 pXS75-CYC28,该表达载体由MTT1启动子调控,在Cd2+诱导下高效表达,经基因枪转化,巴龙霉素浓度梯度筛选,选择稳定的细胞株。免疫荧光定位表明,Cyc28在有性生殖早期定位于细胞质,在8 h定位在凋亡的旧大核上,表明Cyc28可能通过泛素化途径,在凋亡的亲本大核中降解或者直接参与了亲本大核的凋亡。蛋白免疫印迹结果表明,HA-Cyc28在四膜虫有性生殖0 h没有表达,2 h后表达上调,在4h和8h蛋白条带变弱,可能部分发生泛素化降解,在16h配对分开后蛋白质消失。
  3.敲减CYC28对有性生殖进程无显著影响 CYC28是有性生殖期特异表达的基因,为进一步分析Cyc28在嗜热四膜虫有性生殖过程中的功能,我们首先构建了CYC28的敲除载体pNeo4-Δ-CYC28,转化不同交配型的四膜虫细胞,通过同源重组,筛选得到CYC28敲减细胞株。同野生型细胞相比,敲减株在有性生殖过程中,细胞配对,小核拉伸,小核减数分裂以及原核选择,合子核的有丝分裂都未见异常。由于未能获得CYC28完全敲除的突变体细胞株,进一步构建了CYC28的干扰质粒pCYC28hpCYH,该质粒由Cd2+调控表达。干扰质粒通过基因枪转化四膜虫,经放线菌酮抗性梯度筛选,获得不同交配型的突变体细胞株。qRT-PCR检测得到稳定的干扰株。观察四膜虫在有性生殖过程中核发育,结果表明小核发育过程未受影响,细胞配对,小核拉伸,减数分裂,配子核交换,新大核形成以及结合后的个体均正常,表明Cyc28的敲减对有性生殖的进程无显著影响。
  4.过表达Cyc28影响有性生殖期原核的有丝分裂在突变体细胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配对后,CYC28基因的转录水平比野生型提高约10倍,观察有性生殖过程,过表达Cyc28引起原核有丝分裂进程的异常。同野生型相比,在有性生殖3.5h,45.5%细胞第一次减数分裂后期出现浓缩的染色体,未见染色体解聚后的小核;在4h,36.5%的细胞停留在第一次减数分裂后期,31.5%细胞进行的第二次减数分裂,小核松散;而在6h,大多数细胞选出的小核无法进行有丝分裂;在8h,45.3%细胞中未出现新大核,在12 h,未出现发育完成的两个大核一个小核的细胞。过量的外源Cyc28导致细胞核发育异常,原核有丝分裂受阻,有性生殖未能完成。
  本研究首次鉴定了嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC28,实时荧光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特异表达。敲减CYC28不影响细胞的发育,而过表达CYC28导致细胞有性生殖过程小核有丝分裂异常,暗示它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。进一步获得CYC28的敲除株,有望揭示Cyc28在嗜热四膜虫生殖过程中具体功能,完善周期蛋白在纤毛类原生动物中的复杂调控机制。
[硕士论文] 宋娜
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)DSM16354T是一株可生长在10%的NaCl及pH9.0碱性环境中的一种中度嗜盐和嗜碱菌。中度嗜盐菌指的是在0.1%-32.5% NaCl环境中能够正常生长,代谢的微生物类群。它作为细菌耐盐碱机制的重要研究对象,基因的类别有很多且耐盐机制也很复杂。对中度嗜盐菌的耐盐碱基因资源进行挖掘,是深入研究微生物盐适应机制和开发利用微生物资源的重要前提。它与一般的非嗜盐菌相比,具有相对独特的生理生化结构、代谢途径、以及遗传学特性等。
  本研究利用基因文库与大肠杆菌(Escherichia coli)钠/氢逆向转运蛋白缺陷株KNabc(ΔnhaA、ΔnhaB、ΔchaA)功能互补相结合的方法,从Halomonas alkaliphila DSM16354T中克隆获得一个重组质粒pUC-SN11。它编码钠/氢逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)。耐盐碱实验表明,KNabc/pUC-SN11能在含0.2 M NaCl的LBK培养基中生长。并初步预测该质粒包含的序列可能编码Na+/H+逆向转运蛋白。序列分析发现pUC-SN11携带的DNA片段长5662 bp,有3个完整的阅读框(ORF)。经过比对,ORF1(1-1324 bp)与盐单胞菌属(Halomonascampaniensis)中的TRAP dicarboxylate transporter subunit DctM同源性最高可达99%。ORF2(1414-2389 bp)与盐单胞菌属(Halomonas campaniensis)中TRAP ABC transportersubstrate-binding protein同源性最高可达99%。ORF3(2833-4309 bp)与盐单胞菌属(Halomonascampaniensis)中的sodium:proton antiporter(NhaD)的同源性最高可达99%。由于ORF3编码一个单亚基的钠/氢逆向转运蛋白,因此推测起作用的阅读框是ORF3。所以本研究直接对ORF3进行亚克隆。因其来自嗜碱盐单胞菌(Halomonas alkaliphila)DSM16354T而被定名为Ha_nhaD。将Ha_NhaD与已鉴定的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白进行氨基酸序列比对,比对的蛋白分别是Ha_NhaD2(来自Halomonas sp.Y2)、Aa_NhaD(来自Alkalimonasamylolytica)、Ha_NhaD1(来自Halomonas sp.Y2)、He_NhaD(来自Halomonas elongata)、Vc_NhaD(来自Vibrio cholerae)、Vp_NhaD(来自Vibrio parahaemolyticus)、D1_NhaD(来自the metagenome of halophilic bacteria in Daban Salt Lake)和Dw_NhaD(来自the metagenomeof halophilic bacteria in Dagong Ancient Brine Well),比对结果同源性依次为91%、72%、70%、64%、60%、56%、17%和11%。
  为了证明它是否是一个新型的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白,采用邻接法构建系统发育树。此发育树包括7个最近的同系物,同源性在76%-99%之间,7个较近的同系物同源性在50%-75%之间和7个较远的同系物同源性在20%-49%之间,同时包括8个已经鉴定的钠/氢逆向转运蛋白。结果表明,它与其同系物聚在一起并形成了自己独立的分支。所以我们认为Ha_NhaD是一个新型的NhaD型钠/氢逆向转运蛋白。
  耐盐碱测试表明,含有重组质粒pUC-nhaD的大肠杆菌(E.coli) KNabc(ΔnhaA、ΔnhaB、ΔchaA)能在0.6 M NaCl、0.2 M LiCl及pH8.0的碱性环境中生长。拓扑异构学结构分析显示,Ha_NhaD含有12个TMS的跨膜蛋白,表明蛋白是一个低极性的跨膜蛋白。本研究测试了含有nhaD基因的重组质粒pUC-nhaD的大肠杆菌(E.coli) KNabc转化子的阳离子/H+逆向转运蛋白活性。结果证实了KNabc/pUC-nhaD具有Na+(Li+)/H+逆向转运活性。进一步测定了不同pH值对NhaD的阳离子/H+逆向转运蛋白活性的影响,结果显示Ha_NhaD逆向转运蛋白活性在pH6.5-9.5范围内表现出pH依赖性。为了确定Ha_NhaD对阳离子的亲和力,测定了KNabc/pUC-nhaD反转膜在最适pH条件下Ha_NhaD蛋白对Na+、Li+的K0.5值,测定结果显示NhaD蛋白的底物亲和性为:Na+>Li+。
  综上所述,Ha_nhaD基因编码一个新型的NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白。
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