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[博士论文] 吴成超
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:人类基因组计划发现,人类基因组中超过98%的区域是非编码区域。ENCODE、Roadmap epigenomics等后续计划进一步发现,非编码DNA中包含如DNA甲基化位点、启动子、增强子等众多DNA调控元件。DNA调控元件通过激活或抑制转录事件,精准地调控目标基因的表达量。一方面,这些DNA调控元件正是由于其环境序列的特异性才能够参与转录调控;另一方面,DNA序列在数学上可被视为有限字母表上的有限词,研究其复杂度特征可以挖掘DNA的序列特异性。这激发我们通过序列复杂度数学工具来量化识别DNA调控元件。本研究分为以下三部分:
  第一部分,我们详细描述两种序列复杂度的数学定义,重点研究其计算算法,并通过特征选择筛选出有效特征。首先根据不同序列长度确定因子复杂度的算法获取原始特征,随后根据二阶差分工具筛选拓扑熵特征,并最终确定因子复杂度的有效特征。同时,我们研究了abelian复杂度的数学定义和计算算法,并通过对abelian复杂度特征进行特征筛选确定出其有效特征。
  第二部分,我们应用因子复杂度有效特征构建CpG甲基化水平预测模型。我们首先获取人类胚胎细胞的甲基化实验数据,并筛选其中的CpG甲基化位点。在将位点扩增至合适长度之后,我们提取序列因子复杂度特征和序列的基本组成特征,并构建了基于支持向量机算法的CpG甲基化水平预测模型,该模型在不同染色体上的平均分类准确率为94.7%。与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后我们利用已构建的预测模型预测全基因组水平不同功能元件中的CpG甲基化平均水平,通过与实验数据的对比,进一步验证了该模型的预测能力。
  第三部分,我们应用abelian复杂度特征构建增强子预测模型。我们从FANTOM5计划的数据库中获取人类基因组的增强子数据,通过提取序列abelian复杂度特征和序列基本组成特征,构建了基于随机森林算法的增强子预测模型,其中正负样本1∶1模型的分类准确率为93.1%,正负样本1∶10模型的分类准确率为96.0%。在与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后利用该模型在人类基因组22号染色体进行步长为100bp的扫描预测,成功预测到5,123条增强子区域。以不同细胞系和组织的组蛋白修饰信号为佐证,扫描预测准确率最高可达42.8%。
  综上所述,我们通过研究序列的因子复杂度特征和abelian复杂度特征,结合基本序列组成特征,成功构建了DNA甲基化、增强子等DNA调控元件的精准预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小和降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关研究工作提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 张蕾
计算机技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:DNA测序是生物信息学的一项重要内容。从一代测序到二代测序,测序技术历经了方法和效率的巨大改变。在二代测序中,一次测序就可以获得GB级别的大规模测序数据。高通量测序产生的海量RNA-seq对数据分析技术提出了更高的要求。在分析RNA-seq数据的流程中,读段定位是分析RNA-seq数据的第一步,也是最重要的一步;读段定位直接影响着下游一系列数据分析的结果;已有大数据分析和计算技术为读段定位在运行时间和定位灵敏度上进一步提升提供了可能。以Hadoop为计算平台,本文开展了以下三个方面的研究工作:RNA-seq读段定位算法的研究;RNA-seq可变剪接识别算法的研究;RNA-seq数据分析结果的可视化。
  Hadoop作为大数据分析的主流计算平台,其计算特点可用来分析RNA-seq数据,本文设计了一个基于Hadoop的RNA-seq读段定位算法,以期提高读段定位过程运行效率,并使用种子扩展算法保证定位的灵敏度。算法主要学习了SeqMap的空位种子索引算法和mrFAST/mrsFAST的FastHASH方法,同时本文提出一个新的使种子定位到参考序列上的方法,新方法利用种子会连续定位的特点对定位规则做出了改变。实验证明:与传统读段定位工具相比,本文的基于Hadoop的读段定位算法不但可以在提升时间效率的同时,还可以保证读段定位过程的灵敏度。
  可变剪接是读段定位的下游的分析工作之一,对于以RNA-seq数据作为输入的可变剪接识别工具,往往需要依赖读段定位的结果才能进行可变剪接的识别分析,并且这些可变剪接识别工具需要依赖多个工具的支持以及注释文件才能进行识别,安装使用过程比较繁琐,能在并行环境下工作的可变剪接工具也较少,所以本文在读段定位的基础上设计了基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法,算法是根据工具SpliceMap和Tophat的思想设计而成,并提出一个新的跨越剪接位点的读段定位方法,新方法利用GT-AG剪切信号与读段种子间的规律辨别出剪接位点,进而实现跨越剪接位点的读段定位。实验证明:与ASTD可变剪接数据库相比,本文提出的基于Hadoop的RNA-seq可变剪接识别算法识别准确率可以达到50%以上,具有一定的实际应用价值。此外,基于本文算法开发的可变剪接识别工具具有使用过程简单,不依赖注释文件的优势。
  为了更加直观地展示可变剪接的识别结果,本文利用Servlet和Tomcat技术实现了可变剪接识别结果的可视化,可变剪接的识别结果可直接以网页的形式展示,参考序列上可变剪接发生的具体位置可以清晰显示,一目了然。
  读段定位的实验中,在2G以上的数据条件下,本文的读段定位算法的时间效率经过与Bowtie对比,可以提高将近40%,并且能识别出更多的读段,证明了基于Hadoop的读段定位算法可以提高时间效率并保证灵敏度。可变剪接实验中,本文算法通过与标准数据库对比,可以识别出参考序列五个可变剪接事件中的四个,准确率达到50%以上,可以证明本算法具有一定的实际应用价值。
[硕士论文] 李永飞
应用化学 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:DNA是一种携带遗传信息的生物大分子,也是一种具有超强组装能力的纳米基元。二十世纪八十年代,Nadrian C Seeman教授率先提出采用DNA分子作为组装基元构筑高级有序结构,发展了DNA纳米技术这一重要新兴领域。迄今为止已经发展了多种组装策略,主要包括DNA模块自组装(tile-base assembly)、DNA折纸术(DNA Origam(1))和单链瓦片自组装(single-strand tile)。DNA纳米自组装的发展不仅大大丰富了微纳米结构的多样性与复杂性,在分析检测、生物医学等应用领域也展现出了巨大的应用潜力。本论文主要围绕DNA自组装开展了以下两方面研究:
  1.发展基于乙二胺的“无金属离子”缓冲体系,应用于DNA自组装。DNA自组装采用缓冲溶液大多为TAE/Mg2+,即需要金属阳离子(如:Mg2+)以屏蔽来自负电荷磷酸骨架的DNA链间静电斥力。但是,在某些应用中,镁离子或者其他金属阳离子的存在可能会带来不利影响,比如:增大金属离子依赖酶对DNA自组装纳米结构的影响。为了拓展DNA自组装的应用,本章节基于乙二胺分子开发出一种新的“无金属离子”缓冲体系用于DNA自组装,具体如下:(1)在乙二胺缓冲体系中,分别基于DNA双交叉模块和三臂模块成功组装得到二维纳米阵列和三维纳米笼—DNA四面体,表明这一新的缓冲体系适用于DNA自组装;(2)研究DNA自组装结构在新缓冲体系中的生物稳定性。研究表明:在新缓冲体系中,由于缺失镁离子,DNase I对DNA自组装结构的酶降解减弱;(3)基于新缓冲体系发展通用型pH调控手段。乙二胺分子具有pH响应性质,因此,基于乙二胺,可以实现DNA四面体组装与解组装的动态可逆调控。这种不依赖于DNA序列的pH响应调控,为DNA动态体系的开发提供了新的手段与思路。
  2.开发平行交叉四臂DNA模块,并组装得到DNA一维纳米管状结构。DNA自组装模块通常采用反平行交叉结形式,为了增加设计手段以及丰富DNA自组装结构多样性,本章节基于平行交叉结形式设计出一种新型四臂DNA自组装模块,并成功组装得到一维纳米管状结构。进一步探索了模块刚性、相对翻转角度等对自组装的影响。
[硕士论文] 程爱民
结构生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:基因的表达调控是一个发生在多时空、多层次的精细调控过程,包括表观遗传水平和翻译水平。组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传调控方式之一,涉及写入器、阅读器、擦除器的相互作用。BAP1是一种重要的泛素擦除器,可以被ASXL1激活,对H2AK119ub1去泛素化,从而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的机制以及BAP1定位在染色质上的机理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一种识别H3K56ac的组蛋白乙酰化阅读器,其识别的机理、识别的环境、识别的功能也不明确。除了组蛋白翻译后修饰,核糖体RNA的加工、成熟直接关系到蛋白质翻译机器核糖体的装配,也是重要的基因表达调控方式。U3 snoRNP核心复合物对rRNA进行2'-O-methylation修饰,促进rRNA的加工和成熟。目前对真核生物的U3 snoRNP核心复合物的装配研究较少。本文从三个方面对基因表达调控过程进行探究。
  BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在细胞核的成员,自身具有较低的酶活。ASXL1的DEUBAD结构域能够激活BAP1,并与BAP1形成PreDUB复合物对H2AK 119ub1去泛素化。我们在大肠杆菌中尝试多种方法成功表达和纯化了BAP1与ASXL1 DEUBAD结构域的复合物,生长的晶体最高衍射分辨率为2.6埃。我们发现BAP1单独存在时趋向于寡聚状态,而被ASXL1DEUBAD结构域激活后会形成稳定的异源二聚体,与报道的胞内研究结果一致。此外,我们用GST pull-down实验发现BAP1通过CTE结合在完整的核小体上,但不能作用于核小体酸性区、核小体DNA及游离的组蛋白,解释了BAP1/ASXL1复合物定位在染色质的机制。
  U3 snoRNA属于box C/D snoRNA,起引导核糖体RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58组成,其中fibrillarin是RNA甲基转移酶。复合物装配起始于snu 13与U3的box B/C、boxC/D,然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我们克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58,并表达纯化了snu13和fibrillarin。通过体外转录U3、box B/C和box C/D,用EMSA实验证实了snu13与U3的相互作用。snu13结合在U3的box B/C,亲和力为2.2μM,暗示snu 13还需要结合boxC/D以提高亲和力。此前有研究报道boxB/C自身为环(loop)结构,与snu13结合才能形成扭结(Kink-turn,K-turn)结构。我们利用RNA imino氢特殊的化学位移,发现在溶液状态下U3 box B/C也能形成K-turn结构。结合以前的研究,我们认为snu13通过构象选择机制而不是构象变化来结合U3 box B/C。
  H3K56ac是一个位于核小体核心区的乙酰化修饰,在转录、DNA复制、DNA损伤修复等过程发挥重要作用,而根据报道,CREBBP bromodomain可能是H3K56ac的阅读器,但作用机理不清楚。与徐莉同学合作,我们解析了CREBBP bromodomain与H3K56ac复合物的晶体结构。晶体结构表明,CREBBP bromodomain识别H3K56ac的方式类似于其他bromodomain与乙酰化赖氨酸的相互作用,都是通过一个疏水口袋、水介导的氢键网络和保守的天冬酰胺结合赖氨酸乙酰化侧链。有意思的是,H3αN在核小体上形成α-helix,而在CREBBP bromodomain中为伸展状态。GST pull-down实验发现,CREBBP bromodomain不能结合H3K56乙酰化的重组核小体,但是能识别H3/H4 dimer上的H3K56ac,证明了伸展状态的H3αN的确存在,与之前报道的H3/H4 tetramer上H3αN构象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明显促进HAT结构域乙酰化H3K56。根据上述研究结果,我们提出,CREBBP bromodomain从HAT活性中心捕获H3K56乙酰化的H3/H4 dimer,促进HAT进行下一轮H3K56乙酰化,随后H3K56乙酰化的H3/H4在CAF1的帮助下参与核小体组装。
[硕士论文] 蒋蓉
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:观察自噬水平改变对新生和成年小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖和分化能力的影响,明确激活自噬对成体NSCs功能维持的保护作用,探讨维持干细胞活力的有效途径。
  方法:⑴分离培养新生(Postnatal day0,P0)小鼠室管膜下区(subventricularzone,SVZ) NSCs,应用自噬抑制剂Ly294002干预P0 NSCs,LC3免疫荧光染色观察细胞中自噬小体的变化,并且通过BrdU掺入实验检测抑制自噬对P0 NSCs增殖能力的影响。用分化培养基诱导P0 NSCs分化,western blot检测自噬相关蛋白LC3II和p62在NSCs分化过程中的表达变化。应用Ly294002作用于分化的P0 NSCs,Tuj1免疫荧光染色检测早期神经元标记物的表达变化。⑵分离培养成年(Postnatal days90,P90)小鼠SVZ区 NSCs,应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,采用LC3免疫荧光染色检测自噬水平。随后通过BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色分析激活自噬对P90 NSCs增殖和分化能力的影响。⑶成年小鼠腹腔注射自噬激活剂Rapamycin(4mg/kg),隔日一次,共14天,提取SVZ蛋白检测Rapamycin靶蛋白mTOR的磷酸化水平。同时制备脑片通过Ki67和DCX免疫荧光染色观察激活自噬对成年小鼠SVZ区NSCs增殖和分化能力的影响。
  结果:①应用自噬抑制剂Ly294002作用于P0 NSCs3d,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体明显减少,提示Ly294002能够抑制P0 NSCs自噬发生,但免疫荧光染色显示Ly294002组与DMSO组BrdU阳性率无显著差异。P0 NSCs分化后LC3II的蛋白含量较分化前升高1.0±0.4倍(p<0.05),p62的蛋白含量较未分化组降低了0.5±0.1倍(p<0.01),表明自噬参与调控 NSCs的分化过程。应用5μM和10μM Ly294002作用于P0 NSCs,降低细胞自噬水平后,则Ly294002组Tuj1的阳性率分别较对照组显著降低了0.6和0.7倍(p<0.01),提示降低自噬水平,抑制P0 NSCs向神经元方向分化。②应用自噬激活剂Rapamycin作用于P90 NSCs,LC3免疫荧光染色结果显示NSCs中自噬小体增加,提示Rapamycin提高P90 NSCs的自噬水平,并且免疫荧光染色显示Rapamycin组BrdU阳性率分别为25.4%±6.0%和26.2%±6.7%较对照组12.0%±0.8%明显升高(p<0.05),表明激活自噬可以促进P90 NSCs增殖。应用20nM和50nM Rapamycin作用于P90 NSCs,NSCs诱导分化3d后,则Rapamycin组Tuj1的阳性率分别较对照组升高了1.5倍和1.3倍,(p<0.01),提示提高自噬水平,促进P90 NSCs向神经元方向分化。③成年小鼠腹腔注射Rapamycin,Rapamycin组mTOR的磷酸化水平较对照组降低了34.0%±8.6%(p<0.01),表明腹腔注射Rapamycin后能够抑制mTOR激活自噬,免疫荧光染色显示,Rapamycin组Ki67阳性细胞数为98.9±8.1较DMSO组61.15±8.56明显升高(p<0.05),早期神经元标记物DCX阳性数是对照组的1.5倍(p<0.01),表明提高成年小鼠脑内SVZ区的自噬水平,可以提高NSCs增殖和分化潜能。
  结论:自噬参与小鼠NSCs功能维持,改变自噬水平能够影响NSCs的增殖和分化。应用自噬激活剂能够有效提高成年小鼠NSCs的活力,促进神经发生。
[硕士论文] 胡双双
生物医学工程 安徽理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究江苏十个地区小家鼠的基因多样性和遗传进化关系,为国境口岸鼠形动物遗传进化规律和溯源的研究提供了确凿的技术支持,并为物种种内基因差异比较分析提供了重要的实验数据。通过生物信息学分析探索小家鼠种内差异与地理位置之间关系。
  方法:基于对江苏十个地区线粒体控制区基因和线粒体全基因组的研究,通过基因的扩增、测序和比对,研究小家鼠线粒体组成,结合GenBank的小家鼠线粒体基因组信息,对小家鼠进行遗传多态性分析和系统发育树研究。
  结果:获得小家鼠的线粒体控制区序列和线粒体全基因组序列,小家鼠线粒体基因组全长16,302 bp,由13种蛋白质编码基因、2种rRNA基因、22种tRNA基因、1个轻链复制起始区和1个控制区组成。经生物信息学分析发现小家鼠线粒体基因多态性丰富,其遗传进化规律域地理位置有一定的联系,不同地区小家鼠之间的分化程度大于同一地区小家鼠之间的分化程度。
  结论:小家鼠的种内差异程度与个体所处地理位置有很大的联系,我国的小家鼠大致可以长江为界限进行划分。江苏地区的小家鼠也显现出这种规律但并不明显。
[硕士论文] 欧阳杉
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究用含20%PEG6000的MS液体培养基模拟生理脱冰胁迫处理扁蓿豆幼苗,以上述胁迫处理6h的扁蓿豆幼苗叶片总RNA为模板进行反转录,运用RACE技术和RT-PCR方法,克隆得到扁蓿豆抗逆相关RNA剪切因子MrSKIP基因cDNA全长。序列分析结果显示,MrSKIP基因cDNA全长为2280bp,含有一个1833bp的完整开放阅读框,序列推测编码610个氨基酸含一条S-N-W-K-N的多肽,分子量为68.86145 KDa,等电点为8.95,生物信息学分析表明MrSKIP含有该家族的典型结构域SNW SKIP。进一步克隆得到了扁蓿豆基因组的MrSKIP基因,序列分析表明,该基因无内含子。
  利用tasiRNA技术和发根农杆菌转化法,在截形苜蓿108R根部干扰MrSKIP同源基因的表达,对转化外源基因的截型苜蓿根系进行干旱、高盐和低温胁迫处理,鉴定MrSKIP基因的功能,结果显示胁迫处理下干扰MrSKIP同源基因的的转基因根系样品,其根长和根鲜重均显著小于对照。研究结果初步表明MrSKIP基因表达量的降低影响植物对干旱、低温和高盐胁迫的耐受性,特别对干旱胁迫耐受性的降低尤为显著。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 袁亚洲
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:基因识别是对DNA序列进行分析,获取其中重要信息的第一步。目前测序技术的发展使得测序数据呈爆发式增涨,然而实验方法无法快速有效的从海量信息中获取知识,基于此运用计算机技术来识别基因的方法应运而生。在2015年,我们课题组研发了原核生物基因识别程序ZCURVE3.0,该算法是基于Z曲线理论,采用新的机器学习算法SVM,增加新的特征变量,并且对内部参数进行进一步的优化,使得该识别算法更加快速准确高效。在预测出基因后,还需要知道其相应编码的蛋白质,于是我们基于ZCURVE3.0算法,对其进行进一步的升级,添加相关的功能,使得其成为完善的可视化集成系统。
  在本基因识别可视化系统中,第一部分是对ZCUREV3.0的功能进行可视化(BAGA)实现,其保留了相应识别算法的所有功能。在通过对50个原核生物的全基因组进行测试,选取比对阈值,排除伪基因,同时使得删除的正确基因数尽可能少,那样基本保持正确的基因数不变。在与GenBank提供的总的基因数相比,BAGA的预测基因识别率为97.60%,预测结果的特异度为96.74%,与ZCURVE3.0的特异度94.21%相比有2%的提升。BAGA附加预测率为3.34%,比ZCURVE3.0(6.08%)下降接近3%。附加预测率的降低,表明其预测错误的基因数目相比ZCURVE3.0有更进一步的减少。第二部分是对于ZCURVE3.0和Prodigal两个基因预测软件联合方法(BAGA2.0)的实现,通过保留两者预测相同的基因,对不同的基因进行序列比对,调节合适的参数,保留比对得分较高的基因,将这两部分的基因作为最终联合预测的基因。BAGA2.0对应的识别率为98.73%,特异度为96.09%。这两者性能,都比ZCURVE3.0效果要好。另一方面,BAGA2.0的附加预测率为4.08%比ZCURVE3.0(6.08%)要低。综合来看,联合两者来识别细菌的基因性能要更优。此外,虽然BAGA2.0的特异度比BAGA要低,其附加预测率要大,但是其识别率和准确度却更佳。
  在本文中采用BLAST序列比对实现了对于预测的基因进行功能注释,对于系统中实现的两部分的预测结果都能够实现注释,而且能够选择快速注释和完全注释两者不同方式。同时,集成基因组岛预测程序。我们将此完善的集成软件编译成各种不同系统的版本,使用者能够访问http://cefg.cn/zcurve-visualization/下载,并免费使用。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
[硕士论文] 赵柯郁
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(the mechanistictarget of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex1(mTORC1)和mTOR complex2(mTORC2)。mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nMAZD8055处理12h,100nMAZD8055处理24h,200nMAZD8055处理12h和200nMAZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200nM处理24h组效果最显著(p<0.05); Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p<0.05); ELISA结果显示对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和258.75±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055处理24 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml和188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61 mmol/L、19.54±1.53 ng/ml和183.82±26.94 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑵利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为5.42±0.08 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和403.3±11.17 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和297.82±20.8 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑶靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml和527.99±32.67 pg/ml,Raptor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46ng/ml和331.84±48.02 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑷靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14 ng/ml和109.47±7.46 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07mg/kg; Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24mmol/L、6.93±0.14 ng/ml和55.74±6.01 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑸三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2> mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA抑制率,对TG和DHA作用 mTORC2>mTORC1,对PA作用 mTORC1>mTORC2。
[硕士论文] 杨峰
水产学、水产养殖学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:在目前集约化水产养殖模式下,草鱼(Ctenopharyngodon idella)作为我国产量最大的经济鱼类,在实际养殖过程中,特别容易出现肝脏脂肪过度蓄积进而导致脂质代谢紊乱等症状,免疫力也下降,严重者则表现为脂肪肝。因此,如何提高鱼类肝脏对脂肪利用能力及肝脂质蓄积调控的研究已显得非常迫切和必要。近年来,关于microRNA(miRNA)的研究越来越深入。研究显示miRNA参与陆上动物的胆固醇、甘油三酯和脂肪酸代谢等,因而在脂质代谢调控中发挥重要作用。目前,有关miRNA调控鱼类脂质代谢的研究还不深入,相关机理还不明晰。本研究主要以草鱼和草鱼肝细胞系(L8824)为实验材料,采用基因克隆、基因过表达及干扰、qRT-PCR、酶活性测定及腹腔注射等营养学、生物化学、分子生物学和细胞生物学相关技术与方法,在活体与细胞水平上较系统地研究了miR-33/122调控草鱼肝脏脂质代谢的作用及初步机理。研究结果为丰富鱼类脂质代谢调控机理提供了基础资料,为防治鱼类营养性脂肪肝等代谢性疾病及提高机体免疫力提供了思路及理论基础,进而为促进鱼类健康生长提供了科学依据。
  本研究主要内容包括:⑴采用RT-PCR技术,克隆了miR-33的前体序列,并进行了同源性比对和组织分布规律分析。结果显示,miR-33的前体长度为65bp,和其它物种的同源性较高;构建系统进化发育树也显示草鱼miR-33和鱼类miR-33的进化关系最近;组织分布规律显示在脑、眼睛、肝脏、肌肉和肠道中表达量较高,而在肾脏、脾脏、心脏和脂肪中的表达量较低。⑵采用miR-33 mimic(miR-33模拟物)转染草鱼肝细胞L8824的方法,开展了miR-33的功能研究。实验设置三个组,空白对照组、阴性对照组和miR-33 mimic转染组,处理24h后收集细胞。采用油红O染色提取法检测了L8824细胞中甘油三酯(TG)含量,qRT-PCR技术检测了与脂质代谢相关基因的mRNA表达水平。结果显示,相对于空白对照组和阴性对照组,miR-33 mimic转染细胞24h使miR-33超表达后,显著增加了细胞中TG含量(P<0.05),且和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著增加(P<0.05)。为进一步验证miR-33在肝脂质代谢中的功能,本研究亦在活体水平上进行了腹腔注射miR-33 antagomir(miR-33拮抗剂)实验。实验共设置三个组,空白对照组,注射0.65%生理盐水组和注射miR-33 antagomir组(12.5 nmol/尾.次)。实验采用连续注射的方法,即在每天上午9:00注射1次,连续注射3天。在实验进行的第4天上午9:00进行取样。实验采用全自动生化分析仪对草鱼血清相关生化指标进行了分析,qRT-PCR技术对脂质代谢和免疫相关基因转录水平进行了检测。结果显示,注射miR-33 antagomir组比空白对照组和生理盐水组血液中的总胆固醇和甘油三酯含量显著减少(P<0.05);进一步在基因转录水平的研究发现,和脂质合成有关的转录因子(PPARγ,SREBP-1c)的表达水平显著降低(P<0.05);和免疫有关的促炎因子(TNFα,IL-1β,IL-6和NF-κB)水平降低(P<0.05),而抗炎因子(TGF-β1和IL-10)的表达量升高(P<0.05)。以上结果表明miR-33通过调节脂代谢相关基因和免疫相关因子等的表达在草鱼肝脏脂肪代谢紊乱引起的脂肪肝(炎)过程中发挥重要作用。这一工作也是国际上对鱼类miR-33调节脂质代谢机制的首次阐述。⑶采用和miR-33实验相同的方法,本节实验首先获得了miR-122前体基因序列。结果显示,miR-122前体序列长度为99bp。和其它物种的同源性较高,说明miR-122具有很高的保守性;系统进化关系分析也显示草鱼miR-122和斑马鱼miR-122的进化关系最近;而组织分布规律则说明miR-122仅在草鱼肝脏中特异性高表达,而在其它组织中尚未检测到其表达。采用在肝细胞L8824中转染miR-122agomir(miR-122激动剂)方法来研究miR-122的功能。实验分组、实验时间及实验方法等都和miR-33的实验相同。结果显示,和空白对照组及阴性对照组相比,转染miR-122激动剂后,miR-122在L8824细胞中的相对含量明显增加(P<0.05),TG含量显著升高(P<0.05),表明超表达miR-122后促进了脂肪的合成。进一步检测发现,与脂质合成有关mRNA的表达水平也显著增加(FAS,ACC,PPARγ);为进一步研究miR-122的功能,本节研究在活体水平也开展了腹腔注射实验。分组及注射时间和miR-33的实验相同,只是注射剂量变为了5 nmol。结果显示,注射miR-122激动剂后,草鱼肝脏中miR-122的含量明显增加(P<0.05);进一步在基因表达水平的研究显示,注射miR-122 agomirs后,PPARγ,SREBP-1c,ACC,FAS和H-FABP等和脂质合成有关mRNA的表达量显著升高(P<0.05),说明miR-122促进脂肪合成的作用是通过调节脂肪合成基因进行的;检测免疫有关基因的转录水平发现,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的相对表达量出现显著地升高(P<0.05),而抗炎因子IL-10和TGF-β1的相对丰度则明显降低(P<0.05),表明miR-122在促进肝脏脂肪过量增加的基础上可能进一步降低了其免疫力。⑷开展了GSPE对肝脏脂质代谢及miR-33/122影响的实验。在细胞水平研究GSPE对肝脏脂质代谢调控的作用及对相关基因和miR-33/122表达的影响;在活体水平上进一步验证GSPE的上述作用。在细胞水平上,首先利用不同浓度的油酸构建草鱼脂肪肝细胞模型。然后设置两个实验组,即添加GSPE组和未添加GSPE组。取样的时间设置为0h、1h和3h。实验结束后检测细胞中脂肪含量的变化、miR-33/122的表达水平以及脂质代谢合成相关基因的mRNA水平。在活体水平上,一共分三组,即空白对照组,灌喂生理盐水组和灌喂GSPE组(250mg/Kg),分别在0h、1h和3h取样。检测血清生理生化指标、miR-33和miR-122的表达变化、脂质代谢和免疫相关基因mRNA表达水平的变化。结果显示,添加GSPE后不论在活体还是细胞水平TG含量都显著降低(P<0.05),miR-33和miR-122的表达水平也都受到抑制(P<0.05);检测脂代谢相关基因的表达水平发现,灌喂GSPE1h时,脂肪分解相关的基因(CPT-1,ATGL及PPARα)表达量显著升高(P<0.05),而脂合成及转运相关的基因PPARγ及H-FABP表达则显著降低(P<0.05);当灌喂GSPE3h时,更多脂肪合成基因的表达受到抑制(SREBP-1c,PPARγ,ACC,FAS和H-FABP);对免疫相关基因mRNA表达的检测发现,在脂肪肝细胞中添加GSPE1h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κB的表达量都显著下降(P<0.05),而抑炎因子IL-10和TGF-β1的表达显著上升(P<0.05),表明GSPE能够通过调节脂肪肝细胞相关免疫基因的表达而提高机体免疫力的作用,且这种作用是快速和短暂的,因为在添加GSPE3h时,促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β和NF-κ3以及抑制炎症因子的表达水平都发生了反转。而在活体水平上,GSPE在灌喂1h时除显著降低促炎因子IL-1β外,对免疫相关的其他基因没有显著性影响;而在灌喂3h时,则显著降低了促炎因子TNFα,IL-6,IL-1β的转录水平(P<0.05),而抑制炎症的因子IL-10显著上升(P<0.05),表明GSPE在活体水平需要较长的时间才能发挥作用,也可能是因为机体内慢性代偿反应的缘故。结果表明, GSPE能改善鱼类的肝脂肪代谢紊乱症状,这可能和GSPE能抑制miR-33和miR-122的表达进而调节一系列脂代谢和免疫相关基因有关。研究结果为在生产实践中改善饲料配方进而预防脂肪肝(炎)等代谢性疾病提供了理论基础。
[博士论文] 唐友
农业工程;农业电气化与自动化 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:全基因组选择GS(Genomic Selection)也叫基因组预测GP(Genomic Prediction)是一种用于计算基因组育种值GEBV(Genomic Estimated Breeding Value)的方法,估算精准育种值需要检测覆盖所有全基因组水平遗传标记假设,然后对其个体进行评估。当前全基因组选择的方法非常多,如基于贝叶斯模型的方法(BayesianA、B、C、lasso等),还有基于最佳线性无偏预测BLUP(Best Linear Unbiased Prediction)模型的方法(gBLUP,rrBLUP等)。每种预测方法计算原理不同,对于表型性状预测效果有很大差别,所以预测选择适合的方法是提高最大精准值Accuracy最好的途径,其基因组育种值是作为育种家育种的重要参考。
  本文研发了一个新基因组选择方法mMAP(Mining the Maximum Accuracy ofPrediction)是将当前流行的基因组选择方法建立方法库,然后去预测运算大量不同的物种性状,采用交叉验证得到精准值,形成具有参考价值的知识库。新的物种性状根据知识库采用挖掘技术去选择最优GS方法在预测GEBV中指导育种分析。现在知识库里面有三百多种物种性状测得精准值,并不断有GS方法加入到方法库,再将预测新物种性状精准值累积到知识库中。mMAP方法具体研究实现过程及效果:
  (1)对于新物种性状预测,通过引入数据挖掘技术应用到基因组方法的选择上,将聚类分析处理知识库与多种流行的基因组预测方法相结合,目的是应用最少的基因组预测方法算出预测精准值最高。根据提供的三组知识库数据,真实预测累积数据、两组模拟知识库数据之间分别符合正态分布和随机分布,分别在92.27%、93.40%和90.2%以上找到该表型对应GS方法预测精准值的最高。
  (2)预测精准值运算采用统计学中交叉验证(Cross validation)提高验证精准值的效率。验证设计采用随机分5组,以80%已知表型数据作为训练群体,预测20%未知表型数据,然后重复100次以上验证去预测精准值基本上覆盖了所有假设,将其误差降到最低。也将交叉验证分组进行不同设置扩展实验,如3、5、10、20等,再重复100次以上其Accuracy接近稳定。
  (3)确定新表型性状选择GS方法的最佳时机,本研究设计了聚类中心最远、最近收敛方法去检验找到新预测表型最适合的GS方法。通过实验设置初始聚类分组重复100次以上使得初始知识库处理聚类核心比较稳定,然后在收敛时根据距离每组聚类核心最近位置值和最远边缘值查找,使得最新GS方法预测Accuracy将其临时组合到知识库,然后迭代收敛检验直到连续两次内没有新GS方法产生,避免了偶然性。通过真实数据检验对于新性状查找大概迭代3次左右即可找到最佳方法,迭代本身时间仅几秒钟。
  (4)每种GS方法都有独立的实现包,只需要将聚类产生的新GS方法和物种性状传到包里进行预测。而且各个包之间相对独立,通过主线程对聚类结果进行分别调用,其结果不会相互影响,经过比对结果,继续收敛。通过独立包的设计达到方法执行相对独立,保证数据安全和缩短运行时间。
  (5)采用面向对象技术实现mMAP研发,可以通过多线程实现独立包调用。通过引入操作系统底层封装技术Docker,直接调用Linux服务封装简化操作系统内核形成Docker容器,实现多线程应用。将容器封装到WEB环境,通过B/S操作访问模式,提供服务为育种家随时随地进行运算,结果会自动生成分析报告和育种值。该平台已经可以远程应用,并在2017年1月PAG(The Plant and Animal Genome)大会上进行了展示。
  (6)提供给mMAP运算的基因型数据可以是已发表公共的数据,也可以由原始测序数据转换得到。因此高通量测序数据转换基因型数据作为输入接口,整合到mMAP计算平台中构建一个完整体系,目的是可以降低原始数据存储空间、缩短转换时间以及高效服务育种业务。目前高通量测序原始数据(fastq格式)比对参考基因组序列(fasta格式),通过bowtie、samTool、GATK等工具进行数据转换、calling SNPs等操作,然后再变换成可用的基因型文件如Hapmap、Numeric Genotype等格式为后续分析服务。但是高通量测序原始数据太大,转换时间太长,整个处理过程占用大量资源。
  针对运行时间和占据空间问题,本研究设计了一个基因型数据处理管道,目的是提高效率,主要涉及算法技术和效果:HDF5数据格式替代fasta作为参考基因组,占空间小,比对速度较快;由于处理过程中大量的中间数据产生影响其效率,本研究设计一种高效双索引文件格式来存储差异基因位点数据,根据差异数量减少中间文件占用空间;由于生成SNP及基因文件都占据大量空间,引入gZIP压缩方法,能将大型基因数据文件压缩到50倍以上,而且编写方法直接调用压缩数据和还原的SNP数据,其操作与源数据效果相同。为了提高调用及转换基因型数据过程效率,对于变换基因型数据存储形式采用压缩格式,并提供很多灵活的操作接口,方便后续分析统计。整个管道采用面向对象技术研发,实现并行处理,并提供数据接口服务与mMAP整合在一起。
  通过mMAP方法预测很多物种性状,根据设置的条件可以找到最优合适的GS方法,并调用生成育种值,为育种家提供直接帮助。通过管道研究,能够完成大批高通量原始测序数据的转换,引入并行运算和相关技术可以完成基因大数据处理模式,并对遗传领域后期数据分析(如全基因组关联分析GWAS和GS)提供基础服务。
[硕士论文] 何玉晓
生物学、动物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:臭蛙属(Odorrana)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae),是一类生活在山涧溪流中的两栖动物,全球已知58种,中国有36种,分布范围遍及中国秦岭以南、琉球群岛、印度东北部和东南亚地区,为亚洲特有。臭蛙属是蛙科动物中从真蛙类向水蛙类进化的重要过渡类群,重建其系统发育关系及起源和扩散历史一直是两栖类系统发育研究的热点,然而由于前期研究依据的物种数量有限、分子标记较少,臭蛙属在蛙科中的分类地位、属内物种组成、种组划分及系统发育关系存在广泛争议。本研究通过广泛野外考察和数据收集,获得臭蛙属86%样本,基于线粒体12S、16SrRNA基因和16个核基因及16053 bp大数据,运用贝叶斯法(BI法)、最大似然法(ML法)、松散分子钟模型、RASP软件S-DIVA和BBM模型,重建臭蛙属的系统发育关系、探讨臭蛙属地理分布格局、揭示其起源、分化、扩散机制。
  本研究主要内容包括:⑴臭蛙属为高支持率的单系群,分为8个支系(即A-H支系)。⑵荔浦臭蛙最早从臭蛙属中分化,为A支系。⑶沙巴臭蛙和越北臭蛙聚为一支,为B支系。⑷构成C支系的13个臭蛙属物种主要分布于云贵高原。龙胜臭蛙、宜章臭蛙和安龙臭蛙聚成的C1支和云南臭蛙种组构成的C2支,前者在臭蛙属中的地位不稳定,基于核基因序列C1支与广义花臭蛙种组形成姊妹群关系。⑸来自琉球群岛的石川臭蛙镶嵌在臭蛙属内,形成独立的一支D,但在臭蛙属内的位置未很好解决。⑹广泛分布于秦岭-大巴山-巫山一线和东南丘陵的广义花臭蛙种组与海南臭蛙、滇南臭蛙、封开臭蛙等构成高支持率的支系E,支系内物种间的关系尚未解决。⑺圆斑臭蛙、墨脱臭蛙镶嵌在广义大绿臭蛙复合体内,形成高支持率的F支系;大绿臭蛙复合体广布于横断山区、秦岭-大巴山、东南丘陵及中南半岛。⑻凹耳臭蛙与竹叶臭蛙种组聚为一支,构成高支持率的东南丘陵支系(G支系)。⑼除了石川臭蛙,分布于琉球群岛的臭蛙与台湾的台岛臭蛙和棕背臭蛙形成高支持率的岛屿物种支系(H支系)。⑽臭蛙属起源于约21.62 Ma B.P.(中新世早期),从19.25~8.69 Ma B.P.(中新世中期和后期)发生了快速分化,A支到H支依次形成。⑾各支系内部物种的分化事件主要发生在第四纪更新世以后(2.6 Ma),占本研究50个臭蛙物种的60%;物种分化主要发生在云贵高原(10个)、其次在东南丘陵(9个),台湾和琉球群岛的7个臭蛙中的5个物种在2.6~1.6 Ma B.P.分化。⑿臭蛙属分为8个支系。⒀臭蛙属起源于新近纪中新世早期,自中新世中期至后期8个支系依次分化,在更新世臭蛙属物种经历了一个快速成种和分化时期。⒁云贵高原是臭蛙属的起源中心,受青藏高原持续隆升的影响,向东南丘陵、台湾和琉球群岛扩散;横断山的形成,为臭蛙向北扩散至喜马拉雅南缘、秦岭-大巴山-巫山一线,向南扩散至中南半岛建立了通道。⒂青藏高原隆起、第四纪冰期与间冰期气候波动及冰期避难所的形成,导致更新世臭蛙属物种快速分化。
[硕士论文] 乔菊霞
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在真核细胞中,染色质是由DNA,组蛋白,非组蛋白以及少量的RNA组成的。染色质的基本单位是核小体。核小体是由146 bp的左手超螺旋DNA缠绕着组蛋白八聚体组成的。组蛋白八聚体是由进化上比较保守的核心组蛋白H2A,H2B,H3, H4各两个单体构成。连接组蛋白则可以将DNA锁定在核小体上。在不同生物中,连接组蛋白在进化上不保守,在维持基因组的稳定性,特定基因的转录调控,染色质重塑,以及DNA损伤修复等方面发挥着重要的作用。
  嗜热四膜虫(Tetrahymean thermophila)具有传统纤毛虫特异的大核和小核的细胞双核体系。大核和小核中具有结构不同的组蛋白H1。小核特异组蛋白MLH1(micronuclear linker histone)在生长期表达量低,而在有性生殖时期表达水平显著提高,然而其具体的生物学功能并不清楚。本研究对Mlh1在四膜虫中的功能进行了系统分析研究,获得主要结果如下:
  1. MLH1基因的生物信息学分析 MLH1(TTHERM_00471820)在四膜虫大核基因组中无内含子序列,开放阅读框1902 bp,编码633个氨基酸。含有21.5%的赖氨酸和23.1%的丝氨酸。序列中含有一个较为保守的HMG-box结构域(93-158aa),该结构域属于 II/III类的 HMG-box超家族。与四膜虫高迁移率族蛋白 HmgB3(TTHERM_00155590)的HMG-box有35%的一致性。MLH1在营养生长期和饥饿前期有较低的表达,饥饿后期几乎不表达,而在有性生殖时期表达水平显著提高,有性生殖时期6h达到最高。
  2. Mlh1在不同发育阶段的定位 Mlh1在生长发育的不同时期会水解成不同的片段α,β,γ,δ。分别构建了含HA-tag和Flag-tag的pXS75-MLH1、pXS75-MLH1-α、pXS75-MLH1-β、pXS75-MLH1-γ、 pXS75-MLH1-δ载体,转化嗜热四膜虫细胞中,利用巴龙霉素抗性筛选出突变株。免疫荧光定位分析表明,在营养生长期 HA-Mlh1定位在小核上,而HA-α,HA-β,HA-γ,HA-δ定位在胞质中,表明全长Mlh1对于小核连接组蛋白的入核是必须的。营养生长期HA-Mlh1定位在小核上,而Mlh1-Flag没有定位在小核上,表明全长 Mlh1入核后很快发生了水解。在有性生殖早期, HA-Mlh1定位在小核上,且定位信号不断扩大,定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期,HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。在小核完成第二次减数分裂后,HA-Mlh1定位信号消失。结果表明,Mlh1参与减数分裂小核的拉伸。
  3. MLH1的过表达导致四膜虫异常的有性生殖0.15μg/ml的Cd2+诱导生长期突变株2 h,通过DAPI染细胞核DNA,显微镜下进行突变株有性生殖时期核发育观察,发现突变株在有性生殖期间出现无规则的小核和松散的染色质,突变株不能完成有性生殖。核发育概率统计显示,MLH1的过表达抑制了合子核的形成和发育,减数分裂后形成的配子大部分凋亡,少部分能发育到anlagen时期,之后配对细胞分开。
  4. MLH1的敲除影响四膜虫的有性生殖构建敲除载体pBsr-MLH1后,基因枪转化入四膜虫细胞内,通过杀稻温菌素梯度浓度筛选得到稳定突变株ΔMLH1。缺对PCR检测结果表明突变株存在小核染色体的丢失。核发育概率统计和γ-H2A.X定位信号结果显示,突变株在第二次减数分裂后,选择核不能完成DNA断裂修复,之后配子凋亡。结果暗示,MLH1的缺失会影响选择核的DNA断裂修复,进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。Mlh1可能和DNA损伤修复相关。
  5. MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿通过四膜虫功能基因组数据库分析,发现MLH1和高迁移率蛋白HMGB3有着相似的表达图谱。此外,Mlh1和HmgB3有着相似的一级氨基酸序列结构特性。RT-qPCR分析,发现在ΔMLH1细胞中,HMGB3的表达水平较野生型细胞有了明显的提高;在ΔHMGB3细胞中,MLH1的表达量也较野生型细胞有了明显的提升。 MLH1和HMGB3的双敲除突变株对MMS较为敏感,且有性生殖缺陷比 MLH1的单敲除细胞株表型严重。以上结果表明 MLH1和HMGB3可能存在功能上的补偿作用。
  本研究首次对MLH1在四膜虫有性生殖时期的定位和功能进行了系统分析;有性生殖早期,HA-Mlh1定位在小核上,且定位信号不断扩大,定位模式类似于纺锤体结构。在Crescent时期,HA-Mlh1可以与α-tubulin共定位于小核上。MLH1的过表达不仅抑制了合子核的形成和发育,还形成了无规则的小核以及松散的染色质。MLH1的敲除会影响选择核的DNA断裂修复,进而影响合子核的发育及后期的有性生殖进程。此外,组蛋白MLH1和高迁移率蛋白HMGB3可能存在功能冗余性。连接组蛋白Mlh1的正常表达对四膜虫细胞核的稳定性和有性生殖进程是必需的。
[硕士论文] 杨燕芳
微生物学 广西大学 2017(学位年度)
摘要:枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,广泛应用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的工业化生产,是重要的工业菌种。枯草芽孢杆菌具有分泌蛋白能力强、非致病性、同时易于分离培养,遗传背景较清晰等特点,在基因工程是一种表达和分泌外源蛋白的理想宿主。实践表明目前枯草芽孢杆菌的载体系统常用的启动子不能满足越来越多外源基因表达的要求,因此筛选新型强启动子或者通过改造启动子以期实现外源基因的高效表达。
  利用本研究所构建的探针型质粒载体PUC-kana直接在大肠杆菌中筛选启动子,并获得了具有启动子活力的PK3片段,以麦芽糖α-淀粉酶基因sva为报告基因构建pHCMC04-Pk3-sva重组质粒,导入B.subtilis1A857菌株中进行表达,结果表明PK3片段在枯草芽孢杆菌中能使sva基因成功表达,通过测定胞外发酵液粗酶活力为27.3 U/mL。
  为了研究人工双启动子的转录功能,利用来自枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的启动子PaprE和胞苷脱氨酶(cdd)基因的启动子P43,分别构建了麦芽糖α-淀粉酶sva基因为报告基因的pHCMC04-PaprE-sva、pHCMC04-P43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva和pHCMC04-PaprE-p43-sva表达载体,然后分别转化B.subtilis1A857感受态细胞,不同时间取样测定麦芽糖α-淀粉酶sva酶活并比较其酶活力,结果显示重组菌B.subtilispHCMC04-PaprE-sva、 pHCMC04-p43-sva、pHCMC04-P43-PaprE-sva和pHCMC04-PaprE-P43-sva表达的sva酶活分别为69.4 U/mL,79.7U/mL,97.6 U/mL,121.8 U/mL,菌体密度OD600值分别为8.6、9.03、9.5、9.3。表明双启动子较单个启动子表达量均有所提高,串联组合P43-PaprE较单启动子提高1.2倍,串联顺序为PaprE-p43酶活较单个启动子提高1.6倍,串联组合P43-PaprE与单个启动子相比差距不显著,PaprE-p43组合效果最佳。相较于组成型启动子而言,诱导型启动子具有可控性强的优势,适合用于对表达调控要求严格的外源基因表达。根据上述实验结果,尝试获得更高效的诱导型表达载体。以本实验室构建好的pHCMC04-Pglv-sva为骨架,构建重组质粒pHCMC04-P43-Pglv-sva和pHCMC04-Pglv-p43-sva分别转化到B.subtilis1A857感受态细胞进行发酵培养。结果显示,添加1.5%麦芽糖后,重组菌pHCMC04-Pglv-sva最高酶活为112.4 U/mL,pHCMC04-P43-sva为121.6 U/mL,pHCMC04-P43-Pglv-sva为123.8 U/mL,pHCMC04-Pglv-P43-sva为52.3 U/mL。虽然Pglv启动子与P43启动子串联后,启动子的表达时间有所延长,但是双启动子对比单个启动子在最高酶活方面没有显示出优势。
[硕士论文] 张月
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:目前在农业生产上主要依赖于化学农药,但是化学农药的使用带来了一系列的问题,因此使用一种具有特异、高效的生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它广泛用于农业、林业及医学害虫的防治,其生产量和使用量占微生物农药的95%以上。苏云金芽胞杆菌可产生晶体蛋白和可溶性分泌蛋白,并且这些蛋白对靶标害虫具有高效特异的杀虫活性,因此在全球范围内得到普遍应用。正是这种杀虫蛋白的效用,也促使我们识别和鉴定出具有不同特异性的新的杀虫蛋白,从而在土壤环境中分离出更多的新型Bt资源,并且具有杀虫特性的Cry蛋白已经广泛被应用于农业害虫的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白还未有明确其靶标害虫。近年来由于在我国农业害虫的逐年加重,农作物的产量逐年下降。因此,现在急需寻找新型的杀虫活性基因这对我国农业害虫的防治具有非常重要意义。本文针对我国棉田鳞翅目害虫进行了菌株的筛选与杀虫基因克隆的研究。
  本研究主要内容包括:⑴从中国海南地区采集到2300份土壤,分离出Bt菌株755株,其伴胞晶体类型有长双锥体形、短双锥体形、球形等,本实验根据已知的基因序列设计通用引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法,对2300株Bt菌株基因池DNA混合样品进行PCR鉴定。序列分析结果表明,这些Bt菌株基因池中含有2种cry2类基因,分别为cry2Ab基因和cry2Ag基因,扩增得到cry2Ab和cry2Ag的全长基因序列,分别为1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(GenBank登录号为KX357382)和cry2Ag基因序列(GenBank登录号为KX236449)。分别构建pEB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,两种Cry2类蛋白均可以表达出分子量为70 kDa的杀虫晶体蛋白。将得到的两种杀虫晶体蛋白分别对鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)进行生物活性的初筛测定,选取初筛活性较高的蛋白再进行复筛,复筛结果显示,成功表达的两种蛋白对小菜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性。⑵对实验室保存的海南地区菌株Bt BJH500、Bt BJH498进行基因鉴定,通过PCR鉴定发现其中含有cry4基因,再利用全长引物进行扩增,结果获得cry4-like全长基因序列。该序列已提交GenBank注册,登录号为KX244950。将得到的全长基因与pEB载体相连,构建表达载体在大肠杆菌BL21中成功表达,通过SDS-PAGE结果显示,可以在大肠杆菌中表达出分子量为43 kDa的晶体蛋白。将表达得到的晶体蛋白对小菜蛾和棉铃虫进行生物活性初步测定,其校正死亡率都较低,结果分析该蛋白对小菜蛾、棉铃虫均无显著杀虫活性。⑶针对实验室保存的海南地区菌株,进行菌株筛选、基因型的鉴定与杀虫活性的测定,获得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通过聚合酶链式反应(PCR)方法成功克隆杀虫基因3个。研究结果发现两种Cry2类蛋白对三种鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的杀虫活性。
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