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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[硕士论文] 王灵
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:肾综合征出血热是一种自然疫源性疾病,其发病后的主要临床表现为发热、背部疼痛、头痛、低血压、凝血功能紊乱和急性肾损伤,该疾病由汉坦病毒感染引起。肾综合征出血热的具体临床过程可以分为五期,即发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期。在部分病情较重的患者临床表现中,不同的时期可以相互重叠,而在部分病情较轻的患者临床表现中,某些时期则不会表现出来。肾综合征出血热患病人群中以农民占据绝大多数。同时,肾综合征出血热的暴发与流行受到季节的影响,通常在深秋至次年春季时高发。
  中国是肾综合征出血热的高发国家,在中国,肾综合征出血热被归为乙类传染病,并被认为能够对公众卫生健康造成巨大的危害。青岛市是中国境内肾综合征出血热的高发地区,根据青岛市卫生监测数据,自1974年至2015年,青岛市共报道有肾综合征出血热患者14516人,因该病死亡的人数为700人。自2007年起,青岛市疾病预防控制中心便对青岛市内发生的肾综合征出血热疫情进行监控。在疫区,卫生工作者通过患者临床表现和快速诊断试剂诊断肾综合征出血热。自2009年五月起,青岛市给五个农村地区(胶南市、平度市、胶州市、即墨市和莱西市)中的16-60岁人群提供疫苗来控制疫情的发展。因此,针对青岛市当地的肾综合征出血热流行趋势进行研究可以帮助更好的了解当地肾综合征出血热的疾病流行特点,为该疾病的预防和治疗提供指导。
  目的:明确青岛市当地的肾综合征出血热的时间、空间和人群分布特征,了解当地汉坦病毒动物宿主的繁殖规律,评判当地汉坦病毒疫苗接种措施的有效程度,探索青岛市气象因素、动物宿主因素与肾综合征出血热发病之间的相关关系,寻找汉坦病毒传播的新媒介,了解当地汉坦病毒的病毒亚型分类。
  方法:收集2007-2015年青岛市肾综合征出血热发病和死亡资料、2009-2015年青岛市农村地区汉坦病毒疫苗接种资料以及2011-2015年青岛市农村地区动物宿主捕获资料。于2016年在青岛市当地进行流行病学现场调查,收集动物宿主样本和寄生虫样本。提取肾综合征出血热患者血清、动物宿主肺部组织和螨虫等寄生虫内的RNA,对其进行Sanger测序,并将所得序列使用MEGA5.05软件进行分析。
  结果:2007-2015年间青岛市肾综合征出血热共发病1846人,死亡41人,该病的平均发病率为2.45/105。肾综合征出血热发病人群的平均年龄为46.5岁,发病人群中男性占据绝大多数(74.65%),共1378人;在职业分布上,发病人群中大多数为农民(83.37%),共1539人。在地区分布上,青岛市农村地区发病人数最多,共1728人,其次为城乡结合部,共84人,城市地区发病最少,共34人。
  2011-2015年间,青岛市农村地区共捕获动物宿主4081只,动物宿主种类包括黑线姬鼠、褐家鼠、小家鼠、黑家鼠、鼩鼱、仓鼠和黑线仓鼠。在室外捕获的动物宿主主要为黑线姬鼠、褐家鼠和仓鼠,占全部室外捕获动物宿主的73.44%;在室内捕获得动物宿主主要为褐家鼠和小家鼠,占全部室内捕获动物宿主的88.14%。
  2009-2015年间,青岛市农村地区历年的疫苗接种率分别为3.68%、2.73%、1.43%、1.66%、0.02%、2.21%和0.83%。经Cochran-Armitage趋势检验来评估2009-2015年青岛市农村地区疫苗累积接种率和肾综合征出血热发病之间的关系,结果发现青岛市农村地区的疫苗接种情况并未能影响当地肾综合征出血热的发病率。
  通过构建广义相加模型来探索肾综合征出血热与气象因素之间的关系,发现滞后3个月的降雨量与肾综合征出血热的发病率呈正相关。如果滞后3个月的温度在6.0℃到23.7℃之间,温度对肾综合征出血热发病率呈负效应(即该温度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的温度高于23.7℃或者低于6.0℃,温度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该温度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。如果滞后3个月的相对湿度在67.5%到85.7%之间,相对湿度对肾综合征出血热的发病率呈负效应(即该相对湿度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的相对湿度大于85.7%或者小于67.5%,相对湿度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该相对湿度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。考虑到青岛市动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度与肾综合征出血热患者发病率之间有着密切的关系,因此青岛市当地气象因素对肾综合征出血热流行趋势的作用可能是通过影响当地动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度来发挥作用的。
  最后,从肾综合征出血热患者、动物宿主肺组织和螨虫体内提取到了汉坦病毒的RNA,通过进化树分析汉坦病毒L片段,发现从螨虫提取的汉坦病毒序列与部分动物宿主体内的汉坦病毒序列相一致。值得注意的是,在青岛市肾综合征出血热患者、动物宿主和寄生虫体内提取到的汉滩病毒在进化树上距离较近,能够独立成簇,而小家鼠和褐家鼠体内提取的汉城病毒也能够独立成簇。
  结论:肾综合征出血热在青岛市农村地区(胶南市、胶州市、平度市、莱西市和即墨市)流行,并且每年在第四季度发病率达到高峰。黑线姬鼠、褐家鼠和小家鼠等啮齿类动物是汉坦病毒在当地的主要动物宿主。通过构建的广义相加模型,可以根据青岛市气象因素来预测肾综合征出血热在当地的发病趋势,同时根据动物宿主与肾综合征出血热发病之间的密切关联,认为气象因素有可能通过影响动物宿主来改变当地肾综合征出血热的流行趋势。此外,本研究还发现革螨和恙螨在汉坦病毒的传播中能够发挥作用,可能是宿主动物-人群传播之间的媒介。
[博士论文] 吕权真
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近几年,随着临床上癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等疾病导致的免疫受损患者的增多,真菌感染的发病率也在不断攀升。院内血源性感染中真菌感染已经上升至第4位。即便在现有的抗真菌药物治疗下,系统性真菌感染导致的死亡率仍高达40%-70%。现有的抗真菌治疗手段有限,而唑类药物作为常用抗真菌药物出现了严重的耐药现象。在经过唑类药物长期治疗的患者中,分离的白念珠菌对唑类药物的耐药率高达40%。因此,阐明唑类药物的耐药机制,寻找新的抗真菌治疗的手段是临床抗真菌感染急需解决的问题。
  白念珠菌对于唑类药物的耐药机制研究已经取得了一些进展,主要是关于唑类合成通路以及外排泵相关基因的突变和高表达导致的耐药问题。阐明白念珠菌对于靶向于麦角甾醇合成的唑类药物的耐药机制,解决唑类耐药问题,需要彻底阐明白念珠菌麦角甾醇合成通路的调控网络。已有的研究表明,白念珠菌甾醇合成通路主要通过转录因子Upc2p调控相关甾醇合成酶的表达。但在酿酒酵母中,甾醇合成的调控不仅局限于转录水平还包括翻译后调控等方式,但这种翻译后调控的方式在白念珠菌中很少有文献报道,仍需要进一步研究。本文选取了与酿酒酵母中调控羟甲基戊二酰乙酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶稳定性的NSG2同源基因ORF19.273基因作为研究对象,研究其对于甾醇合成通路和唑类药物敏感性的影响。首先,通过HIS1-ARG4-LEU2营养筛选策略和融合PCR的方法构建了白念珠菌ORF19.273(NSG2)敲除菌和回复菌。初步考察ORF19.273缺失菌的表型发现,ORF19.273基因对于白念珠菌增殖速率、菌丝和被膜形成并无影响。而通过药物敏感性考察,发现ORF19.273敲除菌对于唑类药物敏感性升高,但对于唑类药物上游的抗真菌药物洛伐他汀、特比萘酚以及下游的抗真菌药物丁苯吗啉敏感性没有差异,对于两性霉素B耐受。对于洛伐他汀药物敏感性无差异提示ORF19.273和酿酒酵母中NSG2基因功能并不完全一致。透射电镜分析结果显示ORF19.273缺失菌细胞膜会出现轻微缺损,而在氟康唑作用下,ORF19.273缺失菌细胞膜损伤更为严重。除此之外,ORF19.273缺失后细胞膜通透性发生变化,对于不能透过细胞膜的碘化丙啶(PI)通透性增加,说明ORF19.273基因缺失后,白念珠菌细胞膜结构和功能均出现损伤。在白念珠菌中,麦角甾醇合成是影响唑类药物敏感性和细胞膜完整性的重要物质。通过气质联用(GC-MS)分析亲本菌和ORF19.273缺失菌以及回复菌中甾醇的百分比发现,ORF19.273敲除后,含有14α-甲基的甾醇obtusifoliol和14α-methylfecosterol在胞内累积,在氟康唑作用后,亲本菌中累积的主要是lanosterol,而ORF19.273缺失菌中累积的主要是含有14α-methylfecosterol、obtusifoliol、eburicol,这说明ORF19.273基因可以调控白念珠菌中各类甾醇的平衡,而在文献报道中,白念珠菌甾醇分布平衡是维持其对于唑类药物耐受的重要机制。因此,认为ORF19.273主要通过降低细胞内含有14α-甲基甾醇的比例维持白念珠菌对于唑类药物的耐受。体内结果与体外研究一致,在小鼠系统性白念珠菌感染模型中,ORF19.273基因缺失菌感染组在氟康唑治疗后,小鼠肾脏荷菌量和死亡率明显低于亲本菌感染组。本部分研究证实ORF19.273基因通过调控obtusifoliol和14α-methylfecosterol的水平,维持白念珠菌细胞膜完整性和白念珠菌对于唑类药物的耐受。
  除了化学药物治疗外,免疫治疗真菌感染领域也研究较为广泛。白念珠菌作为机会性致病真菌,其致病性与机体免疫系统的状态有着密切关系。近几年,文献已经报道了多种有效的抗真菌感染的单克隆抗体、减毒活疫苗以及重组蛋白疫苗,但关于疫苗的作用机制研究还相对较少。通过研究不同疫苗的作用机制和免疫系统清除真菌的关键环节可以为开发新的抗真菌治疗手段提供思路。本研究中发现白念珠菌转录因子FLO8缺失菌作为基因改造的白念珠菌弱毒株可以激活野生型小鼠的免疫保护作用。尾静脉注射flo8△活菌预免后,小鼠对于侵袭性白念珠菌感染、金黄色葡萄球菌感染以及肺部的烟曲霉菌感染和铜绿假单胞菌感染均能产生较好的免疫保护效果。通过长期预免策略,发现flo8△活菌可以刺激机体产生高水平的与白念珠菌结合的抗体,flo8△活菌预免的血清可以增强巨噬细胞对于白念珠菌的调理杀伤能力。在短期预免保护策略中发现flo8△活菌的保护作用不仅仅依赖于抗体,更依赖于其刺激产生的抗炎因子IL-10,IL-10可以降低正常毒力菌株SC5314二次感染时造成的急性炎症损伤,减少单核细胞和中性粒细胞的募集。同时IL-10可以保护胸腺在白念珠菌感染过程中不发生萎缩,通过上调抗凋亡基因BCL-2和BCL-XL的表达抵御白念珠菌感染引起的CD4+CD8+细胞凋亡。通过分析FLO8基因缺失菌细胞壁成分的变化,发现FLO8基因缺失菌表面的甘露聚糖,尤其是血清诱导后的甘露聚糖刺激巨噬细胞产生IL-10的水平升高。小鼠腹腔注射FLO8缺失菌甘露聚糖后,二次感染SC5314时,小鼠肾脏荷菌量降低,生存率升高,这说明FLO8表面的甘露聚糖是FLO8基因缺失菌诱导免疫保护效应的基础。在体外刺激巨噬细胞时,还发现FLO8缺失菌经过血清诱导后,可以特异性刺激巨噬细胞产生NO。标准菌株SC5314则需要在Pam3CSK4协同下刺激巨噬细胞产生NO,说明FLO8缺失后白念珠菌表面刺激NO产生的抗原增多,后来经过分离提取确定是白念珠菌氯仿甲醇提取物中的正丁醇部分能够刺激巨噬细胞产生NO。但体内研究发现,NO并不参与FLO8基因缺失菌诱导的免疫保护效应。综上所述,FLO8基因缺失菌主要通过表面的甘露聚糖刺激CARD9介导的IL-10的生成保护二次感染后小鼠的胸腺并提高小鼠的生存率。这种免疫保护机制可以为后续疫苗的开发以及抗真菌治疗提供新的理论指导。
[硕士论文] 张娴
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃肠功能障碍对危重症患者的预后起着至关重要的作用。前期基础研究表明大黄,作为一种中药,能够有效保护胃肠道屏障功能,阻止肠道细菌移位,促进肠蠕动,但至今临床研究较少。本研究的目的在于探讨中药大黄对危重症患者胃肠功能障碍的疗效。
  方法:
  根据纳入及排除标准对2015年6月至2017年5月期间进入重症监护室(intensive care unit,ICU)的患者进行筛选,最终共有368位患者进入本次回顾性队列研究。再根据暴露因素(即胃肠功能障碍患者是否接受大黄治疗)将患者分为大黄组和常规治疗组。大黄组接受常规药物治疗+生大黄粉治疗,常规治疗组仅接受常规药物治疗。常规药物治疗方法包括促胃肠动力、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜、抗感染、抗炎、保肝、维持循环稳定、维持水电解质平衡等。收集患者进入ICU24小时内及治疗7天后的临床资料,比较两组治疗效果。采用倾向性评分匹配法(propensity score matching,PSM)控制两组间的混杂偏倚。
  结果:
  根据是否使用大黄治疗,入选患者被分为大黄组(219例,59.51%)和常规治疗组(149例,40.49%)。
  基线特征:纳入时与常规治疗组相比,大黄组患者腹胀程度、急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)级别较高(重度腹胀:43.84%vs4.70%;AGIⅢ:43.84%vs4.70%,P<0.05),序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment score,SOFA)评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分较低(SOFA评分:4.84±3.09vs6.44±3.45;APACHEⅡ评分:12.88±6.14vs14.98±5.77,P<0.05),甘油灌肠剂、米雅、促胃肠动力药使用比例较少(甘油灌肠剂:54.79%vs77.18%;米雅:35.16%vs48.32%;促胃肠动力药:17.35%vs32.21%,P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。为控制两组间的混杂偏倚,采用倾向性评分匹配法,以大黄组为基准组进行匹配,最终68对匹配成功,共136例病例,匹配后两组患者基线特征无统计学差异。
  主要研究结果:匹配前大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为59.82%、39.60%,匹配后大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为77.94%、30.88%,大黄组喂养耐受率均较常规治疗组高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  次要研究结果:匹配前后大黄组患者AGI分级改善率、肠鸣音改善率均较常规治疗组高(匹配前:AGI分级改善:75.34%vs29.53%,肠鸣音改善:90.41%vs72.48%;匹配后:AGI分级改善:76.47%vs33.82%,肠鸣音改善:91.18%vs64.71%,P<0.05),SOFA评分、APACHEⅡ评分、住ICU天数、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、内毒素均较常规治疗组低(匹配前:SOFA评分:4.23±3.57vs5.84±3.69,APACHEⅡ评分:11.92±6.55vs14.11±6.30,住ICU天数:12.00(9.00,18.00)vs14.00(9.50,21.00),CRP:23.21(9.00,52.97)vs47.08(24.00,92.86),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.11);匹配后:SOFA评分:4.54±3.61vs5.63±3.79,APACHEⅡ评分:12.56±6.03vs13.74±6.00,住ICU天数:12.00(9.00,18.50)vs13.00(9.50,20.50),CRP:25.39(12.03,67.71)vs53.48(28.19,100.25),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.10),P<0.05),差异有统计学意义。28天死亡率在匹配前后两组患者间差异无统计学意义(匹配前:22.37%vs22.15%;匹配后:30.88%vs23.53%,P>0.05)。两组患者均未发现严重不良反应。
  结论:
  中药大黄能够有效提高危重症患者肠内营养耐受性,缓解胃肠功能障碍,且无严重不良反应,为临床实践中应用大黄治疗胃肠功能障碍提供了循证医学证据。
[硕士论文] 洪萍
儿科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  了解目前国内先天性心脏病相关肺高压患儿的临床流行病学特征、治疗现状及预后转归。分析红细胞分布宽度、血尿酸在儿童先天性心脏病相关肺高压中的变化,探讨两者在病情评价中的作用。
  方法:
  采用回顾性分析,收集2009年1月至2016年12月收治本院的确诊先天性心脏病相关肺高压患者,收集临床基线资料、超声心动图数据、右心导管检查结果、实验室检查及住院治疗的相关资料,然后对先天性心脏病相关肺高压患者进行回顾分析。根据年龄分组,0-16岁归入儿童先天性心脏病相关肺高压组,并以同期收治的先天性心脏病无肺高压的患儿为对照组,对两组的临床资料进行比较,分析影响先天性心脏病患儿发生肺高压的危险因素及影响预后的因素。根据手术后肺动脉高压是否持续存在,分为术后肺高压组与术后无肺高压组,对两组资料进行多因素分析。分析红细胞分布宽度和血尿酸水平在先天性心脏病相关肺高压者中的变化,对红细胞分布宽度和血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压进行相关性分析。
  结果:
  1、本研究共入选儿童CHD-PH70例。在儿童CHD-PH中,室间隔缺损为最常见类型(63%),其次为2种及以上的复合畸形类型(29%),依次为房间隔缺损(4%),动脉导管未闭(4%)。
  2、治疗措施中,本研究中外科手术治疗为主(72%),内科介入及靶向药物治疗所占比例低。
  3、CHD-PH组红细胞分布宽度、NYU PHFI评分、双向分流比例均高于对照组(P<0.05),肺高压组左心室射血分数明显低于对照组(P<0.05)。
  4、术后肺高压组手术年龄、肺动脉收缩压均高于对照组(P<0.05),多因素Logistic回归分析示,手术年龄为儿童CHD-PH患儿术后持续肺高压的危险因素(P<0.05)。
  5、先天性心脏病相关肺高压的死亡组患儿其红细胞分布宽度高于存活组(P<0.05)。红细胞分布宽度预测先天性心脏病相关肺高压儿童发生不良事件的结果显示ROC曲线下面积为0.729(95%CI:0.541-0.917),红细胞分布宽度以14.8%为截点获得较好的敏感度(0.67)与特异度(0.77)。
  6、儿童CHD-PH组尿酸值高于CHD组,但差异无统计学意义(P>0.05);在儿童CHD-PH中死亡组尿酸值高于存活组,但差异无统计学意义(P>0.05,血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压均无相关(P>0.05)。
  结论:
  1、儿童先天性心脏病相关肺高压中最常见的心脏畸形为室间隔缺损,本研究中以外科手术为主要治疗手段,手术年龄是CHD-PH患儿术后持续肺高压的独立危险因素,早期手术治疗者肺动脉高压纠正机会更大,预后良好,建议对此类患者应早期诊断、及时纠正心脏畸形。
  2、红细胞分布宽度在肺高压组明显高于对照组,且在因肺高压死亡患儿组明显高于存活组,因此,红细胞分布宽度在一定程度可以提示先天性心脏病相关肺高压患儿不良预后。
  3、血尿酸与肺动脉压力无相关性,对儿童先天性心脏病相关性肺高压患儿病情无评价意义。
[硕士论文] 邓捷文
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:树突状细胞(dendritic cells,DC)是由Steinman和Cohn在小鼠脾脏中所发现的一种具有树枝状突起的独特形态的细胞。DC是目前已知的最强的抗原提呈细胞,它是特异性免疫应答的触发者,因为它能够刺激初始型T细胞(na(i)ve T cell)活化和增殖,而M(Φ)、B细胞等只能触发已活化的T细胞或记忆性T细胞发生免疫应答。而且也有报道表明,活化的DC细胞能产生释放大量的炎症因子TNF-α和IL-6等。而大量炎性因子的释放促进全身炎症反应综合征的发生发展进一步诱导多器官功能衰竭。故对可调控DC功能的相关分子进行研究具有重要意义。
  同时,细胞凋亡与固有免疫的关系仍是目前研究的热点,凋亡相关分子对固有免疫的调节效应也逐渐被人们所关注。以往研究表明,作为TNFR和TNF家族重要成员的Fas和FasL分子是经典的凋亡诱导信号,但近年来的研究表明,Fas和FasL也可以分别传递信号,发挥不同于凋亡诱导的效应。FasL分子与Fas受体结合后,表达FasL分子的细胞其自身在FasL分子反向信号的作用下发生相应改变。相关的体内和体外实验也证明,FasL分子作为共刺激分子参与胸腺细胞成熟和成熟T细胞活化、增殖的过程,并且FasL分子,作为阳性选择的必需分子能够调节TCR与MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子的亲和力并提高胸腺细胞阳性选择的效能,但其发挥效应的具体机制尚不清楚。树突状细胞表面也表达FasL蛋白,但是FasL反向信号是否在DC中发挥效应仍有待进一步研究。
  之前的实验工作发现,活化性抗Fas抗体Jo-2不能有效诱导树突状细胞的凋亡,反而诱导DC表型和功能的成熟,并分泌释放细胞因子IL-1β和多种趋化因子。为了深入研究FasL反向信号在DC中的非凋亡效应,用Fas-Fc融合蛋白来模拟Fas分子的作用刺激野生型小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC),观察炎症因子的分泌、表型、吞噬能力以及抗原提呈能力的变化。初步实验表明BMDC在Fas-Fc的作用下IL-6和TNF-α分泌增加,且DC表面MHCⅡ和CD86的表达明显上调,CD80和CD40的表达轻微上调,且DC吞噬功能轻度减弱以及抗原提呈能力一定程度上有所提升。为进一步确认该现象,用FasLgld(FasL分子胞外段分子突变致胞外结合Fas功能缺失及胞内无法传递信号)小鼠进一步验证了FasL的反向信号对BMDC的效应,发现FasLgld小鼠来源的BMDC在Fas-Fc的作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,抗原提呈能力降低。为了进一步确认该现象,利用了FasLΔIntra小鼠(FasL分子胞外段能结合并触发Fas信号,但FasL分子胞内段突变不能有效激活下游信号通路),结果基本与FasLgld小鼠相一致。而且进一步研究发现,野生型小鼠来源的BMDC在某些MAPK通路抑制剂和Fas-Fc的共同作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,这说明FasL胞内信号促进DC分泌炎症因子,并且这一效应与MAPK通路相关,Western blot结果也进一步验证了这一现象。由于TNF-α和IL-6的分泌与多种疾病如自身免疫性疾病及感染性疾病相关,因此,研究FasL的反向信号对其分泌的影响及机制,将进一步加深人们对自身免疫疾病及炎症等疾病的发生发展的认识,为寻找这些疾病的治疗方案提供新思路。
  另一方面,知道FasL分子反向信号能诱导炎症因子的大量释放,而炎症因子的大量释放是系统性感染的重要特征。因此,想知道FasL反向信号在系统性感染过程中发挥怎样的效用。建立了真菌系统性感染模型,将一定量的白色念珠菌通过尾静脉分别注入WT、FasLgld、FasLΔIntra小鼠体内,结果发现FasLgld小鼠总体生存率提高,在感染48h后肝、肾真菌负荷量减少;同样地,FasLΔIntra小鼠对真菌感染也不敏感,其生存期明显延长,并且血清中的IL-6和TNF-α的释放显著降低,且感染48h后,FasLΔIntra小鼠肾脏的真菌负荷量显著减少。这一系列结果提示FasL反向信号的活化可能与真菌系统性感染导致的炎症损害及预后相关。已知重要的模式识别受体Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)和C型凝集素型受体(C-type lectin receptors,CLR)在识别细菌和真菌并诱导免疫反应的过程中发挥重要作用,而大量研究表明CLR能够结合大多数真菌细胞壁暴露的β-葡聚糖或甘露糖等配体分子,在抗真菌感染免疫中发挥主要作用。CLR,包括dectin-1,dectin-2,甘露糖受体,DC-SIGN和Mincle等在内能够识别结合真菌的多糖,诱导DC分泌TNFα、IL-1β、IL-6和IL-23以及趋化因子CCL2、CXCL1及CCL3。而之前的实验结果也表明FasL分子突变后的小鼠对于系统性真菌感染不敏感,炎症因子释放减少,这也提示FasL反向信号可能与CLR信号传导通路存在相互影响。为了验证DC的FasL效应在抗真菌感染反应中的作用,进一步研究DC中FasL与CLR的交互作用,通过体外培养WT、FasLΔIntra小鼠来源的BMDC,分别给予2μg/ml的zymd(dectin-1激活剂)、2μg/ml的mannan(dectin-2激活剂)刺激DC24h,结果发现FasLΔIntra来源的BMDCIL-6和TNF-α的分泌量显著降低;同样地,用Fas-Fc刺激WT和CLR缺陷小鼠(dectin-1-/-和dectin-2-/-小鼠)来源的BMDC,结果发现CLR缺陷小鼠IL-6、TNF-α因子分泌减少。这也进一步验证了FasL与CLR存在交互作用,但其分子机制有待进一步研究。
  综上所述,FasL分子反向信号通过多条经典的相关信号通路(如MAPK信号通路等)促进树突状细胞成熟活化并诱导炎症反应。而在急性系统性真菌感染过程中,FasL分子促进机体分泌大量炎症因子,在由败血症诱导的SIRS反应中发挥一定的效应。本研究进一步研究了FasL非凋亡效应及其机制,以期为真菌感染所致败血症的治疗提供新的理论基础。
[硕士论文] 王晔炜
特种医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:减压病是潜水和高气压医学领域的一个核心问题。航天员出舱、潜水员出水、加压舱减压等活动都应当遵循一定的减压规则,以预防这一疾病。减压算法,是运用了生理学、物理学原理构建的数学模型。这类模型能够模拟惰性气体在人体内的运动,并通过人为设置的一定规则计算出相应的减压方案,指导安全减压。
  最早的减压算法是Haldane于1908年所创立的5类理论组织算法。减压算法诞生至今,在发展中不断革新理论,创新方法,产生了许多更加科学和高效的新算法。而当前中国所使用的空气和氦氧潜水减压表理论基础还停留在Haldane的算法上。学习吸收新型减压理论和减压算法的优点,能够进一步地提升安全与效率。这就需要从源头算法出发,学习和借鉴当前主流减压算法,以此为基础对算法进行优化,进而计算适应潜水实践需求的新型减压方案。
  本研究以减压算法的计算步骤为线索,对当前主流减压算法中的ZH-L16,可变通透性模型和Thalmann算法进行了深入的解析,并根据其特点,进行了吸收融合。
  首先,本研究对惰性气体运动过程的模拟计算过程进行了解析,研究了生理性惰性气体动力学指数式方程与线性-指数式方程的计算过程与特点。再结合生理性惰性气体脱饱和速率慢于饱和速率的这一特点,进行了简化与优化。通过增加不对称半饱和比这一参数,模拟了生理性惰性气体运动的不对称性。同时,将呼吸商对吸入气中生理性惰性气体分压的影响考虑在内,使计算更加精确。
  其次,本研究论证了平行理论组织这一算法基础框架的合理性与其背后所蕴含的生理学原理,确定了平行理论组织对于新型算法的适用性。同时,分析比对了几种不同减压算法的平行理论组织分布特点,总结出了平行理论组织半饱和时间设定和分布的规律,并运用这一规律,确定了11类理论组织及其半饱和时间。
  接着,在解析ZH-L16、可变通透性模型和Thalmann算法减压上限计算过程的基础上,本研究将计算减压上限的方式归纳总结为比例法、线性法与差值法。在吸纳线性法与差值法各自的特点后进行了融合,形成了非线性法的减压上限计算过程。使差值法的减少气泡产生与比例法的浅深度停留充分这两个特点相互结合,产生了新型减压算法ANL。
  ANL算法参考了ZH-L16A的基本参数,沿用了平行理论组织这一概念,将理论组织的类别数设定为11类,使用不对称饱和-脱饱和过程对生理性惰性气体的张力计算过程进行模拟,并综合线性法与差值法的特点,应用非线性法对减压上限的计算进行了优化。
  为了对优化后算法进行评估,本研究以试验算法为目的,自主开发了减压算法试验平台软件,并将其用于后续的算法运算与优化环节。对于潜水电脑表可以使用的实时减压算法,本研究也以生理性惰性气体运动的实时计算为线索,初步进行了分析和设计,使未来的潜水电脑表研制工作具有了一定的理论基础。
  最后,通过分析比较几种现有减压表的减压规则,本研究从站间距、上升下潜速率、气体切换和停留时间这几个方面确定了ANL算法减压规则。并运用减压算法试验平台软件,产生了基于ANL算法的空气与氦氧潜水减压方案,将其中的部分减压方案与现有空气和氦氧常规潜水减压表中的方案进行了比较。结果表明,对于不同类型的潜水,通过对半饱和时间比根据一定规则进行修正,ANL算法可以计算出类似于现行减压表的减压方案。初步论证了其理论层面的安全性和可行性,该新型算法具有潜在的实用价值。
[博士论文] 代现良
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高血压是一种多因素疾病,多种细胞或者细胞因子等都参与其发病进程。随着人口老龄化和生活方式的改变,高血压的发病率呈现增高的严峻态势,高血压已然成为全球性的重要公共卫生问题。由高血压带来的各种心脑血管疾病以及其相关的并发症则成为严重威胁世界人民群众身心健康,临床迫切需要解决的关键问题。既往研究已知炎症反应和免疫系统参与了高血压进程,而且已经得到的广泛认可。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种导致高血压和靶器官损害的主要介质和血管活性肽。另外,通过以往研究我们也已经明确,T淋巴细胞参与了炎症反应和免疫反应,并在高血压的病理进程中具有重要的调节作用。而胸腺作为一个十分重要的免疫器官,以及T细胞发育成熟的重要位点,虽然随着年龄增长,胸腺功能逐渐减退,但其依然具有一定的生理功能,可以继续促进新的T细胞的产生,尤其近来国内外很多研究揭示:通过调节相关转录因子FoxN1逆转胸腺衰老可奇迹般逆转小鼠的整体衰老,有牵一发而动全身的功效,这就激发了研究人员的无限遐想。
  既往有研究结果显示,高血压小鼠可能存在胸腺功能减退的情况。说明胸腺与高血压进展可能存在密切相关性,那么高血压本身的病理进程是否会导致胸腺功能减退加速衰老,以及其可能的相关的机制都不清楚,而通过逆转胸腺衰老则是否能够影响高血压进程亦尚不清楚。本研究通过血管紧张素Ⅱ诱导小鼠高血压模型,观察高血压小鼠胸腺功能的改变,随后通过胸腺移植等技术进行干预,观察上述操作对高血压进程及其靶器官的影响,并通过体外培养胸腺上皮细胞(TEC)探讨其中可能存在的机制,从而为临床治疗高血压提供新的诊疗方案和治疗靶点。
  方法:本研究动物实验共分为两个大部分,第一部分在体实验,将45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,随机分为正常对照组(Con组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(HTN组,n=15)。高血压模型组采用皮下植入装有AngⅡ溶液的微泵诱导而成,植入微泵后第三天开始每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续8周记录血压数据,处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、脾脏、心脏和肾脏等器官或组织。第二部分分为在体实验和体外实验,其中在体实验:45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,先被随机分为两组,正常对照组(Con组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(n=30)。连续鼠尾无创测压4周后,明确建模成功后再将高血压模型组随机分为高血压组(HTN组,n=15)和移植组(HTN+Trans组,n=15)。分离出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺组织,将其切成小块移植至移植组小鼠另外一侧(与植入微泵相反一侧)的肾包膜下,移植后3天继续每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续5周记录血压数据,并应用心脏超声检测小鼠心脏功能,然后处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、心脏、脾脏和肾脏等器官或组织。流式细胞仪分析外周血和脾脏T细胞亚群的百分比,以及胸腺细胞皮质胸腺上皮细胞(cTEC)和髓质胸腺上皮细胞(mTEC)比值(cTEC/mTEC);实时定量PCR检测胸腺FoxN1、Aire、sjTREC和ATRAP表达水平;WesternBlot检测小鼠胸腺FoxN1、Aire和ATRAP的蛋白水平;以及对胸腺、脾脏、心脏和肾脏组织进行HE染色,并通过免疫组化方式检测胸腺FoxN1的水平;体外试验:将出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺在无菌条件下取出,然后进行胸腺上皮细胞(TEC)的培养,胸腺上皮细胞被分为空白对照组(即无刺激)、AngⅡ刺激48h组和AngⅡ刺激48h后与无刺激的TEC共培养组,然后取样以提取RNA和蛋白,检测FoxN1和ATRAP mRNA表达水平和蛋白水平。
  结果:
  1、HTN组收缩压(SBP)与舒张压(DBP)明显高于Con组和Sham组(p<0.05),Con组与Sham组血压没有差异,HTN+Trans组血压低于HTN组(p<0.05)略高于Con组(p>0.05)。在第一部分小鼠在体实验中,HTN组小鼠胸腺指数低于Con组和Sham组(p<0.05),Con组和Sham组无差异;在第二部分小鼠在体实验中,与Con组比较,HTN组小鼠胸腺指数明显下降(p<0.01),脾脏指数和肾脏指数升高(p<0.05),左室心脏比明显升高(p<0.01);与HTN组比较,HTN+Trans组小鼠胸腺指数明显升高(p<0.01),脾脏指数、肾脏指数和左室心脏比下降(p<0.05)i;HTN+Trans组小鼠左室心脏比高于Con组(p<0.05)。
  2、与Con组比较,HTN组LVEF、FS和SV均下降(p<0.05),ESV升高(p<0.05);HTN+Trans组LVEF、FS和SV高于HTN组,ESV低于HTN组(p<0.05),与Con组无差异。
  3、在第一部分中,与Con组小鼠相比较,HTN组小鼠胸腺衰老相关基因FoxN1和Aire的表达下调(P<0.05),HTN组小鼠sjTREC的含量亦下降(p<0.05),其余各组无明显统计学差异。在第二部分中,与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1、Aire、ATRAP和Thymosin beta4的表达下调(p<0.05),HTN组胸腺sjTREC的含量也减少(p<0.05),然而HTN组脾脏sjTREC的含量增加(p<0.05),余无统计学差异。
  4、流式分析结果显示,第一部分中HTN组小鼠外周血和脾脏TEM明显高于Con组和Sham组(p<0.05),HTN组小鼠脾脏na(i)ve T细胞低于Con组和Sham组(p<0.05),余无差异。第二部分中HTN组小鼠外周血和脾脏组织TEM明显高于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠外周血na(i)veT细胞低于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠cTEC/mTEC比值高于Con组,低于HTN+Trans组(p<0.05)。
  5、与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1和Aire,以及ATRAP的蛋白表达水平明显下调(p<0.01),其中与Con组比较,HTN+Trans组FoxN1的蛋白水平下降(p<0.05),余无差异。
  6、胸腺HE染色,结果显示,各组小鼠胸腺均出现不同程度的典型退化萎缩表现,其中高血压组小鼠出现胸腺上皮间室的典型退化萎缩最为严重,皮质和髓质区域之间的区别减少以及胸腺小岛数量减少,而高血压移植组,胸腺病理与正常对照组差异较小,胸腺退化程度较轻。肾脏HE染色,显示高血压组小鼠可见病变区域与正常组织区域界限明显,部分区域肾小管萎缩及间质发生纤维化,及以淋巴细胞及浆细胞为主的炎症细胞浸润;部分血管可见蛋白栓塞,个别肾小球萎缩,囊腔扩张,囊壁明显增厚。脾脏HE染色,显示Con组小鼠脾组织整体结构轻度异常,脾小结数量无轻度减少,个别脾小结萎缩,淋巴数量下降,小部分区域红髓白髓界限不清,但仍可见脾动脉,脾组织内可见大量中性粒细胞浸润;HTN组小鼠脾组织整体结构异常,组、织大部分区域结构紊乱,无正常脾小结结构,红髓白髓界限不清,可见多核巨噬细胞及中性粒细胞增多;HTN+Trans组小鼠脾组织整体结构异常,但与高血压组比较相对较轻,脾小结数量减少,且部分区域脾小结萎缩;部分区域红髓白髓界限不清,组织无明显炎症细胞浸润,淋巴数量减少。心脏HE染色,显示高血压组心肌肥厚,左室肥厚指数和左心室壁厚度增大以及纤维化增多等;HTN组主动脉壁增厚(p<0.05),Con组和HTN+Trans组之间无差异。
  7、免疫组化HTN组胸腺皮质和髓质区域之间的区别减少,FoxN1染色减少,HTN组小鼠胸腺FoxN1荧光累计光密度值明显下降(p<0.01),HTN+Trans组明显改善。
  8、体外实验结果显示,与无刺激的blank组、给予AngⅡ刺激和给予AngⅡ刺激后共培养组比较,给予1μmol/L的血管紧张素Ⅱ刺激后,FoxN1和ATRAP的mRNA表达水平以及其蛋白水平均下调(p<0.05),给予AngⅡ刺激后在共培养一段时间后的Co-culture组,与blank组无差异。
  结论:体外实验表明血管紧张素Ⅱ可以通过下调ATRAP的表达,进而下调胸腺FoxN1的表达,导致胸腺功能减退,共培养可改善其影响。在体实验结果显示AngⅡ诱导的高血压小鼠存在胸腺功能减退,包括FoxN1、Aire和ATRAP的mRNA表达的下调和蛋白水平的下降,以及反映胸腺近期输出功能减弱的sjTREC含量的下降,T细胞亚群百分比的失衡和胸腺素β4的下调,从而导致或者加重高血压进程。通过胸腺移植,提高胸腺FoxN1的表达,可明显改善小鼠心脏功能,恢复和抑制血压的升高。其可能存在的潜在机制为胸腺移植上调胸腺发育至关重要的转录因子FoxN1的表达,进而引起ATRAP的表达上调,从而反过来影响血管紧张素Ⅱ对胸腺功能的影响,以及引起胸腺素β4的升高和sjTREC含量的增加,并且能够恢复T细胞亚群的正常百分比,从而改善和抑制血压的升高。
[硕士论文] 奂剑波
内科学(呼吸系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:海难或海战时落水人员浸泡于海水中,发生海水浸泡性体温过低症的概率较大。马岛海战中,阿根廷“贝尔格拉诺将军号”巡洋舰遭英潜艇鱼雷攻击后迅速沉没,舰员落水和失踪达320人,大多数舰员落水后因低温海水浸泡而死亡[1]。目前对海水浸泡体温过低症致伤机制与救治的认识尚不完全清楚,即使采用及时的救治措施,重症低温伤员救治成功率仍然低于50%[2,3]。由于海上搜救伤员的难度较大,如处于战争时期,落水人员的救治通常需要等待较长时间[4]。在20℃以上海水中,落水人员的生存时间明显延长。既往体温过低症动物模型通常在短时间内致伤,并不能很好反映长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的病理生理改变。
  及时恰当的复温是海水浸泡性体温过低症早期救治的关键措施。既往国内外研究大多关注急性重度体温过低症伤员的主动体内复温措施,如CRRT或者ECMO等[4]。体表复温由于其可能产生“复温性休克”或者“后降效应”等在救治实践中应用尚存在争议[7,8]。而在长时程海水浸泡导致的慢性体温过低症的救治中,如果伤员的意识清醒,海战环境下,无高级的复温设备,无专业的医务人员时,紧急采用温水浴复温等体表复温对海水浸泡性体温过低症伤员进行救治的利与弊难以把握,与被动复温相比对机体的影响仍不清楚。另外,海水浸泡性体温过低症肺损伤相关并发症发生率最高,其死亡率高达66.7%[9],如不正确及时处理可能对体温过低症最终救治成功率产生影响。血清酶学指标改变如肝功、肾功、心肌酶等可反映机体重要脏器的病理生理状态,体温过低症时其变化也较大。观察复温措施对于肺脏病理损伤和重要血清酶学的影响可一定程度上评估该复温方法的有效性。
  为了对长时程海水浸泡导致的体温过低症的病理生理改变有更深刻的认识,并为后续研究打下基础,建立了长时程海水浸泡导致的体温过低症SD大鼠模型,并对其进行重要脏器病理学改变进行横断面的观察研究,发现该模型中肺脏是重要的低温致伤靶器官,并发现了低温性胸水,且血清酶学改变明显。在此基础上采用温水浴和被动复温两种不同方法对大鼠进行复温,比较复温前后体温过低症大鼠肺脏损伤程度及血清酶学等指标的变化,以此初步评价温水浴复温在紧急状态下对长时程海水浸泡性体温过低症复温的效果。
  第一部分:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型的建立
  目的:建立长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型。
  方法:成年雄性SD大鼠20只,随机均分为正常对照组和低温实验组,每组10只。正常对照组不做处理,低温实验组采用自制大鼠水浴固定器在20℃人工海水中浸泡24h,观察大鼠生命体征变化,实验结束后检测各部位体温,常见血液学指标及重要脏器病理学改变。
  结果:低温实验组大鼠低温海水浸泡过程中,心率、呼吸、意识等与正常对照组相比明显下降,浸泡结束后核心温度接近20℃。血液学指标明显异常,病理学提示重要脏器均出现不同程度损伤。肺脏病理损伤较为严重,出现肺泡结构破坏、肺泡及间质出血、炎性细胞浸润等改变。
  结论:长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠模型建立成功,肺脏为重要的损伤靶器官,可用于后续相关研究。
  第二部分:温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠肺损伤及血清酶学的影响
  目的:比较温水浴复温与被动复温,长时程海水浸泡体温过低症SD大鼠复温前后肺脏病理及血清酶学变化,初步评估温水浴复温在长时程海水浸泡体温过低症救治中的效果。
  方法:100只雄性SD大鼠随机均分为正常对照组(不做任何处理),低温实验组(20℃海水浸泡24h),被动复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+被动复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),温水浴复温组1、2、3、4(20℃海水浸泡24h+温水浴复温,分别在复温后0h、3h、6h、12h处死),每组10只。主要检测肺脏病理学及血清肝功、肾功、心肌酶等指标改变。
  结果:温水浴复温与被动复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常均有恢复作用。与被动复温组相比,温水浴复温组大鼠在复温后6h、12h,肺脏病理损伤恢复更好,P<0.05;在复温后6h实际碳酸氢盐恢复更好,P<0.05;在复温后0h肝功能指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05;在复温后0h肾功能指标升高更少,复温后3h、6h、12h恢复更好,P<0.05;在复温后0h心肌酶指标升高更少,复温后3h、6h恢复更好,P<0.05。
  结论:与被动复温相比,温水浴复温对长时程海水浸泡体温过低症大鼠肺损伤及血液学异常的修复作用更明显。温水浴复温在海战中长时程海水浸泡导致的体温过低症伤员的紧急复温中效果优于被动复温。
[硕士论文] 郑仕清
外科学(烧伤外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在过去的三十年中,糖尿病在全世界范围内已成为一种新型“流行病”,目前我国的糖尿病患者已超过1亿,居全球第一位。对于糖尿病患者而言,任何创面均有可能发展形成严重感染的慢性创面,甚至造成截肢,严重影响愈合及患者生存质量。在控制血糖的前提下,对于创面彻底清创、避免感染,促进创面愈合是糖尿病创面主要的治疗方式。但是传统方法存在治疗时间长、次数多、复发率高的问题,临床对于新型有效的治疗方法需求极大。
  羊膜位于胎盘最内层,厚度约为8-12um,不含神经及血管。研究表明羊膜具有促进细胞迁移及扩增、免疫源性低、减轻炎症、含有大量的生长因子和细胞因子等特点。自1910年羊膜首次作为敷料用以创面治疗以来,随着保存技术的发展,使羊膜在眼科疾病、烧伤救治、整形修复、口腔疾病及神经外科等领域都有广泛的应用。羊膜上皮层是由单层立方上皮细胞构成,称之为羊膜上皮细胞。多项研究表明,人羊膜上皮细胞表达多种干细胞标志物,并具有向三个胚层分化的能力,而且能够分泌多种生长因子。同时因其来源广泛和便于分离,无免疫源性和致瘤性,使羊膜上皮细胞成为移植和再生医学潜在的细胞来源。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道,目前羊膜上皮细胞已在肝、神经、肺、心肌甚至肿瘤治疗中都有一定的优势,但是尚少有羊膜上皮细胞应用于糖尿病创面的研究。因此在本课题中,我们通过提取培养羊膜上皮细胞,应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。
  第一部分 人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测
  目的:分离培养人原代羊膜上皮细胞并检测鉴定。
  方法:收集剖宫产胎盘分离羊膜,通过酶消化法提取羊膜上皮细胞体外培养。流式细胞计数检测羊膜上皮细胞表型,免疫荧光法及RT-PCR法检测羊膜上皮细胞干性标志物,最后对其进行三胚层诱导检测其分化潜能。
  结果:体外人羊膜上皮细胞镜下观察可见细胞成鹅卵石样成团生长,核圆,居中,细胞呈多边形,边界清楚,轮廓分明。通过流式细胞仪检测显示培养细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,但是不表达CD45、CD34。通过免疫荧光检测发现,羊膜上皮细胞表达SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR结果显示羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。诱导分化实验证明羊膜上皮细胞具有向三胚层分化潜能。
  结论:采用酶消化法成功分离培养羊膜上皮细胞,其可以表达多种干细胞标志物,并能够向三胚层分化,在组织修复中具有很大的潜力。
  第二部分 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合作用的研究
  目的:研究羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合的作用。
  方法:将原代提取的羊膜上皮细胞局部注射糖尿病创面,观察创面愈合情况。收集创面标本行病理学以观察创面愈合情况;行CD31免疫组化检测创面血管化;行CD68、iNOS、CD206免疫荧光检测巨噬细胞极化;行促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和促进愈合因子(VEGF、TGF-β1、IGF-1)的ELISA检测炎症反应的改变。通过标记羊膜上皮细胞,观察羊膜上皮细胞在创面的转归情况。
  结果:(1)与空白组相比,羊膜上皮细胞组在创面笫10、14天创面愈合率明显升高(P<0.01)。(2)通过病理检测显示创面第10天羊膜上皮细胞组新生肉芽组织厚度较PBS组明显增加(P<0.01);CD31免疫组化显示创面羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度较PBS组明显增多(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞密度明显低于PBS组(P<0.01),M2型巨噬细胞密度明显增对高(P<0.05),M1/M2比例也明显降低(P<0.01);羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量(P<0.01),而IL-1β、IL-6、TNF-α表达量明显较空白组低(P<0.01)。(3)羊膜上皮细胞植入创面第5天,可观察到创面有大量羊膜上皮细胞存活;在创面第10天,可观察到创面少量羊膜上皮细胞存活。
  结论:羊膜上皮细胞通过调控巨噬细胞极化、减轻创面炎症反应、促进创面血管新生以促进糖尿病创面愈合;同时其在创面存留时间较短,旁分泌作用可能在促进糖尿病创面愈合过程中起主要作用。
  第三部分 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨
  目的:探索羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合作用的机制
  方法:(1)体外分离培养巨噬细胞,通过IFN-γ、TNF-α刺激模拟创面M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化情况,观察羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞极化的作用,同时收集细胞行RT-PCR检测其基因表达,实验分组为:含10%胎牛血清的DMEM培养基+IFN-γTNF-α阳性对照组,含10%胎牛血清的DMEM培养基+羊膜上皮细胞条件培养基+IFN-γTNF-α组,含10%胎牛血清的DMEM培养基空白对照组。(2)体外培养人脐静脉内皮细胞,通过CCK-8试剂盒、Transwell小室以及成管试验来观察羊膜上皮细胞条件培养对于人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响,实验设计分为3组:含10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组,羊膜上皮细胞条件培养基组,高糖DMEM阴性对照组。
  结果:(1)应用羊膜上皮细胞条件培养基对于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬细胞可以减少细胞周围的细短树突状突起;羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞CD206(M2型巨噬细胞标志物)的表达量较空白对照组(P<0.01)和阳性对照组明显升高(P<0.01);而iNOS(M1型巨噬细胞标志物)的表达量较空白组(P<0.05)和阳性对照组明显降低(P<0.01)。(2)CCK-8试剂盒检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性显示,应用羊膜上皮细胞条件培养基处理组较阴性对照组能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖(P<0.01);Transwell小室检测迁移能力结果表明羊膜上皮细胞条件培养基处理组细胞个数较阴性对照组明显增多(P<0.01);通过成管实验检测细胞成管能力,结果显示羊膜上皮细胞条件培养基处理组成管个数较阴性对照组明显增多(P<0.01)。
  结论:羊膜上皮细胞可以明显提高人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力,还可以逆转巨噬细胞向M1型转化,同时可以促进M1型巨噬细胞向M2型细胞转化,并以此促进糖尿病创面的愈合。
[硕士论文] 高阳
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常。关于AF的具体发生机制尚未完全明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。大量研究表明,心房肌细胞内钙稳态异常,特别是钙泄漏是AF发生、发展的重要机制之一。而钙稳态主要受到心肌细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)上雷尼丁受体(Ryanodine receptor2,RyR2)的调控。RYR2作为最主要的钙释放通道,在心肌的舒张期应保持理想的关闭状态。如舒张期RyR2异常开放,会引起肌浆网的钙泄漏(Ca2+leak)增多,Ca+通过胞膜上的钠钙交换体(NCX)外排,产生异常的净内向阳离子移动,进而导致心肌细胞延迟后除极(Delayed afterdepolarization,DAD)。一旦达到心肌细胞兴奋的阈值,即可诱发自发性的动作电位(action potential,AP);如多处心肌细胞同步出现自发AP等异位电触发活动,在业已存在心房扩大或纤维化等心房重构基质的基础上,则可引发AF。晚近研究发现,RyR2的稳定性受到亲联蛋白(Junctophilin,JPH)-2(JPH2)的调控,JPH2可通过和RyR2结合对影响RyR2的稳定性。近来研究发现,快速心房搏动导致心肌细胞内钙浓度增加,可激活Calpain-Ⅰ,而且其激活程度随AF持续时间的延长而逐渐增高,因此推测,高频率心房搏动可导致心房肌细胞内Ca+超载,进而可能激活Calpain-Ⅰ,降解JPH2蛋白,导致钙泄漏增多,最终引发AF的发生。本研究拟通过临床及动物研究明确在AF发生中Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平的相关关系。
  研究目的:
  1、明确Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生的相关性;
  2、明确快速心房起搏通过诱导Calpain-Ⅰ/JPH2表达变化,影响钙稳态,导致房颤的发生。
  研究方法:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、研究对象
  选取在海军军医大学附属长征医院心脏外科行瓣膜手术的患者64例,所有患者签署手术知情同意书及剩余标本使用知情同意书。
  2、研究分组
  根据患者病史及术前心电图将患者分为两组:房颤组(AF组,n=32)和窦性心律组(SR组,n=32)。
  3、标本及临床资料采集
  收集手术中切除的左心房(LAA)及所有入院患者的一般临床资料。
  4、分子生物学指标检测
  (1)采用组织块酶消化及荧光染色的方法,评价心房肌细胞胞内钙离子浓度;
  (2)利用试剂盒检测不同分组心房肌组织Calpain-Ⅰ酶活;
  (3)性采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平:
  (4)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、兔AF模型的建立与鉴定
  (1)研究对象:成年新西兰大白兔,体重约2.0-2.5kg;
  (2)模型制备及实验分组:开胸将刺激电极缝合与左心耳表面,用阈上刺激连续刺激,观察刺激有效后关胸。手术组依据实验要求分为RAP组和RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组,RAP组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时予以腹腔注射二甲基亚砜制剂(DMSO,MDL28170的溶剂),连续给药4w。RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时腹腔注射带有MDL28170(Calpain-Ⅰ特异性抑制剂)的溶液,连续给药4w。假手术组仅进行开关胸操作,在术后1w后开始腹腔注射DMSO,连续给药4w;
  (3)模型鉴定:利用遥测系统记录兔AF发生情况及持续时程(>5min为持续性AF,<5min并且能够自行终止者为非持续性AF或阵发性AF)。
  2、标本采集
  术后5周处死实验动物,部分用于分离心肌细胞,部分用于分子生物学指标检测。
  3、分子生物学研究
  (1)利用试剂盒检测不同分组Calpain-Ⅰ酶活性;
  (2)采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平;
  (3)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (4)采用Langendorff灌流及荧光染色法,评价心房肌细胞内钙离子浓度:
  (三)统计学方法
  所有数据采用SPSS21.0进行统计分析,P<0.05表示差异存在统计学意义。
  研究结果:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、AF组与SR组患者一般临床资料无明显差异(P>0.05);但AF患者LAD明显大于SR组患者(53.97±8.37vs41.81±8.18,尸<0.05)。
  2、AF组心肌细胞内钙离子相关的荧光强度明显高于SR组,且AF组细胞内平均荧光强度明显高于SR组(20.56±1.98vs8.92±1.26,P<0.01)。
  3、以SR的OD值为基准,AF组Calpain-Ⅰ酶活性明显高于SR组(P<0.05)。
  4、以SR组的mRNA表达量为基准,AF组患者左心房肌组织中JPH2mRNA的表达水平与SR组差异无统计学意义(P>0.05)。
  5、AF组JPH2蛋白表达较SR组明显下调(0.53±0.14vs0.82±0.27,P<0.01);但AF组Calpain-Ⅰ蛋白表达较SR组显著上调(0.89±0.09vs0.46±0.09,P=0.015)。
  6、AF组左心房肌Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平呈现明显负相关(P<0.01)。
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的房颤发生率(P<0.01)。
  2、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的酶活性增加(P<0.01)。
  3、Calpain-Ⅰ抑制剂对JPH2mRNA表达水平无影响(P>0.05)。
  4、Calpain-Ⅰ抑制剂可抑制RAP导致的JPH2蛋白降解(P<0.05)。
  5、房颤兔心房肌中JPH2与Calpain-Ⅰ蛋白水平呈现负相关(P<0.01)。
  6、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的心肌细胞内钙离子浓度增加(P<0.01)。
  研究结论:
  (一)Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生密切相关;
  (二)Calpain-Ⅰ可通过降解JPH2蛋白,影响心房肌细胞内钙稳态,诱发房颤的发生。
[博士论文] 朱建伟
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:纤调蛋白(fibromodulin,FMOD)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白,参与组织器官修复中的ECM调节[16]。在肝纤维化过程中,纤维化组织FMOD表达增高,且能够诱导肝星状细胞的活化,进而增加肝星状细胞的增殖和侵袭能力[17],提示FMOD是肝纤维化的启动基因。因此,鉴于肝脏纤维化与胰腺纤维化有众多相似之处,以及肝星形细胞与PSCs在基因、形态及功能上具有高度的同源性[18],我们推测在CP中,FMOD能够激活PSCs细胞,进而引起胰腺纤维化。另外,FMOD又是一种OS敏感蛋白,在人成纤维细胞OS可诱导FMOD的表达。通过生物学信息软件分析发现,在FMOD启动子区域含有AP-1的结合位点,并且AP-1是MAPK信号通路的下游效应分子。因此在本研究中我们假设OS通过MAPK/AP-1信号通路诱导FMOD的表达激活PSCs,引起胶原纤维沉积,进而引起胰腺纤维化。
  第一部分:纤调蛋白在慢性胰腺炎患者血清中表达增高且能够诱导胰腺星状细胞的活化
  目的:探讨FMOD在CP患者血清中表达情况,及异常表达的FMOD能否引起静息状态的PSCs活化,及对影响PSCs生物学功能。
  方法:分别收集10例CP患者及10例正常人的血液样本,采用ELISA方法检测2组血清样本中FMOD蛋白的表达情况。合成FMOD过表达质粒、包装病毒构建稳定高表达FMOD的PSCs细胞系。采用PCR及WB方法检测过表达FMOD后PSCs活化标志物a-SMA的变化情况。采用CCK-8及迁移实验评价过表达FMOD对PSCs的功能的影响。
  结果:ELISA检测结果显示正常人及CP患者血清FMOD蛋白浓度分别为10.10±1.47,56.52±6.32;与正常人相比,CP患者血清FMOD蛋白浓度显著增高,(t=22.64,p<0.01)。PCR结果显示上调FMOD表达后,PSCs活化标志物a-SMA mRNA的相对表达量为1.81±0.08。与对照组相比,上调FMOD表达后a-SMA mRNA的相对表达量显著增加(p<0.01)。同样,WB结果也显示上调FMOD表达后,可引起PSCs中a-SMA的蛋白表达量增加。CCK-8结果显示,与对照组相比,上调FMOD表达后PSCs的增殖能力增加。迁移实验结果显示,与对照组迁移细胞数相比(9.2±2.0),上调FMOD表达后PSCs的迁移细胞数目显著增加(45.53±2.77;t=18.43,p<0.01)。
  结论:FMOD在CP患者中异常高表达,过表达的FMOD可诱导PSCs的活化,并维持PSCs的纤维化表型。因此明确CP纤维化过程中FMOD表达上调的分子机制可为抑制PSCs活化,终止CP纤维化进程提供新的药物治疗靶点。
  第二部分:OS诱导FMOD过表达促进PSCs活化
  目的:探讨OS能否诱导PSCs的活化,且OS诱导的PSCs活化是否依赖于FMOD的表达。
  方法:用促氧化剂甲萘醌(menadione,MND)处理静息状态的PSCs细胞,以等体积的DMSO作为对照,采用PCR及WB检测MND处理后PSCs活化标志物a-SMA的变化情况。合成FMOD-shRNA,构建稳定低表达FMOD的PSCs细胞系,采用PCR及WB检测下调FMOD表达后对MND诱导的PSCs活化的影响。并采用细胞免疫荧光实验进一步验证下调FMOD表达后对MND诱导的PSCs表达的a-SMA表达变化情况。
  结果:PCR结果显示MND处理静息状态的PSCs后,与等体积的DMSO组比,α-SMA及FMOD mRNA相对表达水平明显增加,FMOD及α-SMA mRNA相对表达量分别为3.39±1.17(P=0.036)、2.20±0.52(P=0.023)。WB结果也提示MND处理后FMOD及α-SMA的蛋白表达也明显增加。构建稳定低表达的FMOD细胞系后,PCR结果显示:下调FMOD表达后,MND促α-SMA表达作用明显下降,MND+FMOD-shRNA组和MND组α-SMA mRNA相对表达量分别为2.07±0.11vs.3.64±0.78(P=0.026);WB结果也显示与对照组相比,敲降FMOD后MND诱导的α-SMA蛋白表达量下降。细胞免疫荧光实验结果也显示与MND单独处理相比,MND+FMOD-shRNA组PSCs中α-SMA表达明显下降。以上结果提示MND通过启动FMOD的表达促进PSCs的活化。
  结论:OS在体外通过诱导FMOD的表达促进人源性PSCs的活化。
  第三部分:OS通过MAPK/AP-1信号通路上调FMOD的表达诱导PSCs
  目的:探讨OS是通过何种机制上调FMOD表达进而诱导PSCs活化的。
  方法:用MND处理PSCs细胞,以等体积的DMSO作为对照,采用WB检测MND处理PSCs后,MAPK三条经典信号通路P-38/p-P-38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK的蛋白表达情况。用MND处理PSCs细胞,同时采用ERK、JNK、P38通路特异的抑制剂(U0126、SP600125、SB2021906)处理PSCs细胞,采用WB方法检测FMOD、α-SMA、MAPK三条经典信号通路的蛋白表达变化情况。构建AP-1过表达质粒,并转染PSCs细胞,采用WB检测过表达AP-1后,PSCs细胞FMOD表达情况。采用双荧光素报告酶实验及染色质蛋白免疫共沉淀(ChIP),探究AP-1是否通过直接与FMOD启动子区域结合诱导FMOD的表达。
  结果:MND处理后,WB结果显示与对照组相比,MND组的p-P-38、p-ERK、p-JNK蛋白表达增加。联合特异的抑制剂处理后,WB结果显示与MND处理组相比MND+SB2021906组相对MND组FMOD表达无明显变化,MND+U0126组及MND+SP600125组FMOD的表达较MND组明显降低。生物信息分析软件(rVISTA)分析的转录因子数据库TRANSFAC Professional,结果显示在距FMOD第一外显子1.1kb的区域含有AP-1结合位点,且过表达AP-1后,FMOD的蛋白表达水平增高。荧光报告素酶实验结果显示与对照组相比,AP-1表达质粒组荧光强度明显增加(6.25±1.52vs.1.00±0.23,P<0.001)。ChIP实验结果显示AP-1表达质粒组,检测到FMOD启动子区域片段,且富集度较阴性对照组显著升高(34.51±2.26vs.1.06±0.11,P<0.001)。
  结论:OS通过MAPK/AP-1信号通路上调FMOD的表达诱导PSCs。
  第四部分:体内检测CP中FMOD、OS、MAPK信号通路的变化情况及FMOD表达与胰腺纤维化的关系
  目的:在DBTC诱导的大鼠CP模型中检测CP中FMOD、OS、MAPK信号通路的变化情况及FMOD表达与胰腺纤维化的关系。
  方法:采用DBTC鼠尾静脉注射的方法构建CP模型,用HE染色明确造模是否成功,采用Sirius-Red染色明确胰腺纤维化程度,免疫组织化学染色的方法检测CP胰腺组织中FMOD的表达情况,用MDA检测试剂盒检测CP和正常胰腺组织中MDA的含量变化情况。提取CP和正常胰腺组织中蛋白,WB检测FMOD、α-SMA、P-38、p-P-38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK的蛋白表达变化情况。
  结果:DBTC静脉注射4周后,CP组存活率为70%,VC组为100%;造模2周后CP组体重明显低于对照组,2周体重(222.46±3.40vs.232.10±5.96,P=0.02),3周体重(231.46±6.94vs.251.74±6.01,P<0.01),4周体重(233.14±6.69vs.263.74±7.55,P<0.01)。HE染色结果显示CP组胰腺腺泡萎缩、小叶间出现大量的纤维组织及炎症细胞。Sirius-Red染色后,CP组可见除血管及胰管周围外,有大量鲜红色条索状及网状的胶原纤维沉积于小叶间隙和腺泡间,而对照组仅在血管及胰管周围有少许纤维沉积,两组之间染色面积有显著差异(CP:vs.对照,0.46±0.07vs.0.08±0.03,P<0.01)。免疫组化评分结果显示与对照组相比,FMOD表达升高。检测组织中MDA含量,发现CP组MDA含量明显高于对照组(2.63±1.42vs.1.50±0.64,P=0.046)。WB结果显示,与对照组相比,CP组FMOD、α-SMA、p-P-38、p-ERK、p-JNK表达显著上调。
  结论:在大鼠CP模型中,胰腺组织中FMOD表达增高。OS在胰腺组织中表达增高且其下游信号通路MAPK激活。
[硕士论文] 周桑
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:通常认为哺乳动物缺乏心脏再生能力,因心梗等原因导致心肌损伤时可出现心力衰竭及一系列并发症,甚至发展至难治性心衰。对于难治性心衰患者,仅有心脏移植治疗可得到较好的预后,心脏供体的来源稀少及经济负担的沉重限制了心脏移植的应用,急性失代偿期心衰患者的1年内死亡率高达30%。2009年Bergmann依据大气层C14浓度的变化,证明了人的心肌细胞存在一定程度的再生能力,但再生的速率极低,成人心肌细胞的年再生速率约为0.5-1%,无法在心肌细胞大量损伤(如心肌梗死)后补充足够的心肌细胞。
  如何促进人体内心脏再生速率,找到心脏再生的关键调控点成为了心脏再生领域研究热点。而microRNAs及其靶基因在心脏再生信号通路及信号网络中的广泛参与使其成为了较好的切入点和潜在的药物作用靶点。Beauchemin报道miR-101a通过靶基因cfos调节心脏再生过程,Yin等人通过微阵列分析发现miR-133在斑马鱼心脏再生期间表达下降,而抑制miR-133的表达可通过上调细胞连接蛋白cx43促进心脏再生。另外Hosoda等发现miR-499可通过缝隙连接在细胞间传输,调节心脏祖细胞向成熟心肌细胞的分化。研究者报道miR-1受MyoD和Mef2的直接调控,既可降低Notch蛋白的表达,又可抑制靶基因Hand的表达,而Notch信号和Hand均是心脏再生重要的参与者,而Notch信号的调控者除了miR-1外,还有miR-34、miR-124、miR-19a、MicroRNA-21-5p、miR-100、miR-126等。另外有研究者发现心脏部分切除引起的心肌细胞缺氧状态是心脏再生的启动信号,而非心脏部分切除本身,而缺氧的直接效应分子缺氧诱导因子HIFs可作用于JAK-STAT通路,JAK阻断剂可使microRNA(miR-1、miR-133、miR-208、miR-499)介导的小鼠成纤维细胞向心肌样细胞转化的效率大大提高。但是目前心脏再生领域的研究仍未成功逆转心衰,寻找心脏再生的关键靶点需要更多的研究。
  本研究意在通过观察斑马鱼和出生7天之内的乳鼠和心脏再生时microRNA表达谱的变化,通过初步的筛选和验证,选出斑马鱼心脏再生和出生7天内乳鼠心脏再生过程中的变化明显的microRNA及其关键靶基因并研究该microRNA及其靶基因在心脏再生中的作用。
  第一部分 斑马鱼心脏再生模型的建立
  目的:建立稳定、可靠的斑马鱼心脏再生研究平台,探讨斑马鱼麻醉过程中三卡因浓度对其心脏手术后生存率的影响。
  方法:以经典实验方法中的三卡因(MS-222)浓度150mg/L为对照,分别用浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L的MS-222麻醉液麻醉,将麻醉好的鱼体倒置在斑马鱼固定海绵内,显微镜下使用维纳斯剪分离胸部组织暴露斑马鱼心脏,在心尖切除其心室的20%左右,观察斑马鱼术后行为及术后生存率的差异。
  结果:斑马鱼心脏切除面积的大小和斑马鱼术前麻醉深浅等影响着斑马鱼心脏部分切除术后生存率的高低,实验中首先根据术前麻醉时斑马鱼的入麻行为及术后行为定义了斑马鱼的麻醉分级。随着MS-222浓度的提高,斑马鱼表现为入麻时间的逐渐减少、苏醒时间的逐渐增加。MS-222麻醉斑马鱼成鱼的有效浓度为40~160mg/L,在此浓度范围内,鱼体能够在3min内达到可施行手术操作的麻醉状态(Ⅱ或Ⅲ期),10min内可苏醒恢复;在有效浓度范围内,随着浓度的增大,斑马鱼的术后存活率逐渐下降;在经典麻醉浓度下,斑马鱼术后存活率为68.33%,当MS-222浓度为40mg/L时斑马鱼的术后存活率最高(98.3%),MS-222浓度为200mg/L时斑马鱼的术后存活率最低(63.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:成功构建斑马鱼心脏再生模型,并对切除面积,斑马鱼鱼龄等参数进行了优化,当MS-222浓度为40mg/L,心室切除面积为20%时,斑马鱼入麻及苏醒较为平稳,术后斑马鱼复苏时间较短,且保持了较高的术后生存率。在实验操作或者生产应用时推荐MS-222麻醉药液最佳麻醉浓度为40mg/L,所对应的麻醉时间约为15分钟左右。
  第二部分 MicroRNA在斑马鱼心脏再生中的表达谱分析及验证
  目的:筛选并验证在斑马鱼心脏再生中表达差异明显的microRNA。
  方法:将斑马鱼分为手术组与假手术组,分别进行心脏部分切除术和假手术(仅打开胸腔),术后第10d提取RNA进行microRNA的高通量测序,包含心脏假手术组和心脏部分切除后10d组各-3本(每个样本6鱼)。根据高通量测序结果,分别针对变化明显的microRNA对斑马鱼心脏部分切除后第3、7、10、15、60d心脏RNA进行定量PCR检测。选择变化最为明显的microRNA并通过生物信息学检索和文献分析,预测该microRNA的靶基因,建立乳鼠原代心肌细胞的培养方法,利用缺氧诱导心肌细胞增殖,通过RT-PCR验证高通量测序结果及靶基因预测结果。选择变化明显的靶基因,通过荧光素酶报告基因实验验证microRNA与预测靶基因的相关关系。
  结果:完成斑马鱼心脏再生模型中microRNA表达谱的高通量测序,对比心脏再生组与对照组之间,明显上调的microRNA有:microRNA-21-5p,microRNA-2188-5p,microRNA-19-5p,microRNA-199-3p,microRNA-731-5p,microRNA-222b-3p。明显下调的microRNA有:microRNA-301c-5p,microRNA-100-2-3p,microRNA-92b-3p。RT-PCR验证结果提示microRNA-301c-5p下调最为明显(0.29倍,第3d)和microRNA-21-5p上调最为明显(8.57倍,第7d)。同时通过生信分析,利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA四个数据库的重合结果及文献检索,选择了Dnm11、Arhgap24、Cacybp、Alx1、per2、pitx2、Pja2等为mo-microRNA-21-5p的预测靶基因。建立乳鼠心肌细胞的原代培养方法,通过低氧诱导心肌细胞增殖,重新验证高通量测序结果及靶基因预测结果,发现MicroRNA-21-5p水平的上调与Alx1和pja2的下调具有时间相关性。通过双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  结论:在斑马鱼心脏再生中及低氧诱导乳鼠原代心肌细胞再生过程中microRNA-21-5p上调明显,同时microRNA-21-5p水平的上调与其预测靶基因Alx1和Pja2的下调具有时间相关性。双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  第三部分 microRNA-21-5p及Pja2在乳鼠心脏再生中的作用和机制
  目的:建立稳定的乳鼠原代心肌细胞培养体系,探讨过表达及敲低microRNA-21-5p和Pja2对于乳鼠心脏再生过程的影响。
  方法:设计并合成microRNA-21-5p的mimic和inhibitor、Pja2和Alx1的siRNA,转染乳鼠原代心肌细胞并验证其过表达和沉默效率,以EDU作为心肌细胞增殖指标,通过免疫荧光实验检测乳鼠心肌细胞增殖水平的变化。根据实验结果,合成microRNA-21-5p敲低腺病毒及Pja2过表达腺病毒进一步验证。
  结果:乳鼠原代心肌细胞转染mir21-5p inhibitor后,mir21-5p表达水平降低同时Pja2表达水平升高,;转染mir21-5p mimic后,mir21-5p表达水平升高同时Pja2表达水平降低;转染Pja2siRNA后,Pja2表达水平明显降低,但mir21-5p表达水平无明显差异。免疫荧光显示microRNA-21-5p mimic过表达microRNA-21-5p使心肌细胞增殖率增加了45.3%(P<0.05);microRNA-21-5p inhibitor使心肌细胞增殖率降低了44.5%(P<0.05);siRNA沉默Pja2使心肌细胞增殖率增加了64.73%(P<0.05);siRNA沉默Alx1对心肌细胞增殖率没有显著影响,microRNA-21-5p敲低腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率降低了53.2%(P<0.05),Pja2过表达腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率下降了76.5%(P<0.05)。MicroRNA-21-5p对心肌再生的促进作用可能是通过抑制Pja2表达实现的,而Alx1虽受microRNA-21-5p的调控,但并不参与心脏再生过程。
  结论:在乳鼠心肌细胞增殖过程中,microRNA21-5p可调控Pja2的表达,并促进心肌细胞增殖水平;而直接敲低Pja2对心肌细胞再生也有明显促进作用,但对microRNA21-5p的表达没有明显影响。下调microRNA-21-5p可使乳鼠心肌细胞增殖水平明显降低,microRNA-21-5p对乳鼠心脏再生的调节作用可能是通过抑制Pja2的表达实现的。抑制Pja2表达对心脏再生明显的促进作用提示Pja2可成为新的药物作用靶点。
[硕士论文] 高斌
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:动脉粥样硬化相关的心血管疾病是目前全球各地区的第一死因,在西方国家,约有(10%)的人死于动脉粥样硬化相关疾病及其引起的并发症,而在多数医疗水平低下的国家,目前已经超越了感染性疾病的危害。动脉粥样硬化可导致多种临床表现,包括短暂性脑缺血发作(Transient cerebral ischemic attacks,TIA)、主髂动脉闭塞及冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)等。虽然其临床症状多样,但病变本身具有普遍共性,即它们都表现为动脉管壁大量胆固醇酯的沉积及复杂的进展型斑块的形成,最终导致动脉相应供血区缺血性改变。颈动脉狭窄(carotid stenosis)因影响大脑血供而备受关注,其中90%由颈动脉粥样硬化引起,它能够引起颅内缺血并产生相应的临床症状,如黑蒙、视物模糊、偏瘫失语等,致残与致死率很高,患者一般无法自理,因而带来巨大的社会及经济负担。颈动脉狭窄通常起病隐匿,往往出现脑缺血症状后才被发现。目前普遍认为,导致脑缺血症状出现的原因主要有两个:一是动脉粥样硬化斑块不稳定,斑块破裂或表面继发的血栓脱落导致急性脑栓塞;二是动脉狭窄造成远端脑组织血流低罐注。近年来研究表明,斑块成分脱落是引起缺血性脑卒中最主要的原因,而颅内动脉低灌注导致卒中的较少。因此,研究颈动脉斑块稳定性,探索早期预测不稳定斑块的生物标记物及其作用机制具有重要意义,能够有效降低脑卒中等不良事件的发生。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度在200nt以上,不具备编码蛋白质功能的RNA。许多研究结果证实,多种lncRNA在血管疾病中发挥重要作用,在动脉粥样硬化性疾病的发生及进展中,lncRNA通过调节血管壁功能、激活巨噬细胞、调节脂质代谢及免疫炎症反应等多个环节调控疾病的发生与进展。但目前尚无明确报道hncRNA在颈动脉斑块稳定性中的作用及机制。
  目的:
  我中心前期应用基因芯片的方法,得到了稳定及不稳定颈动脉斑块中差异表达的lncRNA及mRNA,其中lncASAP2-7∶1差异表达倍数高,我们选择lncASAP2-7∶1作为深入研究的靶标,下一步将验证lncASAP2-7∶1在不同稳定性颈动脉斑块中的差异性表达,并检测斑块中lncASAP2-7∶1含量与纤维帽厚度及脂质核心区等斑块主要成分的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7∶1的生物学功能,进一步通过细胞实验验证lncASAP2-7∶1在调控血管平滑肌细胞功能中的作用及可能的作用机制,进而说明lncASAP2-7∶1在斑块稳定性中发挥的调控作用。
  方法:
  (1)临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月年于海军军医大学附属长海医院住院行颈动脉内膜切除术(carotid endanerectomy,CEA)患者的颈动脉斑块标本。将收集到的颈动脉斑块标本切成小段分开保存,一部分标本液氮冻存用于提取斑块中RNA,通过realtime PCR验证基因芯片中lncASAP2-7∶1差异性;一部分存放于福尔马林溶液中,然后石蜡包埋切片行HE染色,电镜扫描判断斑块稳定性、测量纤维帽厚度及脂质核心区面积等。最后,统计分析斑块中lncASAP2-7∶1相对表达量与斑块成分之间的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7∶1可能的生物学功能。医院伦理审查委员会评审并批准了此项研究,所有患者均知情同意。
  (2)细胞实验研究:包装lncASAP2-7∶1过表达及干扰的慢病毒,通过慢病毒转染人主动脉平滑肌细胞,实验分组为lncASAP2-7∶1上调组、上调对照组、下调组、下调对照组及正常空白对照组。采用细胞划痕实验检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞的迁移功能,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Ⅰ型胶原蛋白含量,进而反映lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞合成分泌蛋白的功能,采用流式凋亡检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞凋亡功能,CCK8(Cell Counting Kit-8)及流式细胞周期检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞增殖功能。
  结果:
  1.临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月于长海医院血管外科行颈动脉内膜切除术的颈动脉斑块标本22例,其中不稳定斑块11例,稳定斑块11例。不稳定斑块lncASAP2-7∶1相对表达量为6.679±5.883,稳定斑块lncASAP2-7∶1相对表达量为1.192±0.583,Real-time PCR结果提示lncASAP2-7∶1在不稳定斑块中的相对表达量明显高于稳定斑块(p<0.0001)。不稳定斑块纤维帽厚度为120.80±31.29μm,稳定斑块纤维帽厚度为163.51±34.34μm,不稳定斑块脂核所占比例为33.45%±9.76%,稳定斑块脂核所占比例为27.84%±7.38%。稳定斑块纤维帽厚度明显高于不稳定斑块(p<0.01),两组斑块脂核所占比例无明显统计学意义。颈动脉斑块中lncASAP2-7∶1相对表达量与纤维帽厚度存在负相关(r=-0.667,p<0.01),与脂核所占比例无明显相关性(r=0.340,p>0.05)。生物信息学预测结果提示,lncASAP2-7∶1可能参与了细胞迁移、分泌及细胞内蛋白质转运等生物学过程。
  2.细胞实验研究:利用包装lncASAP2-7∶1过表达及干扰的慢病毒干预人主动脉平滑肌细胞,分别验证了血管平滑肌细胞的迁移、分泌、增殖、凋亡功能,发现lncASAP2-7∶1高表达可以明显抑制血管平滑肌的迁移及Ⅰ型胶原蛋白的合成,在细胞增殖及凋亡中无明显作用。
  结论:
  lncASAP2-7∶1在不稳定斑块中表达量明显高于稳定斑块且与斑块中纤维帽厚度呈负相关,细胞实验证实lncASAP2-7∶1高表达抑制了血管平滑肌细胞的迁移及分泌Ⅰ型胶原蛋白的功能,影响了纤维帽的厚度,导致斑块不稳定,继发脑卒中等不良事件。
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