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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[硕士论文] 王文静
内科学(风湿免疫学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:成人斯蒂尔病(AOSD)是一种可累及多个系统的自身免疫性炎症性疾病,发病率较低,较难诊断。它主要表现为反复发作的高热(≥39℃)、关节炎或关节痛、一过性红色皮疹及白细胞和铁蛋白显著增高。AOSD合并巨噬细胞活化综合征(MAS)是风湿免疫科的危急重症,是临床诊治的难点。目前AOSD的治疗可选择非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、缓解病情抗风湿药物(DMARDs)、生物制剂及免疫球蛋白等。以往学者将AOSD分为系统型和多关节炎型,但这种分型并不能有效区分临床表型并进一步指导临床策略。近来根据AOSD的转归,有学者提出了三种疾病模式:①单循环型:一次典型发作后经治疗可达到长期缓解,预后良好;②多循环型:疾病反复复发,但复发症状较首发症状轻微,逐渐达到完全缓解;③慢性关节炎型:疾病活动及关节症状持续存在,严重时可出现关节破坏。研究不同疾病模式AOSD临床特征的差异,探索AOSD疾病模式的分类方法,以及合并MAS可能的风险因素,对于早期诊断和治疗方案选择具有重要的意义,但目前我国尚无此类研究。
  目的:
  分析不同疾病模式的AOSD的临床特点,研究各模式分类诊断的合适指标及临界值,并探索AOSD合并MAS的可能风险因素,为优化临床诊治提供资料和依据。
  方法:
  本研究为回顾性研究。研究纳入2001年1月至2016年12月海军军医大学附属长海医院确诊成人斯蒂尔病的全部患者的病例资料(共162例),其中10例并发MAS。成人斯蒂尔病的诊断依据Yamaguchi标准。收集以下数据:1)人口学信息:发病年龄、性别、确诊时间;2)临床表现:最高体温、发热时长、有无皮疹、关节痛/关节炎及部位、有无肌痛、咽喉痛、淋巴结病、肝肿大、脾肿大、胸膜炎、心包炎等;3)实验室检查:血常规、肝肾功能、血脂、电解质、C反应蛋白、红细胞沉降率、炎症因子、免疫球蛋白、铁蛋白、凝血功能、降钙素原等;4)治疗情况:确诊前后用药情况。由高年资医师根据患者的预后转归情况,将病例分为单循环型、多循环型和慢性关节炎型3组。采用单因素和多因素方差分析和非参数检验的方法比较不同疾病模式下临床特征的差异性,利用受试者运算特征(ROC)曲线探索不同疾病模式分类诊断的合适指标及临界值,并利用二元logistics回归模型,分析AOSD合并MAS可能的风险因素。
  结果:
  本回顾性研究纳入2001年1月1日至2016年12月31日海军军医大学附属长海医院住院部162名AOSD患者,其中单循环型98例,多循环型57例,慢性关节炎型7例。男女比例为1∶2.24,发病年龄平均值(40.3±14.9)岁,确诊时间中位数为4(2,8)周;最高体温和发热时长的中位数分别为39.7(39.0,40.0)℃和4(3,8)周;WBC计数的为中位数为14.4×109/L(11.0×109/L,19.7×109/L),中性粒细胞百分比的中位数为83.2%(78.5%,89.4%);ALT、AST、ALP、球蛋白、LDH和纤维蛋白原的中位数分别为44.5(20.0,100.3)U/L、43.0(23.8,85.5)U/L、91.0(68.8,134.8)U/L、32.3(29.0,37.0)g/L、410.0(266.8,531.3)U/L和5.7(4.6,6.5)g/L;IgG和CRP的中位数分别为14.0(12.2,17.0)g/L和83.6(31.9,128.0)mg/L;ESR、C3、C4的均值分别为(74.1±33.4)mm/H、(1.3±0.4)g/L和(0.3±0.1)g/L;铁蛋白大于2000ug/L的比例为64.8%,RF阳性的比例占6.8%,ANA阳性的比例占9.9%。
  单因素分析发现,三种疾病模式在确诊时间、最高体温、发热时长、体重下降、关节肿痛的发生率、谷氨酸氨基转移酶升高和类风湿因子阳性上率有显著差异,而多因素分析发现三种疾病模式在在确诊时间、发热时长、肌痛和皮疹的分布上有显著差异,P值均小于0.05。单循环型和多循环型AOSD患者使用抗生素的比例显著高于慢性关节炎型,三种疾病模式的患者确诊后不同治疗药物的比例没有显著差异。
  利用受试者运算特征(ROC)曲线计算曲线下面积(AUC),发现对于三种疾病模式较好的诊断指标为分别为ALT/IgM、铁蛋白×ESR和IgG,当患者ALT/IgM大于81.25U/g时,诊断为单循环型AOSD的可能性较大;当患者铁蛋白×ESR大于1.05×105时,诊断为多循环型AOSD的可能性较大。
  采用二元Logistics回归分析,发现多循环型AOSD、肝脏肿大及纤维蛋白原降低可能是AOSD合并MAS的风险因素。
  结论:
  单循环型、多循环型和慢性关节炎型三种疾病模式的AOSD患者在确诊时间、发热时长等临床特征上具有显著差异,ALT/IgM、和铁蛋白×ESR可能有助于区分AOSD疾病模式,多循环型AOSD、肝脏肿大及纤维蛋白原降低提示AOSD患者可能有合并MAS的风险。
[硕士论文] 尹剑蓉
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:烟曲霉(Aspergillus fumigatus,Af)是一种机会致病菌,广泛存在于水、土壤、空气、植物等自然界环境中,在有机碎片上生存和生长。目前,烟曲霉已成为最普遍的空气传播真菌病原体,它孢子量丰富,每个分生孢子头生产数以千计的分生孢子,释放到大气中的分生孢子的直径足够小到可达肺泡。环境调查显示,所有人类每天至少会吸入几百个烟曲霉分生孢子。免疫功能正常的人吸入烟曲霉孢子后几乎不会致病,因为肺部先天免疫机制可以有效清除孢子。过敏体质者吸入烟曲霉孢子可触发IgE介导的变态反应从而引起哮喘、变态反应性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎等曲霉病。免疫功能抑制的患者吸入烟曲霉孢子后,易发展为侵袭性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)。侵袭性曲霉病是免疫功能低下患者中最严重的感染性疾病之一,特别是在骨髓移植和实体器官受者中。由于移植数量的增加,血液系统疾病和实体瘤新型加强化疗方案的发展,艾滋病以及免疫抑制剂使用的大大增加,近年来侵袭性曲霉病的发病率急剧升高,同时诊断该病较为困难,真菌病原体检出率不高,此外目前临床上所用的抗真菌药物副作用大,治疗效果不明显,因此很难将患者体内的烟曲霉彻底清除,这导致了侵袭性曲霉病的死亡率极高,可高达50%~95%。因此,研究烟曲霉感染的致病机制,寻找新的相关治疗靶点,以及进一步探究并制定有效的治疗方案刻不容缓,是目前针对烟曲霉感染亟待解决的重要课题。
  机体的抗真菌免疫应答在烟曲霉感染中至关重要,烟曲霉主要侵入机体引起细胞免疫应答,包括先天性免疫应答和适应性免疫应答。先天性免疫应答是机体通过定殖在肺部的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞的直接吞噬作用来抵御烟曲霉感染的第一道防线,上述细胞亦可分泌并释放一系列细胞因子和趋化因子,从而引起相关机体炎症反应来清除烟曲霉孢子和菌丝。随着烟曲霉感染进一步发展,抗原提呈细胞(Antigen presenting cells,APC)将烟曲霉抗原递呈给CD4+T细胞,继而引发适应性免疫应答。经APC活化后的CD4+T细胞进一步分化为辅助性T细胞(T helper cells)介导体内抗真菌免疫应答,因此Th细胞在烟曲霉感染性疾病中起到尤为关键的作用。Th1细胞主要分泌细胞因子IFN-γ(Interferon-γ),介导机体产生保护性抗真菌免疫应答;Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4(Interleukin-4)和IL-10(Interleukin-10),激活机体产生体液免疫;Th17细胞主要分泌细胞因子IL-17(Interleukin-17),促进中性粒细胞的募集从而对烟曲霉进行有效清除。大量研究证实,Th17细胞介导机体产生抗真菌免疫应答,并且Th17细胞和细胞因子IL-17引起的免疫反应与烟曲霉感染后的机体内应答具有紧密的关系。然而,作为后期新发现加入到Th细胞亚群中的一员,Th17细胞介导机体抵御烟曲霉感染而产生的抗真菌免疫应答的调控机制尚不十分清楚,有待进一步相关研究。
  近年来一系列的研究强调了microRNA(miRNA)的重要性,其相关功能和作用机制不断地在各种疾病中被研究和探讨。miRNA是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,其长度约18-25个核苷酸,可以通过靶向结合并断裂目的mRNA或抑制目的mRNA的蛋白质翻译的作用,从而在转录后水平上负调控目的基因的表达。众多研究证实了miRNA在免疫细胞的分化发育和调控免疫应答的过程中发挥至关重要的作用。miRNA参与CD4+T细胞发育与分化的调控,如miR-155通过抑制IFNγRα的表达来抑制Th1细胞分化;miR-17~92a簇是有效的Th1细胞分化所必需的,miR-17和miR-19b是重要的特异性miRNA;miR-21通过抑制Spry1的表达来促进Th2细胞分化;miR-29a抑制Th1细胞分化和细胞因子IFN-γ产生等等。已经发现多个miRNA促进Th17细胞分化,如miR-155通过抑制转录因子Ets1促进Th17细胞分化;miR-301通过抑制STAT3信号传导的负调节因子PIAS3参与Th17细胞分化等等。由此可知,miRNA通过调控辅助性T细胞的分化发育和相关细胞因子的分泌生成,可以促进或者抑制机体产生抗感染免疫反应。此外,miRNA在烟曲霉感染的发病机制和机体对烟曲霉感染后引起免疫反应的调节作用研究甚少,鲜有报道。因此,本研究的目的是研究和探讨烟曲霉反应性CD4+T细胞中差异表达的miRNA及其相关靶基因对烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化的调控机制。
  第一部分:烟曲霉诱导CD4+T细胞中miR-17-5p的表达上调并向Th17细胞分化
  先采用热灭活的烟曲霉体外刺激正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),培养24小时后磁珠分选出CD4+T细胞即为烟曲霉反应性CD4+T细胞。根据实验室课题组前期的miRNA芯片检测结果,挑选出在烟曲霉反应性CD4+T细胞中表达上调的miR-17-5p进行研究,同时采用qPCR对芯片结果中下调的miR-17-5p进行验证,验证结果与芯片结果保持一致。结果发现:miR-17-5p在烟曲霉反应性CD4+T细胞中的表达增多,约为对照组的1.49倍(P<0.05)。随后采用流式细胞术和qPCR分别检测烟曲霉反应性CD4+T细胞的分化和细胞因子表达的情况。结果发现:经烟曲霉诱导后CD4+T细胞向Th17细胞分化明显增多,并且细胞因子IL-17的表达也明显增多,约为对照组的7.19倍(P<0.05)。
  第二部分:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的表达水平对Th17细胞分化的影响
  为了进一步了解烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的上调是否与Th17细胞分化相关,向PBMC中转染miR-17-5p mimic以及miR-17-5p inhibitor,转染24小时之后再给予热灭活的烟曲霉刺激,培养24小时后磁珠分选出CD4+T细胞。结果发现:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p的表达水平与Th17细胞分化和IL-17生成呈正相关,转染miR-17-5p mimic促进Th17细胞分化和IL-17生成(P<0.05),而转染miR-17-5p inhibitor抑制Th17细胞分化和IL-17生成(P<0.05)。由此可见烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p具有调控Th17细胞分化的能力。
  第三部分:烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p通过作用于靶基因PTEN促进Th17细胞分化
  首先通过多个靶基因预测网站预测miR-17-5p的靶基因,经分析后选择与Th17细胞分化相关的靶基因PTEN,然后分别通过qPCR、Western Blot和荧光素酶报告基因技术验证miR-17-5p与PTEN mRNA的3'UTR确实存在相互作用关系。为了探讨miR-17-5p调控Th17细胞分化是否是通过作用于靶基因PTEN来实现的,设计并合成PTEN siRNA沉默PTEN的表达。结果发现:转染PTEN siRNA24小时后,烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化增多,同时IL-17生成增多(P<0.05)。由此可见烟曲霉反应性CD4+T细胞中miR-17-5p是通过作用于靶基因PTEN从而促进Th17细胞分化。
  综上所述,本研究发现烟曲霉可通过诱导CD4+T细胞中miR-17-5p的表达上调,且miR-17-5p可通过作用于靶基因PTEN进一步调控烟曲霉反应性CD4+T细胞向Th17细胞分化以及生成IL-17增多。这种作用机制可能与PTEN参与的PI3K-AKT信号通路相关,故miR-17-5p可能是通过这种调控机制来参与机体的抗真菌免疫应答。
[博士论文] 俞旭华
航海与潜水医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:减压病(decompression sickness,DCS)是威胁潜水等高气压作业和航空航天等活动安全的关键医学问题,快速减压过程和减压后惰性气体过饱和生成的气泡是引起DCS发病的根本原因。传统观点认为,气泡的机械作用,如栓塞作用、剪切力作用、机械压迫作用是导致DCS形成的根本原因。随着研究的深入,越来越多的证据表明气泡作为外源性物质可触发体内一系列生化及炎症反应,如血小板聚集、白细胞激活、细胞因子释放等,诱发血管内凝血及炎症反应,导致血栓形成,组织缺血水肿,炎细胞渗出,这可能在DCS的发生和发展中发挥更为重要的作用。
  微粒(microparticles,MPs)是细胞在激活或凋亡早期以出芽方式分泌的直径约0.1~1μm不规则囊性小泡。MPs表面可携带母细胞表面抗原,其内容物含有浓集细胞因子、信号蛋白、mRNA和microRNA。作为细胞间生物信号和信息传递的载体,MPs可将其胞内成分转移至靶细胞,介导靶细胞活化、表型修饰、及功能调节。内皮细胞来源的MPs,即内皮微粒(endothelial microparticles,EMPs)不仅是内皮损伤的重要指标,在介导内皮功能障碍中同样发挥显著的致病作用。EMPs在血管炎症、血管舒缩功能、血管生成等方面发挥多重作用。诸多生理及病理因素均可激活或损伤内皮细胞,导致EMPs的产生与释放。Madden等研究发现,潜水员完成潜水作业返回水面后,循环中EMPs数量显著增加,提示血管内皮功能损伤。Thom等通过一系列人体试验发现,潜水员经不同方案潜水后,循环MPs数量和多普勒超声检测的血管内气泡信号强度呈正相关;小鼠经模拟潜水后快速减压,循环血液中各亚型MPs的数量均显著增加,并通过激活血小板和中性粒细胞增加血管内白细胞粘附,进一步加重DCS血管炎性损伤,甚至可导致DCS中枢神经系统损伤。如提前给予MPs消融剂聚乙二醇,则可显著降低DCS所致血管炎性损伤。上述研究结果表明MPs可能在DCS血管炎性损伤中发挥重要的致病作用。
  本课题组前期研究发现,大鼠模拟潜水后快速减压,循环内EMPs显著增加,同时伴有脑、骨骼肌和大网膜中中性粒细胞显著滞留现象,提示广泛的血管炎症反应;如在潜水前给予内皮保护剂辛伐他汀后,可显著降低DCS发病率,减轻肺组织炎性损伤,同时循环内EMPs数量增幅显著下降,各组织器官中性粒细胞滞留程度显著下降。因此,我们推测在DCS的发病过程中,气泡通过直接触碰或改变血液层流剪切力,导致血管内皮细胞被激活或损伤,产生和释放EMPs并进一步诱发血管炎症损伤级联放大效应。
  为观察DCS气泡诱导的EMPs在血管炎性损伤中的确切效应,我们通过自制的微气泡生成装置模拟DCS气泡对内皮细胞的刺激作用,检测气泡刺激后培养液中EMPs生成数量的情况,判断血管内皮损伤的程度;在细胞及动物水平分别观察气泡刺激诱导的EMPs对血管内皮的损伤效应(第一部分)。在明确气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放并进一步对内皮细胞产生损伤效应后,本课题组进一步探索气泡诱导EMPs产生的分子机制,寻找其中的关键信号分子,从而为DCS的防治寻找新方法与新思路(第二部分)。此外,针对DCS致病的根本原因——气泡,寻找促进气体交换、减少气泡生成的方法,为DCS的防治寻找新的的非加压治疗手段。
  第一部分:气泡诱导的内皮微粒对内皮细胞的作用研究
  研究目的与方法:本研究以原代培养的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)为研究对象,通过自制的气泡发生装置,将气泡与PMVECs接触30 min后,继续培养6h,后收集培养液。4℃,10000 g×30min离心,去除细胞碎片,收集上清;4℃,100000 g×60min离心,弃去上清。1×PBS重悬,流式细胞法检测EMPs的数量。在明确气泡刺激诱导EMPs产生与分泌的效应后,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育或经尾静脉注射入大鼠体内,在体与离体条件下分别观察内皮损伤相关指标的变化情况。此外,将EMPs与含氟表面活性剂FSN-100共孵育,观察FSN-100对EMPs的消融作用。
  研究结果:本课题组成功分离与培养出纯度大于95%的大鼠PMVECs并用于后续实验。流式结果显示气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放,将气泡诱导的EMPs与正常PMVECs共孵育后,内皮细胞活性显著下降(存活率下降,凋亡率上升)。内皮细胞产生与分泌细胞间粘附分子(ICAM-1)和血管内皮粘附分子(VCAM-1)显著增加,内皮细胞内活性氧(ROS)产生增加、一氧化氮合成(NO)减少,细胞间紧密连接下降,内皮通透性增加。在体实验中,大鼠循环内皮损伤指标可溶性血栓调节蛋白(s-TM)及粘附分子ICAM-1和VCAM-1含量显著增高,提示内皮广泛而严重的损伤。FSN-100可显著减轻气泡诱导的EMPs对内皮的不良效应。
  研究结论:气泡刺激可显著促进EMPs的产生与释放且气泡诱导的EMPs可进一步促进血管功能障碍及炎性损伤。
  第二部分:气泡诱导内皮微粒产生的机制研究
  研究目的与方法:本研究以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial ceils,HUVECs)为研究对象,气泡诱导EMPs产生的方法同“第一部分”。应用荧光探针或流式细胞术的方法检测气泡刺激后胞内Ca2+浓度的变化并利用Ca2+通道阻滞剂LaCl3(100μM)观察胞内Ca2+对气泡诱导EMPs产生的影响。此外,流式法检测气泡刺激后胞膜翻转酶Flippase活性的变化及磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外露的情况,并进一步分析Ca2+是否在其中发挥作用;利用荧光显微镜观察骨架蛋白F-actin在胞膜共定位情况并进一步分析Ca2+是否在其中发挥调控作用。Western blot法分别检测诱导骨架蛋白重构的重要信号分子——细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2),肌球蛋白轻链(MLC)激活情况并进一步利用相应的分子抑制剂明确其在诱导EMPs释放中的确切作用。
  研究结果:内皮细胞经气泡刺激后,内皮细胞内Ca2+浓度显著增高,且气泡诱导EMPs的数量与胞内Ca+浓度具有明显的正相关性(r=0.687,P<0.05)。气泡刺激内皮细胞后,p-ERK1/2,p-MLC水平明显上升(P<0.05,P<0.05),细胞膜骨架蛋白共定位显著减少、骨架蛋白重构增加(P<0.05)。应用ROCK抑制剂Y27632后,p-MLC水平被显著抑制,骨架蛋白重构减少,同时气泡诱导EMPs释放的数量显著降低(P<0.05)。气泡刺激后,内皮细胞翻转酶Flippase活性明显下降,胞膜PS外露显著增加。应用Ca2+通道阻滞剂后可显著减轻上述效应中除ERK1/2被激活之外的所有作用。
  研究结论:气泡刺激血管内皮后通过触发胞内Ca2+增加激活Rho/ROCK通路并引起细胞膜骨架蛋白共定位减少、骨架蛋白重构,同时抑制翻转酶Flippase活性导致PS外露增加,促进EMPs的产生与释放。
  第三部分:肺表面活性物质对大鼠减压病的保护作用研究
  研究目的与方法:实验前12h给予大鼠雾化吸入10 mg肺表面活性物质(Surfactant)或生理盐水(Saline),然后建立DCS模型(空气模拟潜水:60m水深,90 min高压暴露,3min匀速减至常压)。观察大鼠DCS发病并探测血管内气泡生成情况,检测大鼠内皮炎症及氧化损伤相关指标。
  研究结果:雾化吸入Surfactant可显著降低大鼠DCS发病率及死亡率(75.0% vs.46.4%,P<0.01;28.6% vs.14.3%,P<0.01),DCS发病潜伏期和生存期明显延长(P<0.05)。血管内气泡生成量显著下降(P<0.01)。大鼠全身性炎症及肺内炎症指标(白介素1β和白介素6)较Saline组明显降低(P<0.01),内皮损伤相关指标(肺W/D,肺泡灌洗液蛋白,E-选择素,ICAM-1,EMPs)较Saline组明显降低(P<0.05),氧化与抗氧化(GSH/GSSG)失衡显著改善(P<0.01)。
  研究结论:雾化吸入Surfactant可通过抑制肺内炎症反应、改善肺功能、促进惰性气体排出明显减少血管内气泡生成;辅以抗氧化及保护内皮作用预防大鼠DCS的发生。
[硕士论文] 孔二亮
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  阻塞性黄疸是一种由于各种原因导致的肝内外胆管阻塞,胆汁无法通过正常通道排出而淤积在体内所致的一种临床症状,常见于肝内外肿瘤、胰头肿瘤、结石嵌顿等疾病,肝功能在一定程度受到损害,机体发生复杂的病理生理改变。阻塞性黄疸存在特殊的痛觉现象,对伤害性刺激不敏感即痛阈增高。在临床工作中痛阈增高容易导致患者就诊延迟、围术期麻醉镇痛药物使用相对过量、呼吸抑制、苏醒延迟等,不利于病人术后恢复。本课题的目的是探索黄疸患者中枢增高的胆红素(Bilirubin)通过与脊髓背角的5-羟色胺3A(5-hydroxytryptamine3A,5-HT3A)受体结合激活γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神经元,通过促进抑制性递质GABA的合成释放和增强GABA神经元抑制性活动介导阻塞性黄疸的痛阈增高。
  方法:
  1、通过胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)创建阻塞性黄疸的模型,采用全自动生化分析仪分析血清和脑脊液中肝功能各项指标的改变。BDL和胆红素鞘内注射测定Sprague-Dawley(SD)大鼠的痛阈。BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养后,通过western blot的方法观察5-HT3受体各亚型的表达变化,并通过免疫荧光观察BDL后脊髓切片神经元激活情况和5-HT3A受体表达变化。
  2、通过鞘内注射5-HT3A受体拮抗剂、GABAA受体拮抗剂、GABAB受体拮抗剂后测定BDL大鼠痛阈的变化。脊髓背角神经元培养鉴定GABA能神经元上5-HT3A受体的表达情况,并进一步通过western blot的方法观察BDL、胆红素鞘内注射和脊髓背角神经元培养胆红素干预后GABA受体各亚型的表达变化,并通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)测定脑脊液内GABA浓度。电生理技术记录5-HT3A受体激动剂和胆红素对脊髓背角GABA能抑制性突触后电流(spontaneous inhibitory postsynaptic current,sIPSC)的影响以及应用5-HT3A受体拮抗剂后电流变化。
  3、通过慢病毒将携带目的基因的质粒转染进入人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293)构建过表达人5-HT3A受体的HEK293细胞(HEK293-5-HT3A),电生理膜片钳观察胆红素和5-HT3A受体激动剂对细胞内向电流的影响。放射性配基结合实验测定胆红素和5-HT3A受体的亲和力大小,并通过同源建模和分子对接的方法模拟预测胆红素和5-HT3A受体的空间结构、结合方式以及结合位点。
  结果:
  1、胆总管结扎术后大鼠血浆总胆红素(total bilirubin,TB)、直接胆红素(direct bilirubin,DB)和间接胆红素(indirect bilirubin,IB)、胆汁酸(total bile acid,TBA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)均随着BDL时间增加而增加,而脑脊液中仅有TB和IB升高,且在3、5、7天显著高于sham组。BDL后大鼠机械痛阈和热痛阈显著升高,鞘内直接注射胆红素后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著高于注射前。BDL3d大鼠鞘内注射昂丹司琼抑制了胆总管结扎大鼠的痛阈升高,且具有浓度依赖性。BDL、胆红素鞘内注射以及胆红素直接培养大鼠脊髓背角神经元后5-HT3A受体表达逐渐增加。免疫荧光显示BDL后5-HT3A受体表达高于假手术组,且活化的神经元数量增加,活化的神经元同时高表达5-HT3A受体。
  2、鞘内给予昂丹司琼(ondansetron)、荷包牡丹碱(bicuculline)显著降低黄疸大鼠的痛阈,而CGP55845对痛阈的降低作用较弱。且昂丹司琼、荷包牡丹碱抑制了鞘内注射5-HT3A受体激动剂mCPBG、胆红素诱导的痛阈增高。脊髓背角神经元培养免疫荧光染色显示培养的GABA能中间神经元多数表达5-HT3A受体,且BDL、胆红素鞘内注射大鼠以及胆红素直接培养脊髓背角神经元后GABAA受体表达增加,昂丹司琼在一定程度抑制GABAA受体的表达。ELISA提示BDL和胆红素鞘内注射后脑脊液内GABA浓度明显增加,昂丹司琼干预后GABA水平有短暂下降。电生理记录提示mCPBG、胆红素增强GABA能神经元的sIPSC,而昂丹司琼干预后mCPBG、胆红素对sIPSC的作用减弱。
  3、胆红素诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流。放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体有较弱的亲和力,两者以能量较低的方式相结合。胆红素能够进入5-HT3A受体亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。
  结论:
  本研究可得出如下结论:
  1、胆红素通过5-HT3A受体增高阻塞性黄疸的痛阈。
  BDL后大鼠机械性痛阈和热痛阈显著升高,且脑脊液内胆红素水平增加。鞘内注射胆红素同样增加大鼠痛阈,且可被5-HT3A受体拮抗剂所抑制。同时5-HT3A受体在胆红素干预后表达明显增加,且脊髓背角神经元活性增加。
  2、胆红素通过5-HT3A受体影响GABA通路的功能。
  5-HT3A受体激动剂、胆红素鞘内注射均可增高大鼠痛阈,这种效应可被5-HT3A受体拮抗剂、GABA受体拮抗剂所抑制。同时,5-HT3A受体在培养的脊髓背角GABA能神经元上大量表达,且GABAA受体在胆红素干预后蛋白表达明显增加,GABA浓度在BDL和胆红素鞘内注射后显著增加。
  3、胆红素与5-HT3A受体以氢键相结合。
  胆红素能够诱发HEK293-5-HT3A细胞产生内向电流,且放射性配基结合实验证实胆红素同5-HT3A受体的亲和力较弱,提示两者以共价键或离子键等结合的可能性较小。同源建模和分子对接进一步证实了胆红素能够进入5-HT3A受体两个亚基之间形成的疏水间隙,两者在空间结构上具有良好的互补性,并且有氢键形成。
  阻塞性黄疸中枢升高的游离胆红素能够与脊髓背角的5-HT3A受体以氢键相结合,从而增强GABA能中间神经元的活动,参与黄疸患者的痛阈增高。
[博士论文] 李卓东
外科学(胸心外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题通过建立主动脉夹层外科治疗数据库并以其为基础完成本中心2014年1月1日至2016年5月31日期间主动脉夹层患者临床数据的登记工作,通过筛选其中急性A型主动脉夹层患者的临床资料对疾病的发病特点、术前夹层破裂死亡、手术死亡的围术期危险因素做回顾性分析,讨论目前治疗过程中可能存在的问题并探讨进一步提高治疗水平的方法。
  方法:
  一、单中心主动脉夹层治疗数据库的建立
  参考国内首次多中心主动脉夹层治疗登记的资料并通过科室讨论、专家咨询,制定出患者临床资料的登记表格,收集本中心2014年1月1日至2016年5月31日期间收治的主动脉夹层患者资料,与第二军医大学计算机网络中心合作,完成数据库及网络信息平台的软件开发及调试工作,将收集的患者资料录入、核对及上传,完成患者资料的电子化。
  二、急性A型主动脉夹层临床分析
  1、筛选急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分析其性别构成、年龄分布、发病季节、地区分布等流行病学特点。
  2、分析患者发病后的临床表现、既往疾病史、入院后检查及检验结果等情况。
  3、分析患者治疗及预后情况。
  三、急性A型主动脉夹层术前破裂死亡危险因素分析
  1、筛选急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分为破裂组和非破裂组,分析两组患者性别、年龄、发病时间、入院时间、破裂死亡时间、手术时间、发病后临床表现、既往史、入院检查及血检验情况。
  2、根据两组患者对比分析结果,选择两组间差异有统计学意义的因素进行单因素分析,确定潜在危险因子。
  3、进行多因素二分类Logistic分析,确定夹层破裂死亡的独立危险因素。
  四、急性A型主动脉夹层手术死亡危险因素分析
  1、筛选手术治疗的急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分为死亡组和存活组,对比分析两组患者性别、年龄、发病时间、入院时间、手术时间、发病后临床表现、既往史、入院检查及血检验情况、手术内容及术后并发症的发生情况。
  2、根据两组患者对比分析结果,选择两组间差异有统计学意义的因素进行单因素分析,确定潜在危险因子。
  3、进行多因素二分类Logistic分析,确定手术死亡的独立危险因素。
  结果:
  一、单中心主动脉夹层治疗数据库的建立
  1、根据科室出入院登记、ICU出入室记录、体外循环手术记录等多数据核实,收集主动脉夹层患者456例并完成资料登记。
  2、通过电子表单完成患者资料的录入及保存,通过网络信息平台完成数据上传,实现患者资料电子化,建成可持续扩充的主动脉夹层患者数据库。
  二、急性A型主动脉夹层临床分析:
  1、全组共329例患者,其中96.0%的患者为DebakeyⅠ型。发病人数从11月至第二年3月期间明显增多,本组患者发病的高峰年龄在41-60岁,男女比为3.9∶1(262∶67),女性患者平均年龄高于男性患者(54.5±12.8岁VS50.2±13.1岁,P=0.017);66.0%的患者有高血压,其中仅31.8%的患者血压控制在正常范围;32例为马凡综合征患者、主动脉瓣二叶瓣畸形患者4例。
  2、大部分患者主动脉破口位于升主动脉(31.9%)及主动脉弓部(37.1%),少数患者内膜破口位于主动脉根部(8.8%);62.0%的患者发病后白细胞高于正常值,其与患者年龄、发病时间、氧饱和度有一定相关性;87.2%的患者发病后D-二聚体快速升高,6-8小时达到峰值,发病后14天内仍高于正常值。
  3、本组急性A型主动脉夹层患者住院死亡率20.1%(66/329),手术率75.1%(247/329),手术死亡率9.3%(23/247),非手术死亡52.4%(43/82),破裂死亡占所有死亡患者总数的47.0%(31/66)。
  三、急性A型主动脉夹层术前破裂死亡危险因素分析
  1、本组329例ATAAD患者中,术前破裂死亡31例,经多因素二分类Logistic分析发现:ATAAD患者发病合并休克(OR:19.11,P<0.001)、疼痛症状需要药物控制或药物控制不良(OR:10.88,P<0.001)、入院后肌钙蛋白检测值>0.7ng/ml(OR:6.24,P=0.002)、D-二聚体检测值≥10μg/ml(OR:25.88,P<0.001)是住院夹层破裂死亡的独立危险因素。
  2、本组ATAAD患者中,男性患者是女性患者的3.9倍,而破裂组男性患者是女性患者2.9倍(23∶8),但性别并非夹层破裂死亡的危险因素(P=0.135);本组患者年龄是夹层破裂的影响因素,但年龄≥60岁(P<0.001)对夹层破裂的影响需进一步考证。
  3、ATAAD患者发病后合并昏迷(P<0.001)、肢体脉搏减弱或消失(P=0.002)、PaO2<80mmHg(P=0.027)、尿素氮>8mmol/L(P=0.037)、ALT≥130U/L(P<0.001)、乳酸≥3mmol/L(P=0.007)等是夹层破裂的影响因素,但不是独立危险因素。
  四、急性A型主动脉夹层手术死亡危险因素分析
  1、本组247例ATAAD手术患者,术后30天内死亡23例,经多因素分析,手术死亡有统计学意义的独立危险因素有:年龄≥68岁(OR:14.78,P=0.005),合并休克(OR:13.50,P=0.034),肌钙蛋白>0.67ng//ml(OR:34.95,P<0.001),D-二聚体>13.1μg/ml(OR:11.79,P=0.002),术后呼吸功能不全(OR:4.58,P=0.032),术后肝功能不全(OR:32.47,P<0.001)。
  2、本研究未能得性别(P=0.416)、体重指数(P=0.434)、既往疾病史等流行病学因素对急性A型主动脉夹层手术的危险性存在影响的结论,而入院收缩压<105mmHg(P=0.004)、术前肝功能不全(P=0.001)、术前肾功能不全或衰竭(P=0.006)、主动脉脉瓣关闭不全(P=0.031)、二尖瓣关闭不全(P=0.024)、三尖瓣关闭不全(P=0.004)及EF<50%(P=0.006)等在单因素分析中显示对手术死亡有影响,本组手术因素对患者不良预后无明显影响。
  结论:
  1、通过制定主动脉夹层数据登记表收集患者信息、以电子表单进行数据录入、上传至网络信息平台进行数据存储管理等方式成功构建了单中心主动脉夹层数据库。
  2、与既往文献报道结果相一致,急性A型主动脉夹层的发病在冬季明显增多,男性多于女性,高血压控制不良为主要发病原因,大部分患者发病后血D-二聚体快速升高,6-8小时达到峰值,发病后14天内仍高于正常值;该病发病后死亡率极高,夹层破裂死亡是主要的死亡原因,目前手术死亡率远低于住院死亡率;本组患者手术率仍偏低,进一步提高手术率能降低住院死亡率,改善患者预后。
  3、发病合并休克、疼痛症状需要药物控制或药物控制不良、入院后肌钙蛋白检测值>0.7ng/ml、D-二聚体检测值≥10μg/ml是急性A型夹层破裂死亡的独立危险因素;患者年龄、发病后合并晕厥、昏迷、偏瘫、呼吸功能不全、肢体脉搏减弱或消失、入院时乳酸≥3mmol/L等是夹层破裂的影响因素,但不是独立危险因素。
  4、年龄≥68岁、合并休克、肌钙蛋白>0.67ng//ml、D-二聚体>13.1μg/ml、术后呼吸功能不全、术后肝功能不全,是急性A型主动脉夹层手术死亡的独立危险因素;入院血压、术前肝/肾功能不全、心脏瓣膜及心肌功能等是影响手术预后因素。
  5、本研究的结论与既往文献报道相比具有共同性及相异性,其原因主要与本课题研究对象的来源特点、病情特点等原因密切相关。
[硕士论文] 王世杰
生物学(微生物学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒,是引起人类急、慢性肝炎的重要病原体。HCV感染极易慢性化,其慢性率高达80%。HCV慢性感染是肝硬化、肝癌等严重终末期肝病的重要原因。
  长效干扰素联合利巴韦林曾经是治疗HCV感染的标准方案,其疗效受基因型的影响,且总体不甚理想。近年来上市的新一代直接抗病毒药物(direct antiviral agents,DAAs)(如Ledipasvir和Sofo sbuvir)使丙肝治疗现状发生重大改变,但这些药物费用昂贵,无法在短期内普及使用,副作用以及耐药突变等也有待更长时间的观察。HCV基因组高度变异,这是HCV逃避宿主适应性免疫而高发慢性感染的重要原因。除了变异以外,HCV还进化有其他复杂的免疫逃避机制,尤其是逃避固有免疫应答的机制,促使HCV慢性感染的发生。HCV分子克隆以后的近三十年,丙肝疫苗研究一直受到发达国家的重视,有多种类型的疫苗进入或已经完成了Ⅰ、Ⅱ期临床期试验,但目前没有一种进入Ⅲ期临床试验阶段。HCV的高变异使得疫苗研制举步维艰,另一方面,HCV感染是否足以诱导保护水平的免疫应答也存在争议。
  HCV感染的药物治疗虽然取得了巨大进展,但对于HCV慢性感染和免疫逃避机制的认识还有很多未知,有待进一步深入发掘,阐明这些错综复杂的问题,不仅能为人类控制HCV感染,也能为人类认识其他病毒持续感染的机制提供重要线索。事实上,HCV目前已经被作为研究病毒慢性感染机制的重要模型,在抗HCV药物研发取得巨大进展以后,HCV感染与致病机制依然受到学者的广泛关注,研究热度依然不减。
  我们之前的研究发现HCV感染显著上调Huh7细胞中硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达,且HCV感染高度依赖于TXNIP的表达。本论文在此基础上,对HCV感染诱导TXNIP表达以及TXNIP促进HCV感染的机制进行了探索。
  本研究中,我们开展了以下实验、获得了如下结果:1)进一步观察和证实了HCV感染上调Huh7细胞中TXNIP的表达以及TXNIP分子对HCV感染的重要作用;2)通过RNA干扰技术确认抑制细胞自噬导致Huh7细胞中HCV感染的下调,以及抑制TXNIP的表达明显降低无血清饥饿对细胞自噬的诱导;3)对HCV感染的Huh7细胞进行内质网应激相关标志分子的检测,未观察到HCV感染对内质网应激的诱导;4)HCV感染Huh7细胞能低水平激活IFN-β的转录,外源性IFN-β能剂量依赖性上调Huh7细胞中TXNIP的表达;5)HCV全长RNA和HCV3'-UTR转染Huh7细胞能诱导IFN-β的产生和上调TXNIP的表达;6)Huh7.5.1细胞转染RIG-Ⅰ表达质粒以后,细胞内TXNIP的表达水平升高,且HCV感染能进一步上调TXNIP的表达,而HCV感染对naive Huh7.5.1内的TXNIP表达无上调作用;7)Redd1分子可能与TXNIP协同参与对HCV感染的调控;8)钙离子拮抗剂维拉帕米能通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染。
  本论文通过上述研究建立了一种HCV慢性感染新机制的作用模型:HCV感染刺激宿主产生低水平干扰素(无论细胞模型中这种作用的高低程度如何,人类和黑猩猩感染HCV在肝组织内普遍检测到干扰素表达的明显上调),干扰素上调TXNIP的表达,TXNIP则通过促发细胞自噬增强HCV的复制。干扰素刺激表达的TXNIP不同于其他干扰素刺激基因表达产物,其作用不是抑制病毒感染,而是相反。基于这一发现,我们证明了一种临床用于治疗高血压的廉价药物维拉帕米通过抑制TXNIP的表达而抑制HCV感染,其用于临床治疗丙型肝炎的前景值得进一步探讨。
[硕士论文] 冯雍炜
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:芥子气(sulfurmustard,SM),是糜烂性毒剂的代表,在第一次世界大战中被首次使用,后又相继在日本侵华战争、两伊战争及叙利亚内战中被使用,造成大量人员中毒甚至死亡。芥子气作用时间长,中毒途径多,穿透性强,且尚无特效的防治措施,所以仍是我军面临的主要化学战剂威胁之一。芥子气是日本遗弃在华的主要化学战剂之一,对中国人民的健康和环境安全构成重大威胁,尤以东北地区最为严重。因此,积极探究芥子气的中毒机制,寻找有效的防治药物,对维持我军战斗力、保障公民健康及保护生态环境均有着重要的战略意义。
  芥子气可引起体内多脏器的中毒损伤,其中肺是芥子气损伤的主要靶器官。大量研究发现,芥子气中毒后可引起呼吸道的炎症及肺泡结构的破坏,从而引起急性肺损伤导致患者死亡。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类成体干细胞,具有自我更新以及分化的功能。研究表明BMSCs可以通过分泌抗炎性细胞因子、调节免疫细胞分型、分泌生长因子及分化作用等多种途径对损伤组织的修复、免疫系统的调节产生作用,从而减轻肺部炎症反应、加速损伤肺组织的修复,缓解肺损伤。
  本文研究发现,BMSCs能通过分泌EGF、FGF、PDGF等生长因子,促进Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞增生,加强细胞连接等途径对肺损伤的修复产生影响,从而减轻肺水肿,并对芥子气中毒小鼠肺功能起到改善作用。此外BMSCs还可以通过影响巨噬细胞和T淋巴细胞的分化、调节TLR4信号通路的表达从而显著降低促炎性细胞因子的表达,升高抗炎性细胞因子的表达。
  一、BMSCs的鉴定及其在芥子气中毒小鼠体内的定位
  取ICR小鼠股骨和胫骨进行BMSCs的原代分离及培养,通过流式细胞术检测表面标志抗原及干细胞诱导分化实验对所获得的BMSCs进行鉴定:结果显示分离培养获得的细胞可以高表达间质类细胞特异性表面抗原CD73、CD90、CD105,不表达或低表达造血细胞表面抗原CD11b、CD19。透过诱导分化实验发现,获得的BMSCs能成功地分化为成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞。
  本研究通过将ICR小鼠皮下注射芥子气的方法建立了芥子气染毒的动物模型,将培养扩增鉴定后的BMSCs通过尾静脉注射从而进行下一步实验研究。首先通过小动物活体成像的方法明确了BMSCs在芥子气染毒小鼠模型中的定位,发现其主要聚集于双侧肺脏,其中1h和2h荧光强度明显升高,至24h仍有一定的荧光信号,明确了BMSCs可以作用于芥子气损伤后的主要靶器官-肺脏。
  二、BMSCs对芥子气中毒小鼠肺损伤修复的作用及机制研究
  本课题组前期研究发现,BMSCs治疗能显著降低芥子气中毒小鼠肺湿/干重比和肺泡灌洗液中总蛋白浓度。为进一步观察损伤修复在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,通过ELISA法检测了肺组织内生长因子的变化,结果显示BMSCs治疗后可以显著提高芥子气中毒小鼠肺组织内EGF、FGF、PDGF的表达。Ki-67染色结果显示,BMSCs治疗后小鼠肺组织内Ki-67阳性细胞比例与芥子气组相比显著升高。此外,还发现芥子气损伤后,肺组织内Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞表面标志蛋白AQP5、SP-C及细胞连接蛋白VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1均不同程度降低,而BMSCs治疗后AQP5、SP-C、VE-cadherin、Occludin、Claudin-5、ZO-1、Caveolin-1的表达均显著提高。以上结果提示,BMSCs能通过分泌生长因子、促进受损的肺泡上皮细胞增殖、促进上皮细胞连接的修复及分化成为肺泡上皮细胞等多种途径促进受损肺上皮的修复,从而减轻肺水肿、改善肺功能。
  前期研究中发现BMSCs能显著改善芥子气中毒小鼠生存率的变化,本研究中进一步检测了BMSCs对于芥子气中毒小鼠肺功能的影响。结果表明,芥子气中毒后,小鼠最大呼气流速、最大吸气流速、每分钟通气量以及50%肺容积呼气流速与正常组相比明显降低,给予BMSCs治疗后上述指标出现升高,提示BMSCs治疗能在一定程度上改善芥子气中毒小鼠的肺功能。
  三、BMSCs对芥子气中毒小鼠免疫调节的作用及机制研究
  本课题组前期研究发现,BMSCs能通过减少趋化因子的产生从而显著降低芥子气中毒小鼠肺组织内巨噬细胞、T淋巴细胞等炎细胞的浸润,因此本研究进一步考察了其对于巨噬细胞及T淋巴细胞分型的变化。结果发现,与芥子气组相比较,BMSCs可以显著降低促炎性M1型巨噬细胞及Th17细胞的表达,升高抗炎性M2型巨噬细胞及Treg细胞的表达。提示BMSCs能通过调节免疫细胞的分型从而减轻芥子气所致肺损伤。
  为进一步考察免疫调节在BMSCs治疗芥子气肺损伤中的作用,检测了小鼠肺组织及细胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17等促炎因子及IL-10、TGF-β等抗炎因子的表达。结果发现,与芥子气组比较,BMSCs可以显著降低肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-β的表达量。在芥子气染毒的小鼠巨噬细胞(Raw264.7)及脾淋巴细胞模型中,将其与BMSCs共培养后同样可以显著降低培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-17的表达量,升高IL-10、TGF-β的表达量。提示BMSCs能通过降低促炎因子、升高抗炎因子减轻体内炎症反应。
  进一步在动物及细胞水平上探宄了可能在BMSCs减轻芥子气损伤中发挥作用的信号通路。结果发现,与正常组相比较,芥子气染毒后小鼠肺组织内TLR4及其及其下游NF-κB p65、p50的表达量明显增高,给予BMSCs治疗可明显降低TLR4、NF-κB p65、p50的表达。在Raw264.7细胞模型中,TLR4、NF-κβp65、p50的表达量同样出现升高,给予BMSCs Transwell共培养、敲除巨噬细胞内TLR4受体或给予TLR4抑制剂TAK242后,TLR4、NF-κβp65、p50的表达量均显著降低。提示TLR4信号通路可能在BMSCs调节芥子气肺损伤的过程中发挥着重要作用。
[博士论文] 王丹宁
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一章 成年SD大鼠原代心肌细胞分离培养,PLB及SERCA2a重组腺病毒载体的纯化及转染
  目的:
  分离得到成年大鼠原代心肌细胞并成功培养,分离、纯化包含犬PLB和SERCA的腺病毒载体,并转染至分离成功的大鼠原代心肌细胞中;
  方法:
  采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分离得到成年SD大鼠原代心肌细胞,进一步分离纯化包含犬PLB和SERCA的腺病毒载体,并转染至培养的原代心肌细胞中,观察细胞存活时间及细胞状态,通过免疫组化法、western blot、calcium-imaging观察未转染细胞及转染成功后,心肌细胞PLB及SERCA分布、单个细胞功能等。
  结果:
  1.成功分离出大鼠原代心肌细胞,分离存活率稳定在70-80%,并可稳定培养3-5天;
  2.包含犬PLB和SERCA2a的腺病毒载体经分离纯化,效价比较高,并可成功转染cos-1细胞,肉眼观测转染成功率达80%以上,western blot检测到新生蛋白成功表达,且含量随病毒浓度增加呈递增趋势;
  结论:
  Lan'gendorff灌流法分离大鼠原代心肌细胞方法有效可行,成功率高,分离纯化重组腺病毒载体方法成熟且转染率高,分离及转染后原代心肌细胞状态稳定,可进行后续实验。
  第二章 正常SD大鼠原代心肌细胞中新生PLB及SERCA2a运输途径及其对心肌细胞自发钙活动、钙离子通道的影响
  目的:
  通过观察大鼠原代心肌细胞培养24h、48h、72h后,观察新生PLB和SERCA从细胞核到细胞质的转运途径,探讨该新生转运途径对心肌细胞自发钙活动及L型钙离子通道的影响;
  方法:
  健康成年SD大鼠8只,采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分离得到成年SD大鼠原代心肌细胞,包含犬PLB和SERCA的腺病毒载体转染至培养的原代心肌细胞中,观察转染后24h、48h、72h存活细胞状态,通过免疫组化法、western blot、calcium-imaging、膜片钳等方法观察心肌细胞中新生成的PLB及SERCA分布、由细胞核向细胞质转运的途径、对细胞钙离子电流的影响等。结果以x±s表示,多组之间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用方差分析,不同距离/时间点资料的比较应用重复测量方差分析,p<0.05表示差异具有统计学意义,所有统计学分析采用SPSS24.0软件完成。
  结果:
  1.8只SD大鼠均成功分离出原代心肌细胞,转染成功,并可培养24h、48h、72h;
  2.正常原代心肌细胞中,PLB在核膜及肌浆网上均有分布,且两者分布含量大于2∶1; SERCA2a在核膜及肌浆网上同样均有分布,且两者分布含量约为1∶1,p<0.05;
  3.包含犬PLB/SERCA2a的重组腺病毒转染培养的心肌细胞后,24h荧光染色结果可见PLB主要局限在核膜上,而SERCA2a已经开始由核膜向外扩散,观察48h荧光染色结果发现,PLB仍然以核膜为主,部分分布在肌浆网上,SERCA2a则已经完全分布至肌浆网,接近自身稳态的分布;72h观察两者均已达到稳态分布,westernblot结果与荧光染色观察结果一直,细胞内新生的PLB/SERCA2a含量随着时间延长呈递增趋势;
  4.对比转染前后心肌细胞钙成像及全细胞膜片钳实验结果,转染后心肌细胞自发钙活动并未发生明显改变,L型钙通道电流没有明显影响,差异没有统计学意义;
  结论:
  正常大鼠心肌细胞中新生PLB及SERCA2a遵循NEST途径转运,PLB在转运途中在核膜上的滞留及其自身的分布特点对正常心肌细胞的钙调控未见明显影响。
  第三章 心肌梗死SD大鼠原代心肌细胞PLB及SERCA2a的运输途径,及其对心肌细胞自发钙活动、钙离子电流的影响
  目的:
  心肌梗死大鼠原代心肌细胞培养24h、48h、72h后,观察新生PLB和SERCA从细胞核到细胞质转运途径,探讨该新生转运途径对心肌细胞自发钙活动及钙离子通道的影响;
  方法:
  健康成年SD大鼠8只,结扎前降支构建梗死模型,造模成功后饲养4周,采用Lan'gendorff灌流法及Liberase酶解法分离得到成年SD大鼠原代心肌细胞,将含犬PLB和SERCA的腺病毒载体转染至培养的原代心肌细胞中,观察转染后24h、48h、72h,存活细胞状态,通过免疫组化法、western blot法、 calcium-imaging、全细胞膜片钳等方法观察心肌细胞中新生成的PLB及SERCA分布、由细胞核向细胞质转运的途径、对心肌细胞自发钙活动、相关电生理功能的影响等。结果以x±s表示,多组之间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用方差分析,不同距离/时间点资料的比较应用重复测量方差分析,p<0.05表示差异具有统计学意义,所有统计学分析采用SPSS24.0软件完成
  结果:
  1.8只心梗大鼠均成功分离出原代心肌细胞,转染后可成功培养24h、48h、72h;
  2.心梗鼠的腺病毒转染后的原代心肌细胞中,24h荧光染色结果可见PLB主要局限在核膜上,而SERCA2a已经开始由核膜向外扩散,观察48h荧光染色结果发现,PLB仍然以核膜为主,SERCA2a则已经完全分布至肌浆网,接近自身稳态的分布;72h观察两者均已达到稳态分布,western blot结果与荧光染色观察结果一直,细胞内新生的PLB/SERCA2a含量随着时间延长呈递增趋势;
  3.对比转染前后心梗鼠心肌细胞钙成像实验结果,转染后的心肌细胞自发钙活动明显增加,荧光强度较未转染的心肌细胞增强(p<0.05,差异具有统计学意义);采用全细胞膜片钳记录未转染及转染后24小时的心肌细胞L型钙通道电流,分别记录转染、未转染细胞各12个,记录到的钙电流在转染后,较未转染细胞的钙电流减少,p<0.05,差异具有统计学意义。
  结论:
  心梗大鼠心肌细胞中新生PLB及SERCA2a同样遵循NEST途径转运,PLB在转运途中在核膜上的滞留时间较正常细胞延长,与未转染细胞对比,心肌细胞自发钙活动明显增加,L型钙通道电流减少,可能与梗死后心肌细胞的电不稳定性相关。
[硕士论文] 沈蕾蕾
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分 隐源性机化性肺炎的CT影像学征象分析及随访预后影响因素研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎(Cryptogenic Organizing Pneumonia,COP)的CT影像学征象及其预后的影响因素。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月经临床-影像-病理诊断的隐源性机化性肺炎32例(男22例,女10例,20-78岁,60±13岁),由手术或活检获得病理标本,均行胸部多排螺旋CT扫描,其中20例具有随访CT,(随访时间1-43月,中位随访时间4月),分析患者的临床表现及实验室检查,并对其初次CT图像作回顾性分析,分析内容包括病变部位、形态、性质、合并纵隔淋巴结肿大、胸水等。制定评分表,对每一个患者的CT表现进行评分。治疗后及随访疗效评价分为两组,A组:病灶明显吸收好转,B组:病灶轻度吸收、无变化或进展、复发。采用Fisher检验,分析两组间患者性别、临床表现及实验室异常检查;采用t检验分析两组间患者年龄;采用Mann-whitney U检验,分析两组间不同征象评分和从出现症状到确诊时间。
  结果:
  病灶主要表现为实变影(18/32,56.25%)、磨玻璃密度影(21/32,65.63%)、结节影(18/32,56.25%)、肿块(12/32,37.50%)、线条影(23/32,71.88%)。20例治疗后随访的患者中,A组:13例,病灶明显吸收,仅残留少许磨玻璃影和/或纤维灶;B组:7例,病灶轻度吸收(n=5),病灶无明显变化或进展(n=0)、病变复发(n=2)。两组间性别、年龄、临床表现、实验室异常检查、不同征象的评分统计无明显差异(p>0.05)。两组患者从出现症状到确诊时间有明显差异(p<0.05)。
  结论:
  COP影像学表现多样,以磨玻璃密度影及实变影为主。糖皮质激素治疗预后与患者初次影像学表现无关,但与从出现症状到确诊时间有关,因此需及时诊断,及时治疗。
  第二部分 隐源性机化性肺炎的影像-病理对照分析研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎(Cryptogenic Organizing Pneumonia,COP)的CT影像学表现与病理表现的对照及获取病理标本的方式,加深对本病的认识。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月经临床-影像-病理诊断的隐源性机化性肺炎32例(男22例,女10例,20-78岁,60±13岁),经手术(n=10)、CT引导下穿刺活检(n=20)及支气管镜活检(n=2)获得病理标本,对所有标本进行切片、染色、观察。分析相应的取标本病变处的影像学表现,并与标本病理切片光镜下表现做对照性分析。
  结果:
  获取病理组织对应的影像学表现为实变影13例,磨玻璃影1例,实变及磨玻璃影2例,结节影5例,肿块影11例。实变影、肿块及结节影对应典型的COP的病理表现,肺泡腔及肺泡管内充满由成纤维细胞组成的肉芽组织(Masson小体),部分可通过肺泡孔通向邻近肺泡腔,呈“蝴蝶征”;结节或肿块影中可出现坏死组织;磨玻璃病变对应的病理表现为肺泡间隔增宽,少量炎性细胞浸润,肺泡Ⅱ上皮细胞增生,个别肺泡腔内见团块状肉芽组织。
  结论:
  COP影像学多表现为实变影、磨玻璃影、结节影、结节影、肿块影及条带状影,影像-病理对照性分析可以加深其理解。CT引导下穿刺活检病理组织可满足临床诊断,但获取组织块小,不能反映病灶影像特征的全貌,做影像-病理对照研究采用手术获得标本更好。
  第三部分 隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床、影像及病理分析研究
  目的:
  探讨隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床、影像及病理学特征,提高诊断水平。
  材料与方法:
  回顾性分析我院2012年1月至2017年6月收集的孤立性肿块型(d≥3cm)的隐源性机化性肺炎10例(男8例,女2例,52-78岁,62±7岁)的临床、影像及病理资料。经手术(n=5)、CT引导下穿刺活检(n=5)获得病理标本,对所有标本进行切片、染色、观察。分析患者的临床症状、体征、实验室检查、病变的部位、大小、形态、边缘特征、内部结构、周围结构、伴随征象。
  结果:
  10例患者均有咳嗽咳痰症状,其中7例伴少量咯血。CT可见肿块均邻近胸膜(直径3.2-6.1cm,4.2±0.7cm),病灶分布左肺上叶(4例,40%)居多;6例病灶密度不均,其中4例肿块内见空洞;4例胸膜凹陷;7例纵隔淋巴结肿大。病理光镜下均可见肺泡腔内见团块状或长条状肉芽组织,其中4例病灶间质内局灶性淋巴细胞明显增多。
  结论:
  通过总结隐源性机化性肺炎孤立肿块型的临床-影像-病理特点,其影像可充分反映本病的病理特征,即表现出炎症特性和机化特性,再结合患者临床无明显病因,可及时正确诊断大部分孤立肿块型COP。
[硕士论文] 胡红丽
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:宿主防御新生隐球菌感染是由活化的巨噬细胞、NK细胞和T细胞共同作用完成的。肺泡巨噬细胞和树突状细胞(DC)一般被认为是新生隐球菌感染的一线天然屏障。宿主感染新生隐球菌后,这些DC和巨噬细胞吞食并破坏侵入的隐球菌,向T细胞提呈隐球菌抗原,并产生启动和引导适应性免疫应答的介质(细胞因子和趋化因子)。研究证明,肺脏DC和肺泡巨噬细胞的耗竭导致了感染新生隐球菌的小鼠病情迅速恶化和死亡。因此,肺泡巨噬细胞和树突状细胞在抗新生隐球菌免疫反应中起着重要的作用,并在新生隐球菌感染过程中连接先天免疫系统和适应性免疫系统。IL-17作为Th17型细胞主要代表之一,在细胞外的细菌和真菌感染的清除中起着重要的作用。增加IL-17的产生与减少隐球菌负荷有关,表明IL-17在产生保护性抗隐球菌免疫应答方面也有重要作用。CCL7,也称单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)由于其强大的趋化作用,在许多病理机制中都有涉及。然而,其被IL-17调制,却很少受到关注。在本研究中,我们以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为研究对象,证明了在新生隐球菌感染巨噬细胞中IL-17可介导CCL7的诱发。并且,这种效应是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路介导,导致CCL7表达增加。了解CCL7表达的调控可以为新生隐球菌感染免疫潜在治疗靶点的发展提供见解。
  第一部分:隐球菌脑膜炎患者外周血单个核细胞中IL-17表达降低
  本部分将探讨患者外周血单个核细胞中IL-17的表达情况。纳入上海长海医院和长征医院2008年5月~2016年8月患者28例,并且收集同时期健康对照者30例。分别分离其外周血单个核细胞,采用实时定量PCR检测其IL-17表达量。
  结果显示,与健康对照组相比,患者外周血单个核细胞中IL-17mRNA表达水平明显降低。实验室培养RAW264.7细胞至对数生长期,用热灭活新生隐球菌刺激RAW264.7细胞,分别在刺激后的0、4、8、12小时后收集细胞和上清,进行RT-PCR和ELISA检测IL-17在基因和蛋白层面的表达。
  结果表明,热灭活新生隐球菌与巨噬细胞系共培养后,IL-17mRNA和蛋白的表达均呈时间依赖性增高,在12小时达到最高。
  本部分结果提示,IL-17可能通过影响新生隐球菌免疫应答而参与到发病机制中。
  第二部分:巨噬细胞抗隐球菌感染免疫过程中MAPK/CCL7表达升高
  本部分将探讨MAPK代表蛋白/CCL7在巨噬细胞抗新生隐球菌感染免疫中的表达。实验室培养RAW264.7细胞,待呈对数增长后与热灭活新生隐球菌共培养12小时后收集上清,同时设立对照组,采用实时荧光定量PCR及ELISA检测CCL7在基因和蛋白层面的表达水平。并用western blotting检测实验组与对照组分别培养0、8、12小时后巨噬细胞中MAPK的代表蛋白的表达水平。再分别用MAPK的代表蛋白ERK、JNK、p38的抑制剂预处理,检测热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7的表达,结果发现,与对照组相比,热灭活隐球菌诱导后巨噬细胞CCL7表达明显升高(P<0.05),并且巨噬细胞中MAPK代表蛋白ERK、JNK和p38的磷酸化均增加;ERK、JNK的抑制剂预处理细胞,导致新生隐球菌感染诱导巨噬细胞表达CCL7降低,而p38的抑制剂处理巨噬细胞则没有这种现象。本部分结果提示巨噬细胞感染新生隐球菌后可以通过MAPK中的ERK、JNK信号通路来增强CCL7的产生来增强免疫。
  第三部分:IL-17可通过MAPK信号通路介导巨噬细胞中CCL7的表达上调
  本部分将探讨IL-17对新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7产生的调控机制。实验室培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,待其呈对数增长趋势时分别以不同浓度的rhIL-17(25,50以及100ng/ml)预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时。同时设立对照组,对照组为未加入rhIL-17预处理但与新生隐球菌以1∶10的比例共孵育的等体积巨噬细胞,也即加入rhIL-17的浓度为0ng/ml。
  1.不同浓度rhIL-17(0,25,50以及100ng/ml)预处理后,ELISA检测巨噬细胞抗新生隐球菌免疫过程中CCL蛋白的表达水平;用100ng/ml rhIL-17预处理后,并用western blotting分别检测巨噬细胞与新生隐球菌共培养0、8、12小时后ERK、p38、JNK的表达水平。
  2.控制实验因素,即在用rhIL-17刺激之前,分别用各自信号通路的特定抑制剂处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,ELISA检测评估CCL7的表达;另一方面,在用rhIL-17刺激巨噬细胞之前,用CCL7阻断抗体处理,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平。
  结果发现:1.巨噬细胞在不同浓度的IL-17(对照组0ng/ml,实验组25、50和100ng/ml)中培养12h,CCL7的表达在基因和蛋白层面都随着IL-17的浓度的升高而依次递增,在100ng/ml时最高;而western blotting结果示:用100ng/ml rhIL-17预处理后,巨噬细胞与新生隐球菌共培养后ERK、p38、JNK的磷酸化水平升高。
  2.ERK的抑制剂MEK(U0126,10μm)、JNK的抑制剂JNK(SP600125,10μm)预处理细胞,导致IL-17介导CCL7表达较对照组明显降低,p38的抑制剂p38(SB203580,10μM)却未产生明显影响。而在用rhIL-17刺激之前,用CCL7阻断抗体处理,然后以100ng/ml rhIL-17预处理巨噬细胞,并与新生隐球菌以1∶10的比例共同孵育12小时后,western blotting检测ERK、JNK的表达水平,结果示,ERK、JNK表达无明显改变。
  本部分结果提示:IL-17可以通过上调MAPK信号通路表达调节新生隐球菌诱导的巨噬细胞CCL7的产生。
[硕士论文] 严晓南
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:现有的胃肠道动力检查方式多样,主要有消化道显像、导管测压、呼气试验、不透X线钡条法、无线动力胶囊等等。无线动力胶囊是检测胃肠道理化状态的功能性胶囊,是一种无创、无辐射检查方式,而其他检查方法多涉及核素标记、放射显影、置管测压等有辐射、有创操作。但是无线动力胶囊不能拍摄消化道图片,只能通过理化值的变化来推测胶囊的位置。为克服这一缺陷,新研发的压力胶囊内窥镜系统将理化检测与内镜、三维示踪技术结合,可以将图像、轨迹一同运用于评估胃肠道运动情况,有望提供一种更为舒适、安全、准确、全面的检查选择。
  目的:
  首先通过自身对照的动物实验研究,(1)探讨新型压力胶囊内窥镜系统的安全性,(2)使用压力胶囊内窥镜观察正常实验犬制备为便秘模型前后胃肠道动力情况的差异。进而对健康志愿者进行压力胶囊内窥镜检查,初步探索健康成年人胃肠道动力的情况。
  方法:
  首先对3只成年雄性比格犬的排便情况进行观察并留取血液、粪便标本,随后进行压力胶囊检查并对比检查前后实验犬的排便情况和血液、粪便化验结果。之后喂服复方地芬诺酯、盐酸阿洛司琼制备便秘模型成功后再次进行压力胶囊检查,与制备便秘模型前的检查结果进行自身对照,压力胶囊排出后留取犬胃肠道标本进行组织学检查。进而纳入1名符合入选标准的健康志愿者进行压力胶囊检查,获得其胃肠道运动状态的相关数据。
  结果:
  动物实验:
  1、压力胶囊获得正常实验犬消化道图像平均205.6±83.9张,压力及温度信息平均38266±17779.6次。正常实验犬全消化道检查平均时间748±369.6mi,体内温度平均38.4±0.4℃,全消化道绝对压力平均值107.63±8.43kPa。
  2、压力胶囊检查前后正常实验犬的每日排便次数、粪便性状、粪便重量以及血常规、肝肾功能电解质、粪常规均未出现显著改变(P>0.05),组织学检查未见明显病理性改变。
  3、压力胶囊在便秘模型犬结肠的通过时间较正常实验犬显著延长(2222.7±239.8vs.453±372.4min,P=0.004),而在胃、小肠的检查时间没有统计学差异(P>0.05)。
  4、压力胶囊在便秘模型犬测得的小肠压力值较正常实验犬显著升高(111.34±7.06vs.101.58±2.26kPa,P=0.01)。而便秘模型犬与正常实验犬胃部、结肠的压力没有统计学差异(P>0.05)。
  临床试验:
  1、压力胶囊共顺利获得健康志愿者消化道图像24798张,记录压力和温度信息35314次。
  2、健康志愿者胃排空时间为102min,结合压力、图像分析胃部收缩频率为0.15次/min,小肠通过时间为224min、小肠管腔收缩频率为0.96次/min。
  3、健康志愿者胃部绝对压力变化范围为101.9至110.4kPa,小肠为102.7至111.6kPa。
  4、压力胶囊在胃内的平均速度为6.57cm/min、小肠内为2.74cm/min、结肠内为2.88cm/min。
  结论:
  运用压力胶囊内窥镜系统检测胃肠道动力安全可行,可成功收集消化道的图像、温度、压力信息并描记压力胶囊在胃肠道内的运动轨迹。便秘模型犬的小肠压力、结肠排空时间较正常实验犬显著增加。我们开展的压力胶囊第一例人体试验,通过图像、压力、三维示踪技术相结合,成功获得健康志愿者胃肠道动力数据。压力胶囊内窥镜系统将胃肠道动力检测变得可视化、空间立体化,具有广阔的应用前景。
[硕士论文] 牛文豪
内科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:青年心肌梗死发生率在全球范围内呈上升趋势,尤其是在中国这样的人口大国。然而,目前国内外对该人群临床特点及危险因素研究尚不足。
  方法:自2015-01-01至2016-12-31本研究从上海4家三级甲等医院共收集380例病例(其中青年心梗143例、老年心梗237例),并对两组人群临床特点、危险因素、冠脉病变严重程度、心脏超声特点、发病时间的节律特点及预后进行多中心回顾性研究及统计分析。同时收集24例青老年心梗患者(青年心梗患者12例,老年心梗患者12例)分析其CLOCK和TM-1基因表达。
  结果:青年心肌梗死患者与老年心肌梗死患者相比,男性(95.80%VS74.26%)、吸烟(68.53%VS26.16%)高于老年组(P<0.01)。而老年心肌梗死患者的高血压病史(71.31%VS36.36%)、糖尿病病史(38.82%VS12.59%)明显高于青年组(P<0.01)。青年患者的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均明显高于老年组(P<0.01),而老年患者BNP明显高于青年患者(P<0.01)。至于心脏彩超方面,青年患者左室舒张末期内径(LVEDd)较老年患者高(P<0.01),但两组射血分数无统计学差异。冠状动脉造影显示,青年患者单支病变者高于老年患者(P<0.01),而老年患者多支病变多于青年患者(P<0.01),青年患者与老年患者相比,左前降支(LAD)病变无统计学差异,但左主干(LM)、左回旋支(LCX)及右冠状动脉(RCA)病变更多见于老年组(P<0.05、P<0.01、P<0.01),青年患者比老年患者Gensini评分低,且有统计学意义(P<0.01)。两组患者预后方面,老年患者平均住院日及住院死亡率均高于青年患者(P<0.01;P<0.05)。相比较老年患者,青年患者以06:00-12:00发病率较高(P<0.01),对两组患者上午10:00CLOCK与TM-1基因分析发现,青年患者CLOCK表达较老年高,而TM-1表达比老年患者低(p<0.05)。
  结论:青年心肌梗死发病的危险因素主要有男性、吸烟史、高总胆固醇、高甘油三酯、高低密度脂蛋白胆固醇等,而且常见于清晨发病,青年患者上午CLOCK表达较高,TM-1表达较低,可能是其清晨高发的机制。针对这些青年心肌梗死人群应根据其独特的临床特点做到早预防、早发现、早治疗,以便降低其死亡率、改善预后。
[硕士论文] 苏继源
内科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景及目的:
  动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被看作是导致急性心脑血管事件发生发展最主要的病因,其核心病理表现为富含脂质的斑块,目前尚缺乏可快速稳定和消退斑块的措施。根据中医理论,AS属于痰瘀互结的范畴,脉络被腹中之痰浊所阻塞后,日久营血瘀滞,就此形成痰浊瘀血相凝之结块。本课题组前期实验证实:“痰瘀同治”方药(下文简称复方中药)可有效抑制AS的进展,但机制与他汀不同。已知胆汁酸肠肝循环是体内胆固醇代谢的关键环节,重吸收的胆汁酸是机体生成胆固醇的重要前体,故经肠道重吸收入血的胆汁酸也可被视为“腑中之痰浊”。我们前期研究发现:复方中药干预AS模型小鼠后,可显著抑制胆汁酸的重吸收,加速其自粪便排出,同时保持末端回肠粘膜结构完整。故此,本研究目的在于探究“痰瘀同治”方药祛除腹中痰浊抑制AS发生和发展的新机制,为传统中医药防治心脑血管疾病提供新策略和新方法。
  研究方法:
  1、人结肠腺癌Caco-2单层细胞模型建立及评价:于Transwell细胞小室内接种Caco-2细胞,培养至21天,此过程中通过不同时间点连续监测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化来明确单层细胞构建成功,将细胞随机分为空白对照组、胆汁酸刺激组及复方中药预干预+胆汁酸刺激组。
  2、复方中药对Caco-2细胞胆汁酸吸收的影响:1)复方中药对胆汁酸跨膜转运作用的研究:通过柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)定量分析各组Caco-2单层细胞模型对胆汁酸的跨膜转运情况;2)复方中药对胆汁酸吸收作用机制的研究:基于上述细胞模型,各组给予不同处理后,通过qRT-PCR和Western Blot定量分析细胞内胆汁酸吸收相关基因mRNA及蛋白的表达水平。
  3、复方中药对Caco-2单层细胞模型屏障功能及细胞氧化应激水平的影响:1)复方中药对Caco-2细胞屏障功能保护作用的研究:在上述Caco-2细胞模型中,各组给予不同处理后,评估各组荧光染料渗透率和TEER的变化,分析上述干预对Caco-2单层细胞渗透性的影响;随后通过qRT-PCR和Western Blot分析细胞间紧密连接相关基因mRNA及蛋白表达水平的变化;2)复方中药对细胞氧化应激水平影响的研究:通过荧光探针法和流式细胞术定量分析上述Caco-2单层细胞模型中ROS的生成以及凋亡的差异。
  研究结果:
  1、Caco-2单层细胞模型的建立及评价:Transwell小室内培养Caco-2细胞9天时TEER值已达到(510.93±44.54)Ω·cm2,当细胞培养至19天和21天时,TEER值显著高于500Ω·cm2的模型建立标准。Caco-2细胞培养至8天时,单层细胞顶端(apical side,AP)ALP活性与底端(basolateral side,BL)相比显著升高(P<0.05),当细胞培养至19天与21天时,Transwell小室两侧ALP活性的比值进一步扩大,达到2.68∶1、3.44∶1。
  2、复方中药抑制胆汁酸吸收的作用机制研究:1)与相应的胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可以显著降低胆酸(cholic acid,CA)、甘氨胆酸(glycocholic acid,GCA)以及牛磺胆酸(taurocholic acid,TCA)在Transwell细胞小室下室中的浓度(P<0.05),但对DCA无显著作用(P>0.05);2)究其机制而言,复方中药预处理可对抗CA、GCA以及TCA三者导致的Caco-2细胞顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter,ASBT)、有机溶质转运体β(organic solute transporter,OSTβ)mRNA及蛋白表达水平的升高(P<0.05),但对回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)的mRNA表达无显著影响(P>0.05);复方中药预处理对脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβmRNA及蛋白表达水平的改变无显著影响(P>0.05),但可对抗IBABP mRNA表达水平的下降(P<0.05);复方中药预处理可对抗GCA以及TCA所导致的OSTαmRNA表达水平的升高(P<0.01),但对CA、DCA无显著影响(P>0.05),提示:复方中药可有效抑制Caco-2细胞对胆汁酸的吸收,但对于不同胆汁酸其抑制作用和机制有所差异。
  3、复方中药对肠道上皮细胞屏障功能保护作用的研究:1)与单纯胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可显著抑制CA、DCA以及GCA导致的细胞渗透性增加(P<0.05)以及TEER值的降低(P<0.05),上述保护作用伴随紧密连接蛋白中咬合蛋白(occludin,Ocln)和闭锁小带蛋白2(zonula occluden2,ZO2)mRNA及蛋白表达水平的显著上调(P<0.05),但对TCA刺激所导致的改变无显著影响(P>0.05);2)在闭合蛋白1(claudin1,Cldn1)mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA和DCA的病理作用无显著影响(P>0.05);在ZO1mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善DCA、GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA无显著影响(P>0.05);3)复方中药预处理可显著降低CA、DCA和GCA刺激所诱导的细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增高(P<0.05)以及细胞凋亡(P<0.01),但对TCA无显著影响(P>0.05)。提示:复方中药可提供一定的肠道黏膜的保护作用,其对抗不同胆汁酸的保护作用以及机制有所差异。
  研究结论:
  本研究在前期动物在体实验的基础上进一步探讨复方中药抑制胆汁酸吸收及改善肠道上皮细胞屏障功能作用的机制,揭示了:1)复方中药可以有效抑制肠道上皮细胞对胆汁酸的吸收,该作用可能主要是通过下调ASBT和OSTβ基因mRNA及蛋白的表达来实现,其是复方中药抑制胆汁酸吸收的潜在作用靶点;2)复方中药能够显著对抗胆汁酸所引起的肠道屏障功能失调,上述保护作用可能主要是通过调节紧密连接蛋白Ocln和ZO2的表达以及抑制细胞内氧化应激水平和凋亡来实现。综上所述,复方中药可通过抑制胆汁酸在肠道的重吸收及维持肠道上皮细胞屏障功能,即祛除“腑中之痰浊”,从而发挥其降脂抗AS的作用。
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