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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[博士论文] 刘兵
血管病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原发性高血压病是一种人类常见的慢性病,它是以血压升高为主要特征,并伴有血管、心脏等重要脏器并发症的一种严重威胁人类健康的疾病,发病率长期居高不下。有调查显示,中国有23.3%的成年人约2.45亿患有高血压病,而根据2017年美国心脏病协会/美国心脏协会新修订的高血压标准(收缩压≥130mmHg,舒张压≥80mmHg),中国高血压的患病率高达46.4%,而中国高血压的控制率为17%。因此,对高血压发病机理的研究和寻找更高效的的治疗策略,仍是当前生物医学界研究的热点。高血压病除外周心血管系统的一系列特征表现外,中枢神经系统交感输出亢进是高血压病发生和发展的重要机制之一。在中枢神经系统的众多核团中,头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感输出和基础血压的关键中枢,RVLM神经元功能异常与高血压和交感兴奋性增高密切相关。
  研究证实中枢肾素血管紧张系统(Renin-angiotensin system,RAS)过度激活是高血压病中枢交感输出的重要机制之一,增多的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以降低中枢压力敏感反射,增强中枢交感缩血管紧张性,导致血压的异常增高。血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme2,ACE2)是肾素血管紧张系统家族中的新成员,ACE2将血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)和AngⅡ转化成血管紧张素-(1-7)[Angiotensin(1-7),Ang-(1-7)],并拮抗AngⅡ的升压效果而发挥作用,而RAS和ACE2相关轴之间的平衡对维持正常血压和自主神经功能的中枢调节非常重要。已有研究证实,原发性高血压状态下大鼠RVLM内ACE2的表达显著下降,而在该区域过表达ACE2可使血压和肾交感活性显著下降。因此,ACE2在中枢调控心血管功能中的作用十分显著,也是当前寻求新的高血压防治策略的研究靶点之一,但目前高血压中枢ACE2功能降低的机制尚不清楚。
  细胞中ACE2是Ⅰ型跨膜蛋白,由细胞外的N端结构域、跨膜结构和一个短的胞内C末端组成,细胞外液中可溶性ACE2的形式为缺乏其胞内和跨膜结构域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究较为广泛,而上游对其调控的机理目前尚不清晰,研究较少。有研究显示镶嵌在细胞膜表面的解聚素和金属蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases17,ADAM17)可以调节细胞ACE2活性,ADAM17可以剪切细胞表面的多种蛋白质,从而发挥其多样的生理功能。它在机体内很多个器官都有表达,参与了一些生理和病理进程。ADAM17在细胞膜表面可以通过蛋白水解作用,剪切细胞膜上的ACE2,使得ACE2胞外部分脱落,进入细胞外液,降低细胞膜上ACE2的活性功能,导致细胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠肾小管中,ADAM17表达增加,它通过剪切细胞膜上ACE2使得尿液中的游离ACE2片段(70KDa)增加,给予胰岛素可逆转这一状况。有研究证实AngⅡ灌注下,心脏ADAM17活性增加,ACE2表达减少且活性下降,最终引起心脏肥大和纤维化。组织基质金属蛋白酶抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP3)是ADAM17的内源性抑制剂,它可以抑制了ADAM17介导的底物胞外域脱落。有研究报道,AngⅡ诱导可以增加心肌TIMP3表达增加,而AngⅡ的灌流两周不能使TIMP3-/-小鼠的心脏肥大,可见TIMP3参与AngⅡ诱导心肌肥大的病理过程。研究证实中枢脑组织中存在ADAM17的表达,其是杏参与中枢特别是交感中枢RVLM内ACE2的调节,仍不清楚。有研究报道,白藜芦醇(resveratrol,RSV)在外周可以增加TIMP3表达,而果糖诱导的高血压大鼠口服RSV的1周后血压下降,那么RSV是否通过TIMP3/ADAM17作用,增加了中枢内ACE2的功能从而参与血压的调控呢,仍不清楚。
  RSV是一类多酚类化合物,具有多种的心血管调节保护功能。RSV在很多病理和生理条件下可以增加ACE2的表达和活性,改善疾病状态。如RSV通过上调腹主动脉和肾上主动脉的ACE2的表达和活性来抑制ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤的生长。此外,摄入RSV可以增加高脂饮食小鼠脂肪组织中ACE2的表达,而降低ACE的表达。此前,本课题组发现高血压大鼠中枢第四脑室灌流RSV产生抗高血压效应,且高血压大鼠RVLM内ACE2的变化直接影响血压和交感输出,而ACE2的活性受到ADAM17的调控,同时ACE2和ADAM17也受到AngⅡ的调节,那么RSV在中枢的抗高血压效应是否通过ADAM17蛋白介导调节RVLM内的ACE2活性来参与的呢?中枢RVLM内RAS系统异常是否通过ADAM17介导调节ACE2的活性并参与高血压的形成呢?
  因此,根据以上背景确立本课题的研究目标是(1)高血压大鼠中枢ACE2活性下降是否与TIMP3/ADAM17的异常相关,正常血压大鼠WKY中枢灌流AngⅡ能否在RVLM内通过TIMP3/ADAM17来降低ACE2活性;(2)RSV在交感中枢RVLM是能否来调节ACE2的表达和活性,能否对TIMP3/ADAM17通路产生调节作用;(3)在PC-12细胞中干扰TIMP3的表达,能否拮抗RSV对ADAM17和ACE2调节作用。
  方法:
  实验动物为雄性正常血压Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR),动物体重在250-330g之间,细胞模型为PC-12细胞系。通过第四脑室灌流RSV对大鼠中枢施行持续定量给药,使用无创尾动脉法动态监测实验大鼠血压,使用脑定位微透析法对RVLM的细胞外液进行收集,采用WKY第四脑室灌流AngⅡ来确定其对RVLM内ADAM17和ACE2的影响,使用免疫荧光共聚焦法检测RVLM神经元ADAM17的表达,使用淬灭荧光底物检测脑组织及脑脊液中的ACE2活性。
  结果:
  一、高血压大鼠RVLM前交感神经元ADAM17表达增加
  免疫荧光检测显示大鼠RVLM前交感神经元存在ADAM17的表达;通过Western Blot检测大鼠ADAM17蛋白表达显示:SHR组的RVLM内ADAM17表达显著高于对照组WKY组(P<0.05,n=5)。
  二、AngⅡ通过TIMP3/ADAM17途径下调RVLM内ACE2的功能
  (一)AngⅡ减弱RVLM细胞上ACE2功能而增强RVLM细胞外液ACE2活性。WKY第四脑室分别灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)和AngⅡ一周。相比灌流aCSF,灌流AngⅡ一周后平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)显著增高[MAP:113±4vs.151±4mmHg;HR:360±5vs.395±6beats/min(BPM),P<0.05,n=5],使用试剂盒检测实验标本ACE2活性发现:灌流AngⅡ的WKY组(WKY+AngⅡ)RVLM组织内ACE2活性低于对照组(WKY+aCSF)的活性(454±44.7vs.180±73.2AFU/μg/min,P<0.05,n=5),而RVLM的细胞外液(脑脊液)ACE2活性显著高于对照组(1370+470vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=5)。
  (二)AngⅡ减少RVLM组织内TIMP3表达并增加ADAM17表达。Western Blot检测显示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM内ADAM17表达水平高于对照组(WKY+aCSF),而TIMP3的表达水平则低于对照组。
  三、中枢白藜芦醇(RSV)通过TIMP3/ADAM17通路上调高血压大鼠RVLM内ACE2功能
  第四脑室灌流实验分成四组WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。
  (一)中枢RSV降低高血压大鼠的血压。SHR第四脑室灌流RSV(SHR+RSV)后,第5天血压开始下降,约在第7天下降至最低值后趋于平缓稳定,与对照组SHR+aCSF相比,SHR+RSV组血压显著下降(161±2vs.143±2mmHg,P<0.05,n=5)。而WKY的血压与灌药前相比无明显变化(P>0.05,n=5)。
  (二)RSV增加高血压大鼠RVLM组织ACE2活性,并减少RVLM细胞外液ACE2活性。使用试剂盒分别检测脑组织和透析液中的ACE2活性显示:SHR+aCSF组RVLM内细胞外液(脑脊液)的ACE2活性显著高于WKY+aCSF(1455+287vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=8)而RVLM组织内的活性则显著低于WKY+aCSF组(291±13.2vs.464.0±48.5AFU/μg/min,P<0.05,n=8)。
  结论:
  高血压大鼠RVLM内ACE2表达与活性的下降与增多的中枢AngⅡ诱导的ADAM17功能增强相关,而中枢RSV通过TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM内ACE2的表达和活性,改善心血管功能,本研究揭示高血压中枢ACE2调节的新机理,为高血压的防治策略提供了新的思路。
[硕士论文] 邵壮
内科学(风湿病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 风湿免疫性疾病所致动脉瘤的回顾性临床研究
  研究目的:
  本研究旨在通过回顾性分析探究风湿免疫性疾病所致动脉瘤的发病情况及临床特点,以期在今后的临床工作中更准确、合理地进行诊治。
  研究方法:
  选择2001年1月1日至2017年12月31日在海军军医大学(原第二军医大学)附属长海医院诊断动脉瘤的住院患者的病历资料作为总体研究对象,根据患者的既往病史、临床症状、体征、实验室结果、影像学及病理学结果筛选出风湿免疫性疾病所致动脉瘤,分析其病因构成、性别年龄差异、动脉瘤分布情况和影像学特点,并与其它非风湿免疫原因所致动脉瘤在年龄、病程、全身/局部症状、各系统受累情况、实验室指标等方面进行分析比较,使用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析。
  研究结果:
  1、本次研究共纳入动脉瘤患者9174例,其中165例为风湿免疫性疾病所导致,在整体病因构成中约占1.80%,其中男性76例,女性89例,发病比例女性患者>男性(2.68%和1.30%,x2=22.707,P<0.001),出现多发性动脉瘤比例高于非风湿性疾病组(33.33%和18.09%,x2=25.101,P<0.001)。起病年龄与发生动脉瘤年龄(34.76±14.16岁;40.35±15.96岁)分别高于先天性动脉发育异常组(29.44±14.14岁,t=4.189;36.16±14.45岁,t=3.145;P<0.001),分别低于高血压/高脂血症/动脉粥样硬化组(53.42±10.22岁,t'=-16.832;61.08±12.44岁,t'=-16.576;P<0.001)、外伤/医源性损伤组(48.26±16.98岁,t'=-8.994;48.94圭16.91岁,t=-5.274;P<0.001)和致病微生物感染组(53.87±17.00岁,t=-8.069;54.44±17.05岁,t=-5.461;P<0.001);病程长于外伤/医源性损伤组(3.0和0.5年,U=8257.5,P<0.001)以及致病微生物感染组(3.0和0.5年,U=1400.5,P<0.001),短于高血压/高脂血症/动脉粥样硬化组(3.0和5.0年,U=507263.5,P<0.001)。
  2、风湿免疫疾病组患者中出现全身症状(包括疲劳乏力、发热、贫血和体重下降)的比例较高(46.67%和12.61%,x2=163.797,P<0.001),其中以疲劳乏力(43例,26.06%)最为常见;在局部症状和其它各系统受累方面,出现血管杂音、皮肤黏膜和关节肌肉病变的比例分别高于非风湿性疾病组患者(33.94%和14.22%,x2=50.613;13.33%和0.07%,x2=937.256;3.64%和0.08%,x2=145.013;P<0.001);在实验室检验方面,其血红蛋白(Hemoglobin,Hb)水平低于非风湿性疾病组患者(117.14±22.19和124.46±20.00g/L,t=-4.651,P<0.001),C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)水平高于非风湿性疾病组患者(15.20和7.31mg/L,U=41492.5;28和15mm/H,U=40556.0;P<0.001)。
  3、风湿免疫性疾病所致动脉瘤的病因以大动脉炎(Takayasu arteritis,TA)(96例,58.18%)最为常见。不同性别间在病因构成方面存在差异(x2=50.937,P<0.001),其中男性多见于TA(31例,40.79%)、白塞病(Behcet's disease,BD)(16例,21.05%)和慢性主动脉周围炎(Chronic periaortitis,CP)(15例,19.74%),女性多见于TA(65例,73.03%)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)(13例,14.61%)和巨细胞动脉炎(Giant cell arteritis,GCA)(4例,4.49%)。病变血管以腹主动脉最常受累(80处,29.30%),不同疾病在其它受累动脉的分布上也存在一定差异。
  4、病理学及影像学检查对于临床诊断和鉴别诊断具有重要意义,但仍需要根据患者病情、临床症状、体征及实验室检验结果等综合判断。
  5、糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)和免疫抑制剂仍然是治疗风湿免疫性疾病所致动脉瘤的经典药物。除动脉瘤体积过大或破裂等紧急情况外,建议在动脉炎症反应控制后进行外科干预,或者在外科治疗的同时使用药物治疗,必要时多学科协同诊治。
  研究结论:
  风湿免疫性疾病所致动脉瘤患者的发病比例女性高于男性,与其它病因动脉瘤患者相比,在起病年龄、发生动脉瘤年龄、病程时间方面存在差异。临床上出现多发性动脉瘤、全身症状、局部血管杂音、皮肤黏膜和关节肌肉受累的比例较高。实验室检验结果中Hb平均水平较低,CRP和ESR平均水平较高。TA是最常见的病因,不同性别间在病因构成方面存在差异,病变血管以腹主动脉最常受累。病理学及影像学检查对于临床诊断具有重要意义,GC和免疫抑制剂仍然是经典治疗药物,临床上需要根据患者病情、临床症状、体征及各种辅助检查结果多学科协同判断诊治。
  第二部分 96例大动脉炎动脉瘤的回顾性临床研究
  研究目的:
  通过前一部分研究发现,TA是风湿免疫性动脉瘤中最常见的病因。因此本部分研究旨在回顾性分析TA动脉瘤的发病规律、临床特征、疾病活动性和血管造影分型等方面情况。
  研究方法:
  选择2001年1月1日至2017年12月31日在海军军医大学(原第二军医大学)附属长海医院诊断TA的住院患者的病历资料作为总体研究对象,根据有无动脉瘤形成分为动脉瘤组和非动脉瘤组。回顾性分析患者的一般资料、临床症状和体征、动脉瘤特征、各系统受累情况、实验室及影像学检查结果,根据1996年Numano学组制定的标准进行分型,并应用印度大动脉炎临床活动性评分(Indian Takayasu Clinical Activity Score,ITAS2010)评估患者的疾病活动性,使用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析。
  研究结果:
  1、本研究中TA患者共397例,其中并发动脉瘤患者96例,总体发生率约24.18%。患者出现动脉瘤的平均年龄为34.06±12.47岁,起病至出现动脉瘤的平均中位时间为2.0(1.0,3.0)年。TA动脉瘤组患者男女比例为1∶2.1,而男性作为TA动脉瘤的危险因素(OR=0.258,95%CI0.147-0.452,P<0.001),其发生动脉瘤比例明显高于女性(48.44%和19.52%,x2=24.486,P<0.001)。
  2、TA动脉瘤的发生部位以腹主动脉(39处,25.00%)最为常见,其后依次为颈动脉(24处,15.38%)、升主动脉(23处,14.74%)、胸降主动脉(22处,14.10%)和肾动脉(12处,7.69%)。与非动脉瘤组患者相比,TA动脉瘤组患者出现疼痛和血管杂音的比例较高(63.54%和36.88%,x2=21.076;51.04%和36.88%,x2=6.070;P<0.05),而脉搏减弱或消失发生比例较低(59.38%和76.08%,x2=10.084,P<0.05);出现心脏并发症、消化系统症状的比例较高(31.25%和15.95%,x2=10.797;15.63%和5.32%,x2=10.746;P<0.05),而神经系统症状发生比例较低(59.38%和73.09%,x2=6.491,P<0.05);在实验室检验方面,C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的平均水平较高(13.30和7.55mg/L,U=5582.5,P<0.05)。
  3、总体TA患者的血管造影分型以Ⅰ型(155例,39.04%)最为常见,动脉瘤组患者中则以Ⅴ型(30例,31.25%)最为常见。与非动脉瘤组患者相比,两组间在血管造影分型方面存在差异(x2=22.813,P<0.05),其中TA动脉瘤组患者出现Ⅰ型病变的比例较低(20.83%和44.85%,x2=17.641,P<0.05),而Ⅱa型病变的比例较高(11.46%和4.32%,x2=6.532,P<0.05)。
  4、糖皮质激素(Gluco corticoids,GC)仍然是治疗TA动脉瘤的一线药物,临床疾病活动性评估与实际疾病活动情况之间存在非一致性。药物治疗的目标是使病情得到有效控制,有必要在围手术期使用GC和/或其它免疫抑制药物治疗。
  研究结论:
  本次研究中TA动脉瘤的总体发生率约24.18%,男性作为TA动脉瘤的危险因素,其发生动脉瘤的比例明显高于女性,发生部位以腹主动脉最为常见。与非动脉瘤组患者相比,TA动脉瘤组患者出现疼痛、血管杂音、心脏并发症和消化系统症状的比例较高,而脉搏减弱或消失、神经系统症状发生比例较低;实验室检验结果中CRP的平均水平较高;血管造影分型以Ⅴ型最为常见,出现Ⅰ型病变的比例较低,而Ⅱa型病变的比例较高。GC仍然是一线治疗药物,临床疾病活动性评估与实际疾病活动情况之间存在非一致性,有必要在围手术期使用GC和/或其它免疫抑制药物使病情得到有效控制。
[硕士论文] 谢芳
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症(sepsis)是指严重感染导致的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),宿主针对感染的特异性免疫反应失调,进而可导致脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),乃至引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是ICU患者的主要死亡原因,其发病率仍然很高。脓毒症急性呼吸窘迫综合征的病理生理学机制非常复杂,包括炎症激活、炎细胞浸润、凝血系统激活和肺上皮屏障损伤等,其中肺上皮是急性呼吸窘迫综合征时肺部防御损伤的一种重要结构。在ARDS的致病过程中,各种炎症因子、粘附分子、趋化因子和细胞因子等不断释放参与肺部炎症反应,如肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干扰素。肺上皮细胞能够分泌多种细胞因子调控肺的天然免疫,目前却没有关于肺上皮细胞表达能够调控肺部天然免疫的分泌蛋白。因此,对于肺上皮细胞在脓毒症急性呼吸窘迫综合征的基因表达及相关分泌蛋白的机制探讨值得研究,肺上皮细胞表达的分泌蛋白有望成为临床上治疗脓毒症的新的分子靶点。
  sectm1b基因是一种新型人类编码基因,其基因表达的蛋白为sectm1b,即跨膜与分泌蛋白1b,属于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表达调控机制以及效应并不清楚,关于sectm1b的研究也非常少。有研究认为:sectm1b可以抑制TCR介导的T细胞活化从而发挥促炎的功能。炎症反应的失衡是脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的主要原因。右美托咪定作为ICU临床常用的镇静药物,最近几年,因为发现其具有抗炎的作用而逐渐被大家所关注,但目前没有关于右美托咪定对脓毒症ARDS时sectm1b表达的影响及抗炎作用的研究。另外,肺上皮细胞分泌的sectm1b能够促进中性粒细胞表达和释放促炎症因子,对中性粒细胞募集到肺部感染部位具有调控作用。但是,sectm1b对脓毒症ARDS时肺上皮细胞功能的作用及其可能的机制,目前尚未见报道。
  本研究拟通过在体与离体实验,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS的影响及作用机制。首先,对脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证;其次,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制;最后,探讨右美托咪定对脓毒症ARDS小鼠抗炎作用及其机制的研究,同时探讨了右美托咪定在脓毒症ARDS发挥抗炎保护作用时对肺上皮细胞sectm1b表达的影响。
  第一部分 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证
  目的:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的基因芯片筛选与分析,在体实验和离体实验验证脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b。
  方法:
  1.取雄性C57小鼠,构建CLP所致脓毒症ARDS小鼠模型,分离CLP术后0h、6h、12h、24h的左肺组织,利用基因表达谱芯片检测CLP术后不同时间及正常对照小鼠肺上皮细胞基因表达差异。利用基因表达热图分析、genecard软件分析及查阅文献重点分析细胞因子与趋化因子等分泌性蛋白的表达。
  2.取约8周龄雄性C57小鼠,随机分为四组,分别为:CLP术后0h、CLP术后6h、CLP术后12h、CLP术后24h。
  a.取每组小鼠肺组织,左肺组织行HE染色,并进行病理学评分;右肺组织提取mRNA,采取RT-PCR技术检测sectm1b mRNA的表达情况。
  b.取每组小鼠支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式细胞术进行中性粒细胞计数。
  c.于每组小鼠行眼球取血,离心后取血清,采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。
  3.用LPS刺激小鼠肺上皮细胞MLE12,于LPS诱导后0h、6h、12h、24h提取mRNA,利用RT-PCR检测肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达,同时收集上清,采用ELISA检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
  结果:
  1.脓毒症ARDS小鼠肺组织中基因表达差异显著,其中sectm1b在CLP术后12h表达显著增高,24h表达下降。
  2.
  a.HE染色结果显示:CLP术后小鼠肺组织病理损伤明显加重,且术后12h损伤程度强于24h,病理学评分增高(P<0.05)。sectm1b mRNA表达差异显著(12小时大于正常约30倍)(P<0.05)。
  b.ELISA结果显示:与正常对照比较,肺泡灌洗液和血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。CLP术后中性粒细胞计数明显增多(P<0.05)。
  3.与正常相比,脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞sectm1b表达增高(P<0.05),上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。
  结论:
  脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b,脓毒症ARDS小鼠在体实验模型与离体实验模型建立成功,为后续的在体和离体实验提供了可靠的实验基础。
  第二部分 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制探讨
  目的:
  研究sectm1b对LPS诱导的肺上皮细胞在脓毒症ARDS炎症反应中的作用及其机制探讨。
  方法:
  采用siRNA转染技术沉默sectm1b基因的表达,研究在LPS诱导的肺上皮细胞MLE12在沉默sectm1b时对脓毒症ARDS炎症反应的作用及其机制。实验分为:NCsiRNA组和sectm1b siRNA组,转染48小时后,分别用LPS刺激,提取LPS刺激后不同时间点的细胞总mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技术检测sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表达,用ELISA技术检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平,利用western-blot方法检测炎症相关信号通路(NF-κβ/MAPK)相关分子的表达。
  结果:
  1.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,RT-PCR显示sectm1b siRNA组sectm1b的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
  2.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导6h、12h、24h后,sectm1b siRNA组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平较NC siRNA组降低(P<0.05),同时ELISA结果显示sectm1b siRNA组上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平较NCsiRNA组降低(P<0.05)。
  3.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,与NC siRNA组相比,sectm1bsiRNA组的p65/p38/erk磷酸化表达水平下降(P<0.05)。
  结论:
  肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS具有促炎作用,其促炎作用可能与NF-κβ/MAPK信号通路的激活有关,表明sectm1b在脓毒症肺上皮细胞的损伤具有重要作用。
  第三部分 右美托咪定对脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b表达的影响及保护作用研究
  目的:
  探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)在脓毒症小鼠肺上皮细胞炎症反应中的作用及其对sectm1b表达的影响。
  方法:
  将C57小鼠随机分为3组:CLP组、CLP+Dex组、Sham组。给药组在小鼠CLP术前15min腹腔注射右美托咪定(50ug/Kg),CLP组小鼠在术前15min腹腔注射等体积的无菌生理盐水。收集每组CLP术后0h,6h,12h,24h的血清和肺泡灌洗液(BALF),用酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,记录24h内小鼠的存活率。体外培养传代小鼠肺上皮细胞MLE12,分为空白对照组(未进行任何处理)、脂多糖组(LPS,1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定组(LPS,1ug/ml+Dex,0.2ug/ml),RT-PCR检测总细胞中sectm1b mRNA的表达,酶联免疫吸附实验检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,蛋白质印迹实验检测ERK1/2和JNK磷酸化水平。
  结果:
  1.与CLP组相比,右美托咪定组脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达下降,小鼠24h内的存活率上升(P<0.05)。
  2.与脂多糖组相比,右美托咪定组上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达减少,并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P<0.05)。
  3.与脂多糖组相比,右美托咪定组肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达下降(P<0.05)。
  结论:
  右美托咪定能够影响脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b的表达,同时能够减少脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的产生,提高脓毒症小鼠24h内的存活率,对小鼠肺上皮细胞炎症反应发挥保护作用,且右美托咪定的这种作用可能与抑制ERK1/2和JNK的激活有关。
[博士论文] 王艳歌
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本课题采用HSC细胞系模型,合成并转染虫源miRNA的mimics,大量筛选并初步鉴定能活化HSC细胞和上调纤维化相关标志基因表达的虫源miRNA。同时,我们分离感染血吸虫小鼠的原代HSC,通过高通量测序鉴定存在于HSC的虫源miRNA。基于体外激活HSC-T6筛选、宿主HSC内高通量测序鉴定虫源miRNA及其特异性方面,我们选取了既能参与宿主肝纤维化调控又能进入宿主HSC的虫源miRNA(即Sja-miR-2162)作为本课题的研究对象,研究其对宿主肝纤维化的调控作用及其分子机制,包括:在体外HSC中确定其活化HSC和促纤维化发生的作用;通过在正常小鼠中过表达虫源miRNA或在感染小鼠中对虫源miRNA进行干预,检测小鼠肝纤维化程度及HSC活化状态,从而确定虫源miRNA在血吸虫病肝纤维化中的功能;通过生物信息学预测虫源miRNA的宿主靶基因,并通过体内、体外实验验证两者的靶向关系及调控的信号通路,从而阐明虫源miRNA调控血吸虫病肝纤维化中的分子机制。本研究取得了以下结果:
  1.虫源miRNA的筛选与鉴定
  为从日本血吸虫miRNA中筛选和鉴定出能够活化HSC并促进纤维化相关基因表达的的虫源miRNA,本课题选取了本实验室及其他实验室鉴定的日本血吸虫miRNA共51条,合成其miRNA mimics,并采用HSC细胞系(HSC-T6)作为体外细胞模型进行筛选,虫源miRNA mimics转染HSC-T6,48小时后采用qPCR技术检测HSC活化标志基因(Col1α1、Col3α1和α-SMA)的表达水平。结果显示,Col1α1、Col3α1和α-SMA表达水平相比对照组,表达水平显著升高的有19条虫源miRNAs,表达水平显著下降的有4条虫源miRNAs。23条虫源miRNA中有15条为血吸虫特异性miRNA,8条为保守miRNA。这些结果表明了虫源miRNA可调控宿主HSC的激活。
  2.感染小鼠HSC分离及虫源miRNA的检测
  (1)原代HSC的分离和检测
  (2)二代测序分析感染小鼠HSC中的虫源miRNAs
  3.虫源Sja-miR-2162促进HSC的活化和肝纤维化的发生
  通过综合分析上述实验结果,本课题选取日本血吸虫Sja-miR-2162为研究对象,分析其在宿主肝纤维化中的作用及其分子机制。
  (1)Sja-pri-miR-2162过表达质粒的构建及其表达
  4.中和Sja-miR-2162抑制血吸虫病肝纤维化
  上述实验已经表明日本血吸虫产生的Sja-pri-miR-2162能分泌至体外,并进入宿主细胞,包括肝脏HSC。进入HSC的Sja-pri-miR-2162能够上调肝纤维化相关标志基因的表达,导致纤维化的发生。日本血吸虫感染的主要病理变化是肝纤维化的发生,以往的工作已经表明,血吸虫感染诱导宿主产生的一些因子,包括宿主miRNA和IL-13等,是导致宿主肝纤维化的主要因素。根据本课题上述结果,我们提出假设:在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性miRNA(Sja-miR-2162)起到促进肝纤维化的作用。对此,本课题设计了以下实验加以验证。
  (1)体外细胞模型验证:虫卵分泌的Sja-miR-2162进入HSC并调控肝纤维化相关基因表达
  (2)体外下调Sja-miR-2162可抑制HSC的活化
  (3)体内验证Sja-miR-2162能促进小鼠肝纤维化的作用
  为验证虫源Sja-miR-2162在体内能参与血吸虫病肝纤维化的过程,我们构建了能在肝脏中特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体(rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge)。将7周龄BALB/c雄性小鼠感染日本血吸虫后第24天注射1012v.g./只剂量的rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体,其中scramble组、PBS组以及正常小鼠组为对照组,在感染后第56天处死小鼠取肝脏检测其肝纤维化指标。结果显示,rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge组相比scramble组,羟脯氨酸含量显著下降(p<0.05),与肝纤维化相关的基因,如Col1α1、Col3α1、α-SMA、TIMP和Col4α1,其表达水平均显著下降(p<0.001),Masson三色染色显示肝组织中胶原蛋白沉积明显减少(p<0.05),HE染色显示虫卵肉芽肿面积显著减小(p<0.001)。分离各组小鼠的原代HSC并检测相关基因表达,在rAAV8-anti-Sja-miR-2162-sponge病毒载体感染组的HSC中,其Col1α1、Col3α1、α-SMA和TIMP表达水平均显著下降(p<0.001)。以上两部分结果验证了我们的假设,即血吸虫Sja-miR-2162可跨物种调控宿主肝纤维化。
  5.Sja-miR-2162的靶基因及其通路
  (1)靶基因的预测和验证:
  (2)上调Sja-miR-2162可抑制宿主TGFR3的表达
  (3)下调Sja-miR-2162促进靶基因TGFR3的表达
  在感染小鼠后第56天中分离的原代HSC中转染Sja-miR-2162抑制剂后,TGFR3的表达水平均显著升高(p<0.01);利用rAAV8载体在血吸虫感染小鼠肝脏中中和Sja-miR-2162后,肝组织和HSC中的TGFR3的表达水平则显著升高(p<0.01)。
  小结:本课题通过对日本血吸虫miRNA促纤维化功能的大量体外筛选以及对感染血吸虫小鼠HSC的深度测序,发现了血吸虫特异性虫源Sja-miR-2162在血吸虫感染过程中进入宿主HSC,并在体外细胞模型中显示出促纤维化作用。在此基础上,我们对Sja-miR-2162的促纤维化功能及其分子机制开展进一步的研究。通过体外原代HSC及HSC-T6细胞系研究显示,转染Sja-miR-2162mimics和过表达载体,均能促进HSC的活化。将表达Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染正常小鼠,后者的肝纤维化相关基因表达升高,同时,实验证实转入的Sj a-pre-miR-2162(前体)在宿主细胞能够加工为成熟的miRNA。在日本血吸虫感染和致宿主肝纤维化过程中,虫源性Sja-miR-2162是否能跨物种调控宿主的肝纤维化,这是本课题的重要科学问题。本课题从不同的角度阐明该科学问题:一是体外验证:采用Transwell小室将虫卵与原代HSC共培养,发现虫源性Sja-miR-2162进入HSC,并使HSC活化,但这种激活HSC作用可以被Sja-miR-2162抑制剂所阻断;二是体内外相结合的验证:分离和培养感染小鼠的原代HSC,并转染Sja-miR-2162抑制剂,发现转染抑制剂的原代HSC其肝纤维化相关基因表达下调;三是体内验证:将特异性下调Sja-miR-2162的rAAV8病毒载体转染感染小鼠,其肝纤维化相关基因表达下降。以上三方面的实验结果表明了虫源性Sja-miR-2162能跨物种调控宿主肝纤维化。本课题最后部分阐明了TGFR3是Sja-miR-2162靶基因,即:Sja-miR-2162是通过靶向TGFR3蛋白,继而上调TGF-β1/SMAD信号通路,提高肝纤维化相关基因的表达。本研究首次证实血吸虫的miRNA可进入宿主细胞并在宿主病理过程中发挥重要调控作用,从而丰富了我们对血吸虫病发病机制的认识,并为预防和治疗血吸虫病提供新的干预靶点和思路。
[硕士论文] 张艳达
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在急性心肌梗死患者中,其冠脉微血管系统常由于缺血再灌而发生不可逆损伤,最终导致缺血心肌血流供应再度减少,加重损害。相对于大血管,微循环约占机体脉管系统的20%,其在心肌组织中与心肌细胞的比例接近1∶1,但其作用尤其在冠脉血管疾病中的作用长久以来一直被人们所忽视。随着研究的深入,临床医生越来越认识到冠脉微循环障碍的重要性。由于相关的机制不清,当前尚缺乏有效手段来直接干预冠脉微循环障碍。因此,探究冠脉微循环障碍的发病机制及探寻行之有效的治疗举措便显得尤为重要。麝香通心滴丸已在临床上被证实具有明确的改善冠脉慢血流患者症状的作用,但是其是否通过直接作用于微循环,以及具体的作用的机制尚不清楚。本课题将探究麝香通心滴丸对模型小鼠的外周微循环障碍的改善作用及其可能作用的机制?
  目的:
  明确麝香通心滴丸溶液对急性心肌梗死联合腹腔脂多糖注射诱导的小鼠外周微循环障碍的改善作用并探讨其相关机制。
  方法:
  1、诱导小鼠外周微循环障碍模型:选用6周至8周C57雄性小鼠(20±2g)50只,随机分为假手术对照组(Control组)、微循环障碍模型组(急性心梗联合脂多糖诱导(MI+LPS)组)、模型联合麝香通心滴丸干预(SXTXDW)组、模型联合麝香通心滴丸及炔丙基甘氨酸干预(SXTXDW+PAG)组、模型联合硫氢化钠干预(NaHS)组。假手术对照组小鼠在异氟烷麻醉下行开胸但冠状动脉不结扎处理,而后四组小鼠在气麻下行冠脉前降支结扎手术,以标准Ⅱ导心电图ST段抬高作为判定标准。心梗手术1周后予以假手术对照组小鼠腹腔注射200ul生理盐水,而MI+LPS组、SXTXDW组、SXTXDW+PAG组和NaHS组小鼠腹腔注射脂多糖溶液(2mg/kg)。采用Evan Blue合并TTC染色、小动物心电图评估小鼠心肌梗死情况,小动物超声评估小鼠心功能。
  2、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的作用:腹腔注射LPS24小时后给予不同组的小鼠相对应的干预措施。采集图像并分析提睾肌微循环血流速度和白细胞粘附数。运用激光多普勒测定小鼠肠管血流灌注情况。通过流式细胞仪检测小鼠白细胞表面CD11b和CD62L表达改变。实验终点,处死小鼠,留取提睾肌、心肌、白细胞和主动脉标本,检测以上标本CSE相对表达量。
  3、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的可能分子机制:通过DAPI染色评估不同干预组小鼠白细胞体外粘附水平,并对可能参与调解的FOXO1相对表达量及其线粒体DNA相对拷贝数进行分析。
  结果:
  1、与Control组相比,MI+LPS组小鼠心功能、提睾肌微血管血流速度和肠管血流灌注量明显降低(p<0.05)。提示:急性心梗手术合并腹腔注射脂多糖可诱导小鼠外周微循环障碍。
  2、与Control组相比,MI+LPS组小鼠及SXTXDW+PAG组小鼠微循环血流速度和肠管血流灌注显著降低,同时伴有微循环中白细胞粘附数目增加,白细胞表面CD11b表达异常增高,CD62L表达下调。无论是SXTXDW还是NaHS都可显著提高小鼠提睾肌微循环血流速度和肠管血流灌注,降低白细胞粘附,以及白细胞表面CD11b的表达,上调CD62L的表达(p<0.05)。与Control组相比,MI+LPS组小鼠提睾肌、心肌和白细胞CSE表达减弱,而SXTXDW干预则可上调提睾肌、心肌和白细胞CSE的表达(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可显著改善小鼠外周微循环障碍,其机制可能涉及硫化氢相关通路。
  3、与Control组相比,MI+LPS组小鼠白细胞体外粘附数目增多,白细胞FOXO1表达增强,白细胞线粒体DNA相对拷贝数显著减少(p<0.05)。而SXTXDW干预则可降低白细胞体外粘附数目减少,下调白细胞FOXO1表达,提高白细胞线粒体DNA相对拷贝数(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可以显著降低体外白细胞粘附数,并可提高线粒体活力。
  结论:
  麝香通心滴丸通过促进内源性硫化氢合成,下调白细胞FOXO1表达,从而改善白细胞CD11b表达以及白细胞线粒体活力,进而发挥改善微循环的作用。
[硕士论文] 褚恒
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  高血压作为心血管系统最常见病症之一,影响全球患者多达10亿。尽管医疗水平不断提高,但目前中国高血压疾病发病率较高,病情知晓率、疾病治疗率及血压控制率仍较低。血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)作为血压升高后最直接影响的被膜细胞,其功能异常会导致炎症介质和促凝因子释放,迁移能力下降,引起血管舒张功能障碍,最终导致心脏、脑、肾脏、眼以及大小血管等不同部位严重的并发症。目前ECs、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)等因素均被认为与高血压发病机制相关。其中血管紧张素2(AngiotensionⅡ,AngⅡ)作为RAAS中最重要的血管活性物质。不仅可引起机体血流动力学改变,导致高血压的发生,而且对血管内皮功能起着非常重要的作用。因此对高血压造成内皮细胞损伤的机制研究就显得尤为重要。
  微小RNA(MicroRNA,miRNA)作为一种内源性的非编码RNA,能够与靶向mRNA的3'非翻译区(3'untranslation region,3'UTR)结合,使其翻译过程阻断或引起靶mRNA的降解。近年来已有大量文献报道了miRNA可通过影响细胞的凋亡、增殖、代谢、分化等生物学过程,参与调节心血管疾病的发生发展。已有研究发现miR-31在心肌纤维化,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化,以及心肌缺血/再灌注损伤具有调节作用。然而miR-31在高血压疾病中内皮功能障碍的作用和机制尚未阐明。
  本研究旨在探究miR-31在高血压发病过程中对内皮细胞功能的影响及机制。
  方法:
  1.通过酶消化法获得人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs);通过AngⅡ(1μmol/L)诱导HUVECs建立内皮细胞损伤模型,对内皮细胞生物学功能进行检测,包括流式细胞仪检测细胞凋亡、western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平,CCK8法检测细胞生长活力;通过实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miRNA的表达。
  2.利用miR-31模拟物/抑制物分别转染HUVECs,并通过qRT-PCR鉴定转染效率;CCK-8法检测生长活力变化;流式细胞仪检测细胞凋亡变化;平板划痕实验检测细胞迁移能力变化。
  3.生物信息学预测软件检索miR-31的潜在靶基因,分析miR-31与潜在靶基因3'UTR的结合位点;在293T细胞中共转染已构建的萤火虫荧光素酶表达载体,通过荧光素酶报告基因实验和western blot验证miR-31与靶基因的调控关系;通过拯救实验,明确miR-31与靶基因在AngⅡ诱导的HUVECs损伤中的机制。
  结果:
  1.AngⅡ刺激HUVECs后,CCK8结果显示内皮细胞生长活力明显降低(P<0.01);流式细胞术结果确定细胞凋亡率明显增加(P<0.01);western blot结果显示凋亡相关蛋白Caspase-3表达上调,Bcl-2表达下调。qRT-PCR结果显示AngⅡ刺激后,miR-126、miR-200和miR-221无明显变化(P>0.05);miR-155表达明显上调(P<0.01);miR-31、miR-384和miR-590表达明显下调(P<0.01)。其中miR-31在AngⅡ刺激不同时间(12h、24h、36h和48h)后均表达降低(P<0.01),其中24h变化最明显。
  2.转染后,CCK-8检测结果表明过表达miR-31的细胞生长活力明显增加(P<0.01),而敲低miR-31的细胞生长活力明显减弱(P<0.01);流式细胞术结果显示过表达miR-31的细胞凋亡率减少(P<0.01),而敲低miR-31的细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞划痕实验结果显示过表达miR-31的细胞迁移能力增强,而敲低miR-31的细胞迁移能力减弱。
  3.生物信息学软件分析结果显示RASA1基因的3'UTR上存在miR-31的潜在结合位点;双荧光素酶报告基因系统检测发现过表达miR-31显著降低含RASA1基因3'UTR序列的荧光素酶活性(P<0.01);western blot结果发现过表达miR-31能够显著抑制RASA1的蛋白表达(P<0.01);拯救实验结果证实过表达miR-31对AngⅡ诱导HUVECs凋亡的保护是通过抑制RASA1表达实现的。
  结论:
  1.内皮细胞miR-31在AngⅡ刺激后表达明显下调,提示其参与AngⅡ诱导的内皮细胞损伤的调节。
  2.过表达miR-31抑制AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡,并促进内皮细胞的迁移能力。
  3.miR-31对AngⅡ诱导的细胞凋亡的保护作用是通过抑制RASA1表达而实现的。
[硕士论文] 张蕾
护理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  老年人慢性病患病率较高,影响其生活质量和心理健康。既往研究发现,患者患病后可体验到益处发现。目前关于老年慢性病患者益处发现的研究较少,且缺乏科学的测量工具。因此,本研究拟在认知适应理论、应激作用过程模型的指导下,对中国老年慢性病患者益处发现的现状进行调查,探索益处发现的影响因素,为日后制定干预方案提供依据,以期提高患者益处发现水平,促进患者身心健康。
  方法:
  本研究基于文献回顾、质性研究、量性研究等研究方法,研究内容分为以下三个部分:
  第一部分:老年慢性病患者益处发现体验的质性研究。研究者在文献回顾的基础上制定了访谈提纲初稿,并经过专家修改和调整,对老年慢性病患者进行质性访谈,析出患者患病后的益处发现体验。
  第二部分:老年慢性病患者益处发现问卷的研制。结合理论研究、文献回顾及质性访谈析出结果,形成问卷初稿,并进行专家咨询。对问卷进行初步修订后,实施预调查,采用项目分析、探索性因子分析、内部一致性系数、重测信度对问卷进行信效度检验。
  第三部分:老年慢性病患者益处发现及影响因素的现状调查。采用方便抽样法,以前期形成的调查问卷为工具,对上海市两所三级甲等医院的320名老年慢性病患者实施问卷调查。采用描述性统计分析探究老年慢性病患者益处发现现状,采用非参数检验、多元回归分析对益处发现的影响因素进行研究。
  结果:
  老年慢性病患者在应对疾病过程中,可体验到益处发现。表现为灵性增长、欣赏生活和生命、优先权的积极改变、领悟社会支持、新的可能性、个人成长、利他行为、健康行为改变。
  结合理论研究、文献回顾及质性访谈析出结果,编制老年慢性病患者益处发现问卷。问卷信效度检验结果显示,各条目内容效度指数为0.818~1,问卷总体内容效度指数为0.91,问卷内容效度良好。探索性因子分析结果显示,问卷由6个维度构成,量表因子累计方差贡献率为66.86%,各条目维度归属基本与原理论设想一致,仅1个条目维度归属不一致。问卷内部一致性Cronbach'a系数为0.924,重测信度为0.902,问卷信效度良好。
  对320名老年慢性病患者的调查结果显示,患者益处发现得分较高,总分为78.76±16.72,疾病感知、面对应对、回避应对、屈服应对、家庭内支持、家庭外支持、乐观倾向得分分别为42.69±10.20、20.46±2.32、17.78±2.34、12.44±2.09、24.46±3.89、41.96±9.50、13.02±1.66。通过非参数检验、Spearson相关分析筛选变量,析出老年慢性病患者益处发现影响因素,包括:①社会人口学因素中的文化程度、退休前职业;②回避应对、屈服应对;③家庭内支持,家庭外支持。将有统计学意义(P<0.05)的影响因素纳入多因素分析,结果显示回避应对、家庭外支持、家庭内支持进入益处发现的logistic回归方程,共同解释了总变异的22.4%。采用回避应对、领悟到更多家庭内支持和家庭外支持的患者益处发现水平高。
  结论:
  老年慢性病患者在应对疾病过程中,可体验到益处发现。自行研制的问卷信效度良好,可用于老年慢性病患者益处发现相关研究。患者益处发现得分较高,其受屈服应对、家庭内支持、家庭外支持的影响。研究提示医务人员和患者家属在今后对老年慢性病患者益处发现的干预中应引导患者适当采取屈服应对的策略,接受患病的事实,调整心态,增加患者的社会支持,以期促进患者体验到更多益处发现。
[博士论文] 杨龙
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:白念珠菌作为条件致病菌寄生在健康人体的口腔和小肠粘膜中,当机体免疫力低下时,其可侵入机体引发系统性感染。系统性白念珠菌感染是最常见的院内真菌感染,包括念珠菌血症和深部组织感染。系统性白念珠菌感染患者死亡率较高,即使接受药物治疗,死亡率仍可高达40%。因此,在治疗过程中,改善患者的机体免疫力被认为是增强治疗效果的理想手段。入侵机体后,白念珠菌表面的病原相关分子模式被免疫细胞中表达的模式识别受体识别后激起机体的免疫反应。目前研究已发现多种识别白念珠菌的模式识别受体,如Toll样受体,C型凝集素受体等。白念珠菌表面的β葡聚糖和甘露糖能够分别结合C型凝集素受体Dectin-1和Dectin-2,激活磷脂酶Cγ(PLCγ),产生(1,4,5)-三磷酸肌醇(inositol1,4,5-trisphosphate,InsP3)。InsP3结合InsP3R(InsP3R)引发内质网中钙离子的释放,使胞内钙离子浓度升高。细胞内钙离子调控多种细胞免疫功能,如活性氧的产生,细胞因子分泌和吞噬等。本课题从酵母双杂交实验筛选到SEC5蛋白能够结合InsP3R的碳末端出发,对SEC5与InsP3R的相互作用及其对抗白念珠菌固有免疫的影响进行了研究。
  第一部分,SEC5与InsP3R相互作用。首先通过GST pull down实验和CO-IP实验验证了酵母双杂交实验的筛选结果,从蛋白水平证明SEC5与InsP3R结合。免疫荧光共定位实验发现SEC5与InsP3R主要分布在细胞质中,并在细胞核周围与InsP3R共定位明显。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)实验证明SEC5与InsP3R共定位区域的空间距离小于10nm,提示SEC5与InsP3R在细胞内直接相互结合。为进一步验证我们的假设,我们对SEC5与InsP3R相互作用的区域进行了深入探索。InsP3R的C末端含有4个α螺旋结构域(H1-H4),分别构建GST-H1/H2/H3/H4融合表达质粒,转化大肠杆菌,表达纯化获得GST-H1/H2/H3/H4融合蛋白beads,并与RAW264.7细胞裂解液进行GST pull down实验,结果发现H1片段能够结合裂解液中的SEC5蛋白。为研究SEC5与InsP3R-H1的结合区域,将SEC5蛋白分为4段(SEC5-1/2/3/4),融合His标签在大肠杆菌中表达。用纯化得到的GST-InsP3R-H1beads与表达有SEC5-1~SEC5-4蛋白片段的大肠杆菌裂解液进行pull down实验,结果发现SEC5-2段和SEC5-4段能够结合InsP3R-H1。综合本部分实验结果表明,SEC5作为一个新的InsP3R相互作用蛋白,直接结合于InsP3R的碳末端。
  第二部分,SEC5-InsP3R相互作用调控InsP3R离子通道活性。首先利用钙离子成像实验检测SEC5-InsP3R相互作用对细胞内钙离子浓度变化的影响,结果发现,在HEK293细胞中,SEC5过表达能够促进卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子浓度的升高,而下调SEC5的表达能够抑制卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高。InsP3R特异性的抑制剂Araguspongin B(ARB)能够抑制SEC5对卡巴胆碱激活InsP3R引起的胞内钙离子的升高的促进作用。为了验证SEC5与InsP3R的相互作用对InsP3R介导的钙离子释放的影响,我们设计并合成了能够透过细胞膜,并具有干扰SEC5与InsP3R的相互结合作用的干扰多肽H1-TAT及其对照多肽H1S-TAT。利用CO-IP实验进行验证后,证明HI-TAT能够抑制SEC5与InsP3R的结合。利用钙离子成像实验检测经H1-TAT及对照多肽H1S-TAT处理的细胞,发现H1-TAT能够抑制对照细胞和SEC5过表达细胞中卡巴胆碱引起的胞内钙离子的升高,进一步证明SEC5与InsP3R的相互作用影响InsP3R介导的钙离子释放。为考察SEC5是否直接影响InsP3R的离子通道活性,利用体外表达纯化的SEC5-2多肽片段进行膜片钳电生理实验,检测结果发现,在相同的InsP3浓度刺激条件下,SEC5-2多肽能够增强InsP3R的活性。综合本部分研究结果,说明SEC5与InsP3R相互作用,能够直接调控InsP3R离子通道的活性,并影响细胞内钙离子的升高。
  第三部分,SEC5蛋白与InsP3R相互作用影响小鼠巨噬细胞对白念珠菌的吞噬。首先通过钙离子成像实验发现BMDM细胞吞噬白念珠菌起始阶段细胞内钙离子浓度瞬时升高。而用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM和InsP3R特异性抑制剂ARB预处理,能够抑制BMDM对白念珠菌的吞噬作用,说明InsP3R介导的胞内钙离子的释放影响巨噬细胞的吞噬作用。为考察SEC5在BMDM吞噬白念珠菌中的功能,利用转染过表达质粒或siRNA的方法改变细胞中SEC5蛋白的表达水平,结果发现在BMDM细胞中过表达SEC5能够显著促进BMDM对白念珠菌的吞噬作用,相反,下调SEC5表达能够抑制BMDM的吞噬功能。免疫荧光实验发现SEC5与InsP3R在吞噬小体上有明显共定位;同时,CO-IP实验结果表明白念珠菌刺激能够促进SEC5与InsP3R的结合。用H1-TAT多肽干扰SEC5与InsP3R的相互作用,能够显著抑制BMDM细胞的吞噬作用。上述研究结果说明SEC5与InsP3R的相互作用影响BMDM细胞对白念珠菌的吞噬作用。
  第四部分,SEC5与InsP3R相互作用调控TBKI-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫反应。首先利用白念珠菌刺激BMDM细胞,并用western blot实验检测TBK1的磷酸化激活水平及转录因子IRF3的入核情况,发现白念珠菌刺激能够激活TBK1-IRF3通路,而下调SEC5蛋白表达能够抑制该通路的激活。GST pull down实验发现InsP3R能够与SEC5,TBK1形成复合体,并且白念珠菌刺激促进该复合体的形成。进一步的机理研究发现在SEC5蛋白分子内,SEC5-2片段和SEC5-rbd结构域结合,阻碍SEC5-rbd与TBK1的结合,对SEC5-rbd结构域产生自我抑制。InsP3R的H1段与SEC5-rbd竞争性结合SEC5-2区域。InsP3R的H1段结合SEC5时能够将SEC5-rbd结构域从SEC5-2区域中解离,促进SEC5-rbd与TBK1的结合,导致TBK1的激活。
  综上四部分实验研究结果,我们发现并验证了SEC5为一个未经报道的InsP3R相互作用蛋白,并且能够调控InsP3R离子通道活性,影响InsP3R介导的细胞内钙离子的释放。同时,我们发现SEC5与InsP3R的相互作用影响巨噬细胞对白念珠菌的吞噬,并调控TBK1-IRF3通路介导的抗白念珠菌天然免疫,发现了机体抗白念珠菌免疫反应的一种新的分子调节机制,为临床抗白念珠菌免疫治疗提供了新的理论依据。
[硕士论文] 张莹
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:动脉压力感受性反射(Arterial baroreflex,ABR)是稳定动脉血压最重要的负反馈调节系统。动脉压力感受性反射功能可以用压力感受性反射敏感性(Baroreflex sensitivity,BRS)来表示。近年来研究发现,BRS低下与高血压、心律失常、脑卒中、心肌梗死及心力衰竭等心脑血管疾病密切相关,但现有研究无法完全阐明BRS低下是心血管疾病的重要致病因素。BRS低下病人很多合并有交感功能亢进,并且大量的研究结果也表明交感神经的过度激活,将会诱发许多心血管疾病,包括心衰、高血压、心梗、房颤、室颤等等。因此需要更多的实验数据证实单纯的BRS低下与心脑血管疾病发生发展的关系。
  本教研室着手进行了自发性反射功能缺陷模型大鼠的培育工作,将BRS<0.6ms/mmHg的大鼠定义为动脉压力感受性反射功能缺陷大鼠(Arterial baroreflex-deficient rats,ABR-DRs),而BRS>0.8ms/mmHg的大鼠则定义为动脉压力感受性反射正常大鼠(Arterial baroreflex-normal rats,ABR-NRs),采用先近亲繁殖后筛选的方法,开展了ABR-NRs和ABR-DRs模型大鼠的培育工作。在培育过程中,两株动物的BRS逐步出现了明显差异。表型方面,较ABR-NRs动物,ABR-DRs动物呈现出现轻度高血压症状。但在其他心血管疾病方面,如心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等,尚缺乏相关的实验数据。
  在BRS低下机制研究方面,我们教研室前期研究工作对此也进行了初步探索。已经确定ABR-DRs大鼠的动脉压力感受性反射功能缺陷主要表现在迷走功能方面,而交感功能正常,因此ABR-DRs是一株单纯的BRS低下动物模型;利用离体膜片钳技术测定ABR-DRs动物的疑核(Nucleus ambiguous,NA)自发性电活动显著减弱。进一步的实验证实谷氨酸的AMPA受体与疑核自发电活动降低密切相关。但AMPA受体在BRS低下的关键作用仍需要进一步的数据支持。同时AMPA受体有很多亚型,哪个亚型在其中发挥作用仍需研究。
  我在前期工作基础上,进一步鉴定、筛选和培育ABR-DRs以及对照ABR-NRs;进一步的表型测定显示,与ABR-NRs动物比较,ABR-DRs体重增加,血脂、血糖水平显著升高,结合血压数据猜测,ABR-DRs表现出显著的代谢综合征。同时,与ABR-NRs相比,ABR-DRs动物并未表现出心肌肥厚、心功能异常以及心律失常的易感性。关于BRS低下的机制研究。AMPA受体主要有4个亚基,其中GluR2亚基与AMPA功能和表达关系最为密切。后续的研究主要围绕GluR2开展。利用GluR2过表达慢病毒转染等技术手段,明确疑核的GluR2可能是BRS低下的关键蛋白。过表达GluR2可显著改善反射功能,降低血压,改善代谢综合征。
  具体实验和结果如下:
  实验一:第26代至第29代模型大鼠的鉴定、筛选和培育
  采用清醒测压技术测定每代ABR-NRs和ABR-DRs动物的BRS、血压和心率,淘汰各组BRS不符合或血压不正常的动物及其子代,保留并近亲交配符合标准的动物子代。到第29代,ABR-DRs的BRS合格率已稳步提高至90%,ABR-NRs的BRS合格率达到了80%。虽然筛选中严格控制父代血压,ABR-DRs血压却明显高于ABR-NRs(约10mm Hg)。更为重要的是,两组动物高血压发生率差异也越发显著,ABR-NRs高血压发生率为0(n=15),而ABR-DRs高达62.5%(n=15)。
  实验二:ABR-DRs出现代谢综合征表现
  对第29代两株大鼠的体重、随机血糖、空腹血糖、血脂四项和肝肾功能相关代谢指标进行测定,结果发现,与ABR-NRs比较,ABR-DRs动物的体重明显增加,空腹血糖、糖化血清蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及血清白蛋白均显著升高。糖耐量实验,与ABR-NRs相比,在0、15、30、60、120min各个时间点,ABR-DRs的血糖水平均显著升高,血糖的曲线下面积显著增加。这些指标的异常符合临床上的代谢综合征表现。
  实验三:ABR-DRs未表现出心律失常的易感性、心肌肥厚和心功能异常
  使用乌头碱静脉微量注射诱导两株大鼠发生致死性心律失常,采用乌头碱导致心律失常的临界剂量和体重比值来评价动物心律失常的敏感性。
  结果:发现,导致两株大鼠心室早搏、心室纤维颤动和心脏停搏的乌头碱计量指数均无明显差异。心功能测定:8月龄ABR-DRs与ABR-NRs,使用小动物B超机测定每搏输出量、射血分数、室短轴缩短几率,心输出量等,均无显著差异。麻醉处死动物,取心脏、主动脉进行形态学测定。与ABR-NRs相比,除主动脉重量表现出一定差异(11.6±1.4mg/cm in ABR-NRs vs13.8±1.5mg/cm in ABR-DRs,P=0.027)以外,ABR-DRs的左心室、右心室等脏器指数均无显著差异,未表现出心肌肥厚症状。
  实验四:ABR-DRs疑核AMPA受体功能异常
  向两株大鼠疑核微量注射L-谷氨酸激活AMPA受体,或CNQX抑制AMPA受体。疑核微量注射L-谷氨酸(1nM,50nL)进行定位,若心率下降表明定位准确。每个实验结束后,向疑核注射100nL2%的滂胺天蓝溶液进行定位标记。首先向疑核微量注射L-谷氨酸(1nM,50nL),ABR-NRs的BRS增加约51%,ABR-DRs的BRS增加约29%(P<0.01)。再而向疑核微量注射CNQX(0.5nM,50nL),削弱或反转L-谷氨酸引发的BRS升高,结果显示,ABR-NRs的BRS显著下降(P<0.01),ABR-DRs的BRS下降幅度无显著差异。以上数据表明AMPA受体参与了疑核功能异常和反射功能低下。
  实验五:ABR-DRs疑核GluR2表达降低
  AMPA受体是脑内引起兴奋性突触后电位的主要受体。是由GluR1、GluR2、GluR3、GluR4构成的同四聚体或异四聚体。其中GluR2亚基决定了AMPA受体对Ca2+的通透性,与AMPA功能和表达关系最为密切。因此本课题重点研究疑核的GluR2亚型。
  向大鼠结状神经节注射逆向荧光示踪剂,借此标记疑核,1周后取延髓作冰冻切片,利用组织免疫荧光技术,激光共聚焦测定疑核的GluR2。同ABR-NRs相比,ABR-DRs动物疑核的GluR2数目(Amount)和平均光密度值(AOD)均显著低下(Amount,12%±1.6%in ABR-DRs vs22%±1.1%in ABR-NRs;AOD,9.5±0.2inABR-DRs vs13.4±0.6in ABR-NRs,P<0.01,n=5)。
  实验六:慢病毒过表达疑核GluR2增加ABR-DRs的BRS、血压,改善代谢综合征
  ABR-DRs脑立体定位疑核注射GluR2过表达慢病毒、对照和假手术,3周后取延髓冰冻切片,通过组织免疫荧光确定转染效率。病毒过表达后NA的GluR2表达数目上调约10%。成功感染慢病毒,继续常规饲养1月后,采用清醒测压技术检测BRS和血压。测定发现,与假手术和对照组相比,过表达组的BRS数值明显增加(假手术组0.33±0.067ms/mmHg vs过表达组0.59±0.20ms/mmHg,P<0.01),血压有降低趋势。
  过表达组、对照组和假手术组动物术后常规饲养4个月,测定空腹状态下的体重、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖、瘦素、谷丙转氨酶、尿素氮、尿酸、肌酐。
  结果:显示,较对照组和假手术组,过表达组的血脂、血糖水平均有显著降低,代谢综合征减轻。
  结论:
  (一)ABR-DRs主要表现为代谢综合征,出现超重、高血压、高血糖、高血脂等心血管危险因素的汇集状态。但未表现出心肌肥厚、心律失常和心功能异常。
  (二)ABR-DRs动物疑核的AMPA受体功能异常。其亚型GluR2缺陷可能是BRS低下关键分子机制。
  (三)过表达疑核的GluR2可改善ABR-DRs动物的动脉压力感受性反射功能,降低血压、血脂、血糖等,改善代谢综合征。
[硕士论文] 刘佳萱
临床病理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝纤维化是常见的病理状态,是多种原因导致的慢性肝损伤所致的病理改变,表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的积聚。肝纤维化是对慢性肝损伤愈合和疤痕形成的应答,并且可能进展为肝硬化、肝癌和肝衰竭。然而,迄今在肝纤维化防治方面尚无十分有效的方法,因此有必要对肝纤维化发生的具体分子机制进一步进行深入研究。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),又称贮脂细胞,是肝纤维化发生过程中产生ECM的主要细胞,HSC活化被认为是肝纤维化发生的关键环节。近年来,表观遗传学改变对肝纤维化相关基因表达及HSC活化的影响日益受到重视,其中,miRNAs(microRNAs)这一表观遗传调控机制在许多生物学过程和代谢稳态中起重要作用,包括蛋白质分泌和脂肪酸代谢等。研究表明,miR-30a、miR-9-5p、miR-142-3p等多种miRNA可以促进或抑制HSC活化。因此,研究miRNA在HSC激活中的作用对抑制甚至逆转肝纤维化有着重要意义。
  清道夫受体B类Ⅰ型(scavenger receptor class B typeⅠ,SR-BⅠ)是清道夫受体蛋白的B类家族的成员,编码SR-BⅠ的基因已被命名为清道夫受体B类成员1(scavengerreceptor class B member1,SCARB1)。SR-BⅠ可介导选择性脂质摄取并且在逆向转运胆固醇中起关键作用。SR-BⅠ可受不同核受体和转录因子的调控,包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs),肝Ⅹ受体(liverⅩ receptor,LⅩR),肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)和胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBPs)等,而这些核因子及其相关分子可通过影响炎症及脂质代谢等参与肝纤维化进程。但SCARB1在肝纤维化进程中的作用机制尚未见报道。
  本组前期研究发现,miR-185在肝纤维化患者外周血中上调,可作为诊断肝纤维化的外周血循环标记物,并且相关文章已经发表。为进一步研究miR-185促进肝纤维化发生发展的具体机制,我们利用生物信息学分析和双荧光素酶报告实验筛选并验证SCARB1为miR-185的靶基因,成功构建了干扰SCARB1表达的稳定细胞株,并在人肝星状细胞(LX-2)中证实了miR-185靶向SCARB1影响HSC活化并促进肝纤维化进程,为临床防治肝纤维化提供一条新的途径。
  第一部分:miR-185靶基因的筛选及验证
  目的:
  筛选及验证miR-185的靶基因
  方法:
  1、通过Targetscan、miRWalk、miRDB等miRNA靶点预测软件预测分析miR-185的靶基因。
  2、在HEK293工具细胞中对miR-185与SCARB1的靶向关系检测:构建载有SCARB1的野生型或突变型质粒,与miR-185共转染293T细胞,转染72h后应用荧光素酶报告系统检测双荧光素酶表达的差异,筛选出miR-185的直接作用靶点。
  3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证:用miR-185mimic及miR-185 inhibitor转染HSC,利用qRT-PCR方法和Western blot方法检测上调或者下调miR-185后SCARB1表达水平的变化以及肝星状细胞活化标志物Ⅰ型胶原(TypeⅠcollagen,colⅠ)与α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化。
  结果:
  1、miRNA靶点预测软件预测发现SCARB1与miR-185在3'-UTR区域有结合位点,可能是miR-185的靶基因。
  2、靶基因鉴定结果:共转染SCARB1野生型质粒和miR-185过表达质粒的细胞中双萤光素酶比值降低,差异有统计学意义,表明miR-185对SCARB1有直接调控作用,并抑制其表达。
  3、HSC中miR-185与SCARB1的靶向关系验证结果:与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 mimic之后SCARB1的表达量减少, colⅠ和α-SMA的表达量增加,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、colⅠ和α-SMA的表达量无显著差异;与空白组和阴性对照组相比,HSC中转染miR-185 inhibitor之后SCARB1的表达量增加,colⅠ和α-SMA的表达量减少,而空白组与阴性对照组相比,SCARB1、colⅠ和α-SMA的表达量无显著差异。
  结论:
  1、生物学信息预测SCARB1为miR-185的靶基因。
  2、荧光素酶报告鉴定SCARB1为miR-185的靶基因。
  3、上调miR-185可促进HSC活化,下调miR-185可抑制HSC活化。
  第二部分:miR-185靶向SCARB1促使HSC活化的机制研究
  目的:
  阐明miR-185靶向SCARB1促HSC活化/肝纤维化进程的生物学机制。
  方法:
  1、构建三个干扰SCARB1表达的稳定慢病毒细胞株sh1、sh2、sh3,利用qRT-PCR检测三个稳定株的干扰效率。挑选出干扰效率最高的细胞株进行后续实验。
  2、回复实验:利用qRT-PCR、Western blot方法检测SCARB1干扰稳定株组、SCARB1干扰稳定株内转染miR-185 inhibitor组HSC中SCARB1表达及HSC活化指标colⅠ和α-SMA的表达水平。
  3、CCK8增殖实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC活化。
  4、凋亡实验明确miR-185是否靶向SCARB1影响HSC凋亡。
  结果:
  1、稳定株筛选结果:用qRT-PCR方法检测sh1、sh2、sh3三个不同干扰细胞株中SCARB1的干扰效率。sh1干扰稳定细胞株SCARB1的干扰效率最高,因此选为下一步实验过程中的SCARB1干扰稳定细胞株。
  2、回复实验结果:与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,SCARB1干扰稳定株组内SCARB1的表达明显下降, colⅠ和α-SMA的表达明显增加;SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比, SCARB1的表达增加,colⅠ和α-SMA下降,进一步验证了miR-185靶向SCARB1促进HSC活化/肝纤维化的作用。
  3、CCK8增殖实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1干扰慢病毒稳定株组细胞在转染24 h、48 h、72 h和96h显著增殖。(2)SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞增殖在转染24 h、48 h、72 h和96h被抑制,有统计学差异。
  4、凋亡实验结果:(1)与空白组和SCARB1干扰对照株组相比,转染SCARB1慢病毒干扰稳定株48h后细胞凋亡减少,有统计学差异。(2) SCARB1干扰稳定株组内转染miR-185 inhibitor48h后,与SCARB1干扰稳定株组相比,细胞凋亡增加。
  结论:
  1、成功构建干扰SCARB1稳定表达的细胞株。
  2、miR-185通过靶向SCARB1促进HSC活化,进而促进肝纤维化的发生发展。
  3、干扰SCARB1基因表达可以促进HSC增殖。
  4、干扰SCARB1基因表达可以抑制HSC凋亡。
[博士论文] 徐岩
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  冷水束缚应激(Water immersion restraint stress,WIRS)因为其良好的可重复性和临床相关性,被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此,本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型,初步探讨:
  1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响,观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。
  2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate,AITC),进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制,以及TRPA1对P物质释放的影响。
  方法:
  雄性Wistar大鼠(weight180-220g,6-8weeks old),随机分为6组,空白对照组(Control group),大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组(WIRS group),大鼠在自制的鼠笼内冷水(16±1℃)浸泡6h,水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组(ITIH group),大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-03003110μl(10μg/μl,HC-030031溶解在二甲基亚砜);腹腔注射HC-030031组(IPIH group),大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031(150mg/kg,HC-030031溶解在0.5%甲基纤维素)。冷水束缚应激6h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜。AITC组,口服AITC17mg/kg(AITC溶解在含有3%乙醇和10%吐温的生理盐水中),AITC对照组口服不含有AITC的溶液,2h后,取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜,应用苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin stain,HE)或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后,分别应用光学显微镜(Optical Microscope,OM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(IHC)分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃黏膜中P物质浓度的变化。
  结果:
  1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示,未经处理的Control组:胃黏膜结构正常,层次清楚,上皮完整,上皮层细胞排列紧密、规则,未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集,未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落,多发浅表溃疡,有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落,同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润,毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显,数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较,WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好,受损黏膜较表浅局限,仅有轻度充血、水肿,偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃黏膜受损,上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿,可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较,AITC组胃黏膜损伤评分明显提高(P<0.001)。
  2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示,未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重,有些完全失去正常结构,轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较,胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤,但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张,空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较,ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低(P<0.001)。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤,多伴有线粒体嵴减少或消失,但轮廓存在;粗面内质网局部扩张,偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较,AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P<0.001)。
  3.同Control组比较,WIRS组大鼠背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加(P<0.001)。
  4.同WIRS组比较,鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003(1ITIH组或IPIH组),有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质释放(P<0.001)。
  5.同Control组比较,口服TRPA1特异性激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤,大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加(P<0.001)。
  结论:
  1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤,使背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关,其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。
  2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤,其机制可能是HC-030031显著抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放,减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。
  3.TRPA1激动剂AITC,诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。
  4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中,P物质的释放主要由TRPA1调控。
[硕士论文] 张星星
内科学(内分泌与代谢病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:糖尿病目前已经成为全球公共卫生问题,流行范围非常广泛、患病率迅速增加。全球糖尿病患者总量从1980年的1亿8百万增加到2014的4亿2千2百万;在大于18岁的人群中,糖尿病患病率从1980年的4.7%增加到了2014年的8.5%。中国是一个人口基数庞大的发展中国家,2017年中国成人最新糖尿病患病率为10.9%。上海作为中国大型城市,糖尿病患病率更是迅猛增加,据上海市市卫生局2006年11月12日公布,其糖尿病患病率为8.6%,而1980年仅为1.01%,20多年来增加了8倍,目前有糖尿病患者120万人。来自上海CDC的最新数据显示,上海35岁以上人群糖尿病患病率达到17.6%。据此,本研究通过对上海全市进行流行病学调查,分析上海的糖尿病流行与控制现状,进一步明确上海外来居民糖代谢状况,研究糖尿病及糖尿病前期的危险因素,为上海市糖尿病预防及控制提供流行病学依据。
  方法:本研究是横断面研究,研究队列来自于上海市卫计委公共卫生三年行动计划《上海市成人自身免疫性甲状腺疾病(AITD)筛查及评估系统》重点项目。调查对象抽取方法:抽样方法为随机抽样,先抽取10个社区为调查点,其中长桥、宜川、彭浦、天平属于城区,南桥、方松、赵巷属于郊区,航头、长江路、江桥属于城乡结合部,每个社区随机抽取10个居委会,每个居委会每户随机抽取一名调查对象,选择生日离调查日期最近的家庭成员。共计抽取了4024名18岁至65岁居民为研究对象,并排除了自身免疫性疾病、怀孕,合并多囊卵巢综合症等可能影响血糖水平的疾病,合并有肝炎、结核病、艾滋病或其他传染病、卧床、骨折、严重精神障碍或痴呆症、以及其他严重心、肝、肾、肺等疾病。外来居民定义为出生地不在上海、但在上海居住超过6个月的居民。于2016年12月至2017年4月期间收集资料及相关调查,采集受试者基本信息,包括姓名、性别、出生地、糖尿病家族史、居住上海时间、职业、收入、教育程度、每天静坐时间、目前使用药物等,测量身高、体重、腰围,检测血胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、空腹血糖、餐后后2小时血糖、糖化血红蛋白、血尿酸。
  结果:1.上海各社区4024名受试者中,根据2010年ADA糖尿病及糖尿病前期诊断标准,糖尿病患病率为8.5%,其中男性患病率为9.6%,女性患病率7.9%,糖尿病前期患病率为34.3%,其中男性患病率为36.4%,女性患病率32.6%;总人群糖尿病知晓率、治疗率、控制率分别为:57.0%、47.1%、50.3%,其中女性糖尿病知晓率、治疗率、控制率分别为60.8%、50.0%、53.5%,男性糖尿病知晓率、治疗率、控制率分别为53.4%、44.4%、47.4%;郊区、城郊结合部以及城区糖尿病患病率分别为8.0%、9.9%、7.7%,糖尿病前期患病率分别为32.0%、33.5%、37.3%,郊区的知晓率(47.4%)及控制率(47.5%)均较城区及城郊结合部低;外来居民糖尿病及糖尿病前期患病率分别为6.0%、30.5%,外来居民与本地居民有相似的糖尿病知晓率,但外来居民糖尿病控制率(41.9%)明显低于本地居民(51.2%)。
  2.糖尿病危险因素包括性别、年龄、糖尿病家族史、居住区域、吸烟、超重、肥胖、腹型肥胖、高血压、甘油三酯、职业;糖尿病前期危险因素为年龄、职业、超重、肥胖、腹型肥胖、甘油三酯、低密度脂蛋白、高血压、尿酸。高密度脂蛋白为糖尿病及糖尿病前期的共同保护因素。
  结论:上海总人群18-65岁糖尿病患病率比较高;城市、郊区、城郊结合部三个区域中,城郊结合部糖尿病患病率较高,而郊区糖尿病知晓率及控制率较低;与本地居民相比,外来居民糖尿病控制率明显低于本地居民。分析上海市糖尿病流行状况,进一步分析上海本地居民与外来居民糖代谢状况,对不同危险因素制定综合预防控制措施,及早对糖尿病进行预防和控制,减少糖尿病造成的医疗保险负担。
[博士论文] 童文文
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病。疾病特征包括起止点炎、渐进发展的骶髂关节炎以及脊柱关节强直。该病好发于青壮年男性并且发病率较高,由于缺乏典型的早期症状和明确的早期生物标记物,AS通常在第一次临床症状出现后的8-10年时间才能得到明确的诊断。晚期患者脊柱的骨性强直及髋关节的骨性融合将导致患者完全丧失生活和工作的能力,对家庭和社会产生极大负担。脊柱及关节部分的骨化作为AS主要病理特征,目前关于它的发生、发展机制也尚不清楚。因此寻找AS的早期诊断标志物以及探索骨化发生的生物学机制一直是AS研究的热点。
  自身抗体是多种自身免疫性疾病的免疫标记物,可作为早期诊断,疾病活动度的观测,治疗预后评估等的标志物。由于缺乏类风湿因子,强直性脊柱炎一直被认为是血清阴性脊柱关节病,血清抗体较少被考虑作为生物标记物进行研究。然而,近年来越来越多的证据表明B细胞和相应的体液免疫反应可能通过抗原提呈,抗体产生等方式参与AS的发病过程。因此,本课题试图通过蛋白芯片在AS血液样本中筛选到合适的可以作为AS早期诊断的标志物,并研究自身抗体相应的抗原蛋白在疾病发生发展中的作用及机制,从而为强直性脊柱炎寻找合适的标志物及可能的治疗靶点。
  目的:
  第一部分:筛选强直性脊柱炎患者血浆内的自身抗体并扩大样本验证Kaiso蛋白自身抗体在强直性脊柱炎血浆内的表达情况。
  第二部分:探究Kaiso分子在体内外实验中对成骨分化进程的影响。
  第三部分:探索Kaiso分子调节成骨分化进程的具体机制。
  方法:
  第一部分:(1)HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎患者及正常人血浆:经过芯片封闭,芯片杂交,芯片检测,数据提取与分析等步骤筛选出强直性脊柱炎患者血浆内特异性的自身抗体。(2)血浆自身抗体表达水平的验证:基于Meso Scale Discovery(MSD)技术,利用夹心法,即将重组蛋白包被在板底,然后加入含有待测抗体的血浆样本或阳性对照抗体进行孵育,再加入带有sulfo标签的抗待测抗体的二抗,最终利用电化学发光原理检测,从而得出不同血浆样本中的抗体表达水平。
  第二部分:(1)Kaiso分子过表达、敲减稳转细胞株的建立:通过病毒载体的构建,慢病毒包装,慢病毒感染细胞及嘌呤霉素筛选等实验步骤完成慢病毒感染稳转细胞株的构建。荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验验证过表达及敲减效率。(2)成骨分化的诱导及检测:在培养基中添加50μg/ml抗坏血酸,10mMβ-甘油磷酸钠,50ng/ml BMP2重组蛋白进行成骨诱导。在不同时间点使用PCR技术检测骨化相关分子的变化、使用BCIP/NBT法进行染色检测碱性磷酸酶的表达情况、使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性、使用茜素红S染色法观察钙结节形成,从而评价不同细胞株成骨分化能力。(3)裸鼠体内异位成骨实验:将Kaiso过表达、敲减及相应对照的稳转株细胞株接种到β-TCP材料支架上,细胞-材料复合物植入裸鼠肌肉内部模拟活体环境,最后通过μCT扫描骨密度值及HE染色观察材料上细胞的成骨情况来评价不同稳转细胞株的成骨能力。
  第三部分:(1)RNA测序了解Kaiso过表达及敲减后基因表达的变化情况:通过提取RNA,RNA质量检测,建立cDNA文库,上机检测,测序结果分析等步骤检测Kaiso过表达及敲减后差异表达的基因。并进一步进行GO、KEGG分析探究差异基因富集到的生物过程及信号通路。(2)使用PI3K-Akt信号通路抑制剂并加入成骨诱导液进行诱导,探究该信号通路是否参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)Kaiso分子结合的目的基因预测及验证:根据生物信息学分析预测转录因子Kaiso可能结合的目的基因,ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验验证Kaiso与Itga10启动子区域的结合及对Itga10的表达调控。(4)Itga10敲减实验进一步验证Itga10与PI3K-Akt信号通路及成骨分化的关系。
  结果:
  第一部分:(1)通过HuProt蛋白芯片筛选强直性脊柱炎及正常人血浆,结果在强直性脊柱炎病人血浆中特异性筛选出MYLK,ASAP,SUGT1,BCL7A,EIF2C1,KAISO,IGHG17等蛋白自身抗体。(2)扩大相应样本量利用MSD技术对其中感兴趣的Kaiso蛋白抗体进行验证,结果显示早期AS患者体内Kaiso抗体表达水平显著高于正常人,晚期AS患者血浆内表达水平与正常人无显著差异。
  第二部分:(1)通过慢病毒感染技术成功构建Kaiso基因过表达和敲减MC3T3-E1稳转细胞株。使用成骨诱导液分别对Kaiso过表达及敲减稳转细胞株进行成骨诱导,结果发现骨化相关分子、碱性磷酸酶的表达量及活性、钙结节形成等反映成骨分化能力的指标在Kaiso过表达后被显著抑制,而在Kaiso敲减后明显增强。(2)裸鼠体内异位成骨实验证实Kaiso过表达稳转细胞株体内成骨能力低于对照,而Kaiso敲减稳转细胞株体内成骨能力与对照组相比显著增强。
  第三部分:(1)对RNA测序所得的差异基因进行GO分析发现,Kaiso过表达后下调的基因和Kaiso敲减后上调的基因均能够富集到骨化相关生物过程。KEGG分析发现PI3K-Akt信号通路在Kaiso过表达时被抑制,Kaiso敲减时被激活。其中Itga10的表达变化与PI3K-Akt信号通路变化一致。(2)PI3K-Akt信号通路抑制剂证实该通路参与Kaiso调控的成骨分化进程。(3)ChIP-PCR、荧光素酶报告基因实验发现Kaiso可以通过结合存在于Itga10启动子区域的特异序列从而抑制Itga10的表达。(4)Itga10敲减实验证实Itga10的表达与PI3K-Akt信号通路成正相关,敲减Itga10能够抑制细胞的成骨分化。裸鼠体内异位成骨实验进一步证实敲减Itga10对细胞成骨分化的抑制作用。
  结论:
  本课题通过三个部分的研究揭示了Kaiso蛋白的自身抗体在早期强直性脊柱炎患者血浆内高表达,进一步探究Kaiso分子与骨化这一强直性脊柱炎病理过程的关系,结果显示Kaiso分子可通过结合Itga10来调控PI3K-Akt信号通路从而抑制成骨分化过程。这为强直性脊柱炎的早期诊断及骨化的干预治疗提供了一个新的可能。
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