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[硕士论文] 李帅
食品工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:全氟烷基化合物(Perfluorinated alkyl substances,PFASs)是人工合成的一类新型持久性有机污染物,由亲水基末端和不同长度的疏水烷基碳链组成的,疏水烷基碳链上的氢原子全部被氟原子替代,形成含有极高化学能的C-F键(约为110 kcal/mol),其稳定性极强,具有化学惰性和耐热性等优良性能。在20世纪50年代就广泛被用作杀虫剂、表面活性剂、润滑剂、催化剂、以及合成药物、氟橡胶、树脂的中间体。PFASs难以被新陈代谢、水解、光解、生物降解,在生物体内随着时间的推移可不断富集,PFASs在生物体内的蓄积浓度远高于已知的二噁英和有机氯等持久性环境污染物。大量研究发现,全氟辛酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)具有生殖毒性、心血管毒性、肝脏毒性、甲状腺毒性和神经毒性。目前,国内外学者相继在水产品、动物肝脏、蛋、奶、母乳中检测出了PFASs,而通过膳食摄入PFASs已成为人体内PFASs的来源之一。本文采用高效液相色谱-串联质谱技术结合QuEChERS方法对蜂蜜中的PFASs残留检测方法进行了研究。主要研究内容如下:
  采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术结合改进QuEChERS预处理方法建立了同时蜂蜜中20种全氟烷基化合物(全氟丁酸、全氟戊酸、全氟丁烷磺酸、全氟己酸、全氟戊烷磺酸钠、全氟庚酸、全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸钠、全氟辛酸、全氟辛烷磺酸钠、全氟壬酸、全氟壬烷磺酸钠、全氟癸酸、全氟癸烷磺酸钠、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸)的残留检测方法。称取5.0g蜂蜜样品于50 mL聚丙烯(PP)离心管中,加入5μL2μg/mL混合内标标准溶液和5 mL水,然后加入10 mL含1.5%甲酸(v/v)的乙腈,漩涡1 min后,加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁,振摇10 min后,以10000 r/min离心10 min。取上层乙腈7 mL转移到装有40 mg PSA、80 mg C18和900mg无水MgSO4的15 mL离心管中,振摇10 min后,以10000 r/min离心10 min,最后取4 mL(相当于2 g试样提取液)上清液于玻璃氮吹管中,40℃水浴氮吹至干,以1 mL甲醇定容后,过0.22μm滤膜,HPLC-MS/MS分析。Atlantis T3 C18色谱柱分离,以含5 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液和5 mmol/L乙酸铵溶液溶液为流动相进行梯度洗脱。电喷雾离子(ESI)源负离子模式下以多反应监测(MRM)扫描,采用同位素内标法进行定量分析。
  实验结果表明,20种PFASs在0.2~10μg/L浓度范围内线性相关系数均大于0.995;检出限范围为0.04~0.1μg/kg;定量限范围为0.1~0.2μg/kg。在0.1、0.5、1和2μg/kg添加浓度下(n=6),20种PFASs加标回收率范围为72.56%~112.98%,相对标准偏差(RSD)范围为0.73%~15.73%。结果表明,该方法快速、高效、准确,适用于蜂蜜样品中20种PFASs的同时分析检测。
[硕士论文] 王丽
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫的多型性现象是基因和环境共同作用的结果,其中一种典型的表现形式就是蜜蜂的级型分化。蜜蜂级型分化的机理一直以来都是蜜蜂发育生物学中备受争议的问题。有研究表明,DNA甲基化对蜜蜂的级型分化有重要的作用。蛋氨酸作为一种重要的食源性甲基供体,在蜜蜂级型分化中的作用仍无人探究。
  本研究拟将蛋氨酸作为意大利蜜蜂幼虫甲基供体的食物来源展开研究,探索蛋氨酸源甲基供体对意大利蜜蜂级型分化的影响。分三个试验进行:首先,确定蜂王与工蜂幼虫体内甲基供体S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成与代谢的差异,为探索DNA甲基化与蜜蜂级型分化的关系提供理论依据;在此基础上,利用蛋氨酸及去甲基化试剂,从正、反两个方向具体验证蛋氨酸源甲基供体对DNA甲基化的影响;DNA甲基化的进行需要能量三磷酸腺苷(ATP)的参与,而ATP主要由单糖通过三羧酸循环提供,所以最后,研究蛋氨酸与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响,最终确定蛋氨酸作为一种食源性甲基供体与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响。主要研究内容和结果如下:
  试验一.蜂王与工蜂幼虫体内甲基供体SAM合成与代谢的差异研究。试验选用分别来自5群姐妹蜂王群新出房的1 d意大利蜜蜂幼虫890只,分为两组,每组5个重复,每个重复89只。其中第1组组织人工育王,第2组自然发育成工蜂。取3d、4d和5d的蜂王与工蜂的幼虫,测定其体内SAM合成与代谢关键酶基因的表达及其酶活的差异。
  结果表明:
  (1)蜂王幼虫的SAM含量随日龄的增加变化不显著(P>0.05)而工蜂幼虫的随日龄增而升高(P<0.05)。
  (2)蜂王幼虫SAMS表达量随日龄增加而下降(P<0.01),而工蜂幼虫SAMS表达量随日龄变化不显著(P>0.05);
  (3)蜂王幼虫的Dnmt1a表达量随日龄增加无显著变化(P>0.05),但其酶活随日龄增加而下降(P<0.05);工蜂幼虫Dnmt1a表达量随日龄增加而下降(P>0.05),但其酶活随日龄增加而上升(P<0.01);
  (4)蜂王幼虫Dnmt3表达量随日龄增加而下降(P<0.05),而工蜂幼虫变化不显著;工蜂幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化显著(P<0.05),而蜂王幼虫变化不显著(P>0.05)。本试验表明:3—5日龄意大利蜜蜂蜂王幼虫与工蜂幼虫体内的活性甲基供体SAM的合成与代谢存在差异,4日龄前SAM参与DNA维持甲基化的代谢过程,蜂王幼虫比工蜂活跃,4日龄后工蜂幼虫比蜂王幼虫活跃;在3—5日龄期间,蜂王幼虫SAM参与DNA从头甲基化的代谢过程逐渐减弱,工蜂幼虫维持不变,但该代谢过程在蜂王幼虫体内始终不低于工蜂幼虫。
  试验二.蛋氨酸源甲基供体对意大利蜜蜂级型分化的影响。试验选用1d意大利蜜蜂幼虫360只,平均分为3组,每组5个重复,每个重复24只。试验中第1组:幼虫阶段全部饲喂基础日粮;第2组:1d-2d饲喂基础日粮,2d以后饲喂添加了蛋氨酸的日粮;第3组:1d-2d饲喂基础日粮,2d-3d饲喂添加了蛋氨酸的日粮,3d及以后饲喂添加了去甲基化试剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)的日粮。
  结果表明:
  (1)饲粮中单纯添加了蛋氨酸之后,幼虫化蛹率和羽化率都会升高,且差异显著(P<0.05),而添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后幼虫的化蛹率和羽化率都会降低,且差异显著(P<0.05)。
  (2)饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫化蛹出房后的成蜂卵巢小管数显著增加(P<0.0001),成蜂体长也是同样趋势(P<0.01)。
  (3)取5日龄幼虫测定生理生化指标:饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫体内SAMS表达量显著低于其他组(P<0.05);饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫体内Dnmt1酶活显著下降(P<0.0001);幼虫体内Dnmt3表达量显著低于其他两组;添加了蛋氨酸之后Dnmt3表达量高于对照组(P<0.01);饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,Dnmt3酶活显著高于对照组和蛋氨酸组(P<0.01)。本试验说明,蛋氨酸源甲基供体会影响幼虫化蛹羽化出房后成蜂的卵巢小管的数量和幼虫体内与甲基化有关的活性甲基供体SAM的合成与代谢,进而影响蜜蜂的级型分化,使得蜜蜂幼虫朝着工蜂方向发育。
  试验三.蛋氨酸源甲基供体与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响。试验选用1d意大利蜜蜂幼虫1480只,平均分为6组,每组5个重复。第1组饲喂基础日粮,第2-6组分别饲喂固定蛋氨酸量为3mg/g,而葡萄糖:果糖分别为为2:3、1:1、4:3、5:3和2:1的日粮。
  研究结果表明:
  (1)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后,葡萄糖:果糖为4:3和5:3时幼虫化蛹率最高(P<0.01);葡萄糖:果糖为1:1时,幼虫羽化率最高,在葡萄糖:果糖为2:3时,幼虫羽化率和化蛹率都是最低(P<0.0001)。
  (2)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后,葡萄糖:果糖为2:3时幼虫化蛹羽化出房后卵巢小管数最少,继续升高葡萄糖的量到葡萄糖:果糖为12:6时,卵巢小管数不断增多,且卵巢小管数在50-80条及>90条之间的的成蜂数量所占总的羽化出房的成蜂数量比例升高(P<0.0001);葡萄糖:果糖为2:3时幼虫化蛹羽化出房后成蜂体长最短,葡萄糖:果糖为2:1时,成蜂的体长最长(P<0.0001)。
  (3)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后影响SAM的合成,3日龄时,葡萄糖:果糖为8:6时,SAM含量最多(P<0.01),4日龄时,在基础日粮和葡萄糖:果糖为4:6时幼虫体内SAM含量最多(P<0.01);4日龄时,基础日粮组和葡萄糖:果糖为12:6时,SAMS表达量最多(P<0.05),5日龄时,葡萄糖:果糖为10:6时幼虫体内SAMS表达量最多(P<0.05);
  (4)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后影响ATP的合成:4日龄时,葡萄糖:果糖为2:3时,ATP含量最少,葡萄糖:果糖为1:1和4:3时,幼虫体内ATP含量最多(P<0.05);3日龄时,饲喂基础日粮时,幼虫体内柠檬酸合酶(CS)基因表达量最小,葡萄糖:果糖为4:6时和12:6时,幼虫体内CS表达量高于其他组(P<0.05),4日龄时,随葡萄糖量的增多,柠檬酸合酶(CS)基因表达量差异显著(P<0.05)。本试验研究表明,蛋氨酸源甲基供体与单糖协同作用会影响幼虫羽化出房后成蜂卵巢小管的数量及幼虫体内DNA甲基化代谢相关酶活与基因表达量,进而影响蜜蜂的级型分化,即饲粮中添加蛋氨酸及多的单糖,会使得蜜蜂幼虫朝着蜂王方向发育。
  综上研究表明,蛋氨酸能够通过调节意大利蜜蜂幼虫的相关的生理生化指标,影响幼虫生长发育,进而以食源性甲基供体的作用影响蜜蜂的级型分化。
[硕士论文] 雷春红
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在蜜粉源缺乏的季节代用花粉的使用日趋广泛,科学合理配置营养均衡的蜜蜂饲粮是亟待解决的问题。蜜蜂的天然饲粮中含有丰富的泛酸,故推测泛酸可能是蜜蜂饲粮中不可或缺的组成成分。本研究以不同泛酸水平的饲粮人工饲养工蜂幼虫和工蜂成蜂,探讨不同泛酸添加水平对蜜蜂生长发育、生理生化、及脂质代谢的影响,获得幼虫和成蜂人工饲粮中泛酸的适宜添加水平,从而为配制营养均衡的蜜蜂饲粮提供依据。
  试验一:
  蜜蜂幼虫阶段饲粮中泛酸的适宜水平研究。试验选取1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫1800只,随机分为5组,每组3个重复,每个重复120只。5组工蜂幼虫分别饲喂泛酸水平为0.92 mg/g(对照)、1.22 mg/g、1.52 mg/g、1.82 mg/g、2.12 mg/g的5种试验饲粮,饲喂至化蛹。分别取5日龄(d)和7日龄(d)幼虫,测定体重(干重及鲜重)、体成分(粗蛋白及粗脂肪)、血淋巴生化指标(TP、TG、TCHO、HDL、LDL)、抗氧化指标(MDA、SOD、T-AOC)、CoA合成相关酶基因的mRNA相对表达量(BCoAS、PANK4、PPCDC、PPCS),并计算幼虫的化蛹率和羽化率。
  结果表明:
  1)饲粮中泛酸的添加可显著提高蜜蜂羽化率(P<0.05);随饲粮中泛酸水平的升高,5日龄和7日龄幼虫的鲜重和干重均呈现先升高后降低的趋势(P<0.05),在1.82 mg/g均达到最高;蜂体粗脂肪含量显著升高(P<0.05);
  2)随饲粮中泛酸水平的升高,5日龄工蜂幼虫血淋巴中TP(总蛋白)、TCHO(总胆固醇)、HDL(高密度脂蛋白胆固醇)、LDL(低密度脂蛋白胆固醇)含量均呈现先降低后升高(P<0.05);
  3)5日龄和7日龄虫体T-AOC以及5日龄虫体SOD活性随饲粮泛酸水平的升高而显著升高(P<0.05);
  4)饲粮泛酸水平显著影响5日龄幼虫泛酸激酶4基因(PANK4)和磷酸泛酰-半胱氨酸脱羧酶(PPCDC)基因的mRNA相对表达量(P<0.05),且均在泛酸水平为1.82 mg/g时mRNA相对表达量最高。分别以饲粮泛酸水平与5日龄虫体的干重和羽化率作拟合曲线,获得意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中适宜的泛酸水平为1.85 mg/g~2.01 mg/g。
  试验二:
  意大利蜜蜂工蜂成蜂饲粮中泛酸的适宜水平研究。移取新出房的幼蜂于蜂盒,随机分为7组,每组3个重复,分别饲喂泛酸添加水平为0 mg/kg,9.8 mg/kg,19.6 mg/kg,39.2 mg/kg,78.4 mg/kg,147.0 mg/kg,261.3 mg/kg的人工饲粮。分别于3日龄、6日龄和9日龄时取样,测定蜜蜂的采食量、体成分、血淋巴生化指标、抗氧化指标、中肠脂肪酸代谢酶的活性及基因的mRNA表达量、蜂体的脂肪酸组成。
  结果表明:
  1)饲粮中泛酸的添加可显著影响蜂体的粗脂肪含量(P<0.05),且随泛酸添加水平的升高,蜂体粗脂肪含量有降低的趋势;
  2)与对照组相比,泛酸添加组6日龄和9日龄蜂体的SOD和AOC显著增加(P<0.05),9日龄蜂体MDA显著降低(P<0.05);
  3)饲粮中泛酸的添加对6日龄和9日龄血淋巴中TCHO含量有显著影响(P<0.05),显著降低3日龄、6日龄和9日龄血淋巴中TG的含量(P<0.05);6日龄血淋巴中LDL含量呈现先降低后升高的趋势。
  4)与空白对照组相比,饲粮中泛酸的补充可显著影响3日龄蜜蜂蜂体的单不饱和脂肪酸含量(P<0.05),泛酸添加组可显著降低9日龄蜂体的多不饱和脂肪酸(P<0.05)。
  5)随泛酸添加水平的升高,3日龄、6日龄和9日龄中肠脂肪酶活性均呈现先升高后降低的趋势(P<0.05),分别在39.20 mg/g、9.80 mg/g和39.20 mg/g时达到最高。
  6)与空白对照组相比,6日龄中肠39.20 mg/kg组的ACC基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),且与其他添加组间没有显著差异(P>0.05);3日龄中肠FAS的基因的mRNA表达量随泛酸添加水平的升高呈现先降低后升高的趋势(P<0.05)。通过对饲粮中泛酸添加水平与蜂体抗氧化指标做拟合曲线,可得成蜂饲粮中泛酸的适宜添加水平为84 mg/kg~123 mg/kg。
  以上研究表明,饲粮中泛酸的添加可促进蜜蜂的生长发育,增强机体抗氧化能力。幼虫饲粮中泛酸适宜添加水平1.85 mg/g~2.01 mg/g,成蜂饲粮中泛酸的适宜添加水平为84 mg/kg~123 mg/kg。
[硕士论文] 刘春蕾
养殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在我国北方地区,冬季气候寒冷,外界无蜜源,蜜蜂越冬期间无法从外界获取食物,只能消耗越冬前贮备的食物。因此,越冬饲料的质量好坏直接影响着蜂群的健康。自然状态下蜜蜂越冬期的糖饲料是蜜源季节储存的蜂蜜,但是,蜂农为了追求蜂产品产量和利润,往往会在蜜源季取竭蜂群内的储蜜,转而选择廉价的白砂糖作为越冬饲料,更有蜂农甚至会使用更廉价的果葡糖浆替代白砂糖作为越冬饲料。越冬期不同糖源类型对蜜蜂的饲养价值并不清楚,因此,本研究选择蔗糖、蜂蜜、果葡糖浆为蜜蜂越冬期糖源饲料,通过检测越冬期蜜蜂中肠理化指标、组织形态和肠道菌群区系等指标,探索糖源对越冬蜜蜂肠道健康的影响,从而为养蜂生产中越冬饲料的选择提供参考。
  在秋末(10月底)选取群势相当的本地意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)越冬蜂群(群内无储备越冬饲料脾)9群,随机分为3个试验组(3群/组),从11月2号开始分别以蜂蜜、白砂糖和果葡糖浆为糖源进行饲喂,至11月下旬喂足越冬饲料,蜂群进入越冬期。分别于越冬前(11月初)、越冬中期(1月初)和越冬后(3月初)采集蜜蜂中肠,测定中肠消化酶(淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶)活性;在越冬中期采集蜜蜂中肠用于中肠组织形态和抗氧化酶基因(Sod1、Sod2和CAT)表达水平等指标的检测;在越冬前(11初)和越冬中期(1月初)采集蜜蜂的中肠和直肠,利用16S rDNA技术测定蜜蜂肠道菌群的种类和丰富度。结果表明:1、不同糖源饲料对越冬蜜蜂中肠消化酶及抗氧化酶基因表达的影响:(1)在越冬中期,果葡糖浆组和蜂蜜组的蜜蜂中肠内淀粉酶活性显著高于蔗糖组(P<0.05)。(2)不同糖源饲料对蜜蜂中肠内蔗糖酶活性的影响差异不显著(P>0.05)。(3)在越冬中期,果葡糖浆组的蜜蜂中肠内蛋白酶活性显著高于蔗糖组和蜂蜜组(P<0.05)。(4)在越冬中期,蔗糖组的蜜蜂中肠Sod1基因的相对表达量显著高于蜂蜜组和果葡糖浆组(P<0.05)。2、不同糖源饲料对越冬蜜蜂中肠组织结构的影响:蜂蜜组和蔗糖组的蜜蜂中肠肠壁厚度显著大于果葡糖浆组(P<0.01),而且蜂蜜组和蔗糖组的蜜蜂中肠隐窝深度比果葡糖浆组中肠隐窝深度深(P<0.01)。3、不同糖源饲料对越冬蜜蜂肠道菌群的种类和丰富度的影响:(1)在门水平,越冬蜜蜂的肠道菌群主要为变形菌门(Proteobacteria,63.17%)、厚壁菌门(Firmicutes,17.61%)、放线菌门(Actinobacteria,4.06%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,1.72%)。在属水平,Lactobacillus(15.91%)和Bifidobacterium(3.24%)为主要优势菌属。(2)白砂糖能够提高越冬蜜蜂肠道中放线菌门(Actinobacteria)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和根瘤菌目(Rhizobiales)的丰富度,蜂蜜能够提高蜜蜂肠道中γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和巴斯德氏菌目(Pasteurellales)的丰富度,而果葡糖浆可以增加蜜蜂肠道中β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)的丰富度。
  本试验表明,不同糖源饲料能够改变越冬蜜蜂肠道菌群的结构,蜂蜜和白砂糖能够提高越冬蜜蜂肠道中有益菌的相对丰度;蜂蜜能够提高越冬蜜蜂中肠消化酶活性,蜂蜜和白砂糖有利于越冬蜜蜂中肠组织的发育,而且白砂糖能够提高越冬蜜蜂中肠抗氧化基因的表达。因此,蜂蜜和白砂糖比果葡糖浆更适合作为蜜蜂越冬的糖源饲料。
[硕士论文] 彭勇
农业昆虫与害虫防治 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫是动物世界中最多元化的类群,拥有多种多样的生命形态,几乎能够适应各种生态环境。为此它们进化出了高度敏感的化学感受器官,这是他们与环境相互作用和个体之间交流的核心。在昆虫中,表达在嗅觉器官中的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)起着化学信号的检测与运输作用,介导昆虫的觅食、择偶、寄主定位等生理行为,它们对于昆虫适应环境和维持种群结构具有非常重要的生物学意义。因此,不管是基础研究还是生产应用,了解昆虫的嗅觉分子基础都显得非常重要。中红侧沟茧蜂Microplitis mediator(Haliday)是一种独居性内寄生蜂,寄主广泛,在农业生产中,广泛用于棉铃虫等棉田害虫的生物防治。通过分子生物学的手段研究中红侧沟茧蜂的嗅觉分子机制,可为害虫防治和天敌利用提供新的策略和方法,为生物防治提供新的靶标位点。本文通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,鉴定出大量在触角中特异表达的OBPs基因和CSPs基因,并对CSP2和CSP3蛋白在中红侧沟茧蜂触角感器的表达及气味结合功能进行了研究。本文主要研究结果如下:
  1.通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,共鉴定10个新的OBPs基因(MmedOBP11~20)和2个新的CSPs基因(MmedCSP2~3)。MmedOBPs和MmedCSPs的序列比对发现,中红侧沟茧蜂的OBPs和CSPs的都属于“Classical”半胱氨酸模式。Motif分析表明中红侧沟茧蜂的CSPs比OBPs更加保守。系统进化分析结果表明MmedOBPs和MmedCSPs在进化过程中具有明显的分化现象。
  2.利用Real-time Quantitative PCR分析了上述基因在中红侧沟茧蜂成虫不同组织的表达特征。结果显示MmedOBP14,MmedOBP18,MmedCSP2和MmedCSP3在触角中特异或高表达,表明它们可能参与了中红侧沟茧蜂的嗅觉识别过程。而其余的基因具有广泛的表达特征,推测其可能具有非嗅觉功能。
  3.免疫组织化学对MmedCSP2和MmedCSP3蛋白在触角感器中的表达分布进行研究。结果显示,MmedCSP2特异表达在腔锥形感器中,而MmedCSP3在锥形感器中表达,表明这两个蛋白分别参与了不同化学感器的化学识别过程。
  4.荧光竞争结合实验研究了MmedCSP2和MmedCSP3重组蛋白与102种潜在配体的结合特异性。实验结果显示,MmedCSP2结合反-2-己烯醛、柠檬醛、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛、水杨酸甲酯、戊醛、B-紫罗兰酮、3-己酮和茉莉酸甲酯;MmedCSP3蛋白结合TMTT、DMNT、丁酸乙酯、水杨酸甲酯、油酸和棕榈酸,此外MmedCSP3与3种夜蛾科昆虫性信息素(Z11-16:OH,Z11-16:Ald,E11-14:Ac)有很强的亲和能力,这表明MmedCSP2与MmedCSP3可能在中红侧沟茧蜂检测植物挥发物方面发挥重要作用,MmedCSP3可能是中红侧沟茧蜂利用昆虫挥发物来定位寄主或配偶的关键蛋白。
  5.同源模建对MmedCSP2和MmedCSP3的三维结构模型进行分析。结果表明MmedCSP2蛋白具有一个由7个α-螺旋构成的疏水性结合腔,和两对二硫键,分子对接实验预测Ser12,Tyr15,Leu50和Asn53可能是MmedCSP2与配体结合的关键位点。MmedCSP3蛋白具有较大的疏水结合腔,由5个α-螺旋构成,同样有两对二硫键来稳定蛋白结构,推测Ala22、Arg25、Gln26、Glu40、Asp41、Trp45和Tyr75可能是MmedCSP3结合配体的关键位点。
[硕士论文] 齐磊
动物遗传育种与繁殖 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂作为真社会性昆虫,是人们探究动物复杂行为的最好的模式生物之一。而化学感受蛋白(chemonsensory protein,CSPs)是一种小的可溶性蛋白,广泛存在于昆虫的触角等化学感受器中,在昆虫的化学感受系统中发挥着重要的作用。目前为止在蜜蜂中一共发现了6种化学感受蛋白,而其在蜜蜂中的具体功能尚不完善。本次研究旨在探究化学感受蛋白在意大利蜜蜂虫蛹期及成年工蜂中的时空表达水平及功能。本次研究中,首先通过荧光定量PCR技术检测了6种化学感受蛋白基因(Amel-CSP1、Amel-CSP2、Amel-CSP3、Amel-CSP4、AmeLCSP5和Amel-CSP6)在不同日龄工蜂(16、12、18、28日龄)触角中CSPs的表达情况进行检测,来确定CSPs在意大利蜜蜂工蜂发育过程中的是否具有时间特异性;然后再对6种化学感受蛋白基因在虫蛹期的表达水平,以及哺育蜂和采集蜂的触角、头部、胸部、腹部和腿的表达水平进行检测,以确定CSPs在意大利蜜蜂中的空间分布情况。本次研究的主要结果如下:
  1、Amel-CSP1~Amel-CSP6在意大利蜜蜂中的时间表达水平
  化学感受蛋白基因Amel-CSP1在28日龄工蜂触角中的表达水平最高,显著高于其在其他日龄工蜂中的表达水平(P<0.05),Amel-CSP1在工蜂触角中的表达水平随工蜂日龄的增长而提高,在1日龄工蜂触角中含量最低。Amel-CSP2在1日龄工蜂触角的表达量最高,而随着日龄增长显下降趋势,在28日龄工蜂触角中的表达水平最低。Amel-CSP3其在28日龄工蜂触角中的表达水平最高,极显著的高于其他日龄(P<0.01);Amel-CSP4在工蜂触角中表达水平随着工蜂日龄的增长而逐渐下降。Amel-CSP5在不同日龄工蜂触角中的表达水平相对稳定,没有时间特异性(P>0.05);Amel-CSP6在工蜂触角中的表达水平随着日龄的增加而降低,28日龄时最低。
  2、Amel-CSP1~Amel-CSP6在意大利蜜蜂中的空间表达水平
  Amel-CSP1在工蜂的触角和头部有较高的表达水平,而在幼虫,蛹,胸部,腹部,腿部的表达水平较低,其在工蜂触角中的表达水平显著高于其他部位(P<0.05)。Amel-CSP2在触角中有所表达,在其他部位的表达量较低。Amel-CSP3在幼虫,蛹,哺育蜂和采集蜂各部位均具有较高的表达水平。Amel-CSP4仅在工蜂触角表达,其他部位的表达水平很低,甚至不表达。Amel-CSP5在幼虫、蛹及工蜂所有部位中的表达量都很低。Amel-CSP6与Amel-CSP3相似,在幼虫,蛹,哺育蜂和采集蜂中都有较高的表达水平。
  除Amel-CSP5在工蜂中的表达没有明显的时间特异性外,其他5种CSPs均具有明显的时空表达特异性,这对整个CSPs家族对意大利蜜蜂生长发育的功能具有一定的生物学意义。
[硕士论文] 张迎迎
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂工蜂的纳氏信息素(Nasonov pheromone)作为蜜蜂的化学信息素之一,在蜂群的群体及个体协调过程中,具有重要的作用。目前对蜜蜂工蜂纳氏腺的研究主要集中在西方蜜蜂(Apis mellifera)上,其分泌物的化学成分主要为(反)-柠檬醛、(顺)-柠檬醛、橙花醇、香叶醇、橙花酸、香叶酸和(反,反)-法呢醇这7种萜烯类物质,而对于东方蜜蜂(Apis cerana)纳氏腺分泌物的成分研究并不透彻,有文献报导其中仅含有香叶醇、(反)-柠檬醛和极微量的(顺)-柠檬醛。在对纳氏腺功能的研究发现,西方蜜蜂的纳氏信息素参与了认巢、定向、采食、分蜂、婚飞等过程。但对于东方蜜蜂纳氏信息素的功能的研究还不尽完善。此外,东方蜜蜂和西方蜜蜂在生物学上有较多的差异,为此,探究东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素的成分、功能及行为活性差异均有很大的研究意义。
  本研究以东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏腺为材料,摸索最优的纳氏信息素提取方法,对纳氏信息素的化学成分进行定性和定量分析。并用单组分与混合组分的纳氏信息素对蜜蜂进行生物活性测定,为进一步研究东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏信息素差异甚至不同种蜜蜂之间的进化差异提供依据。通过研究获得的主要结论总结如下:
  1.利用气相色谱(gas chromatography,GC)分析蜜蜂纳氏腺的成分,设计相应的检测方案。发现西方蜜蜂的纳氏信息素除了已被报道的萜烯类物质外,还有一些脂肪酸类物质,并且这些有机酸类物质在东方蜜蜂的纳氏腺提取物中也检测到,然而在东方蜜蜂纳氏信息素中并没有检测到萜烯类物质。
  2.运用固相微萃取技术(solid-phase microextraction,SPME)可以大大简化蜜蜂纳氏信息素的提取。通过与标准的溶液提取方式比对,设计并优化了SPME提取步骤,使得提取纳氏信息素的种类与数量和溶液提取方式基本一致。
  3.对东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素有机酸类成分进行了鉴定,主要含有:正辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)-9-十六烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸这10种物质。
  4.对东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素每一活性组分进行了定量分析,结果表明:东方蜜蜂纳氏信息素的正辛酸和癸酸含量比西方蜜蜂高,而肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)-9-十六烯酸和油酸的含量比西方蜜蜂低。在这些脂肪酸成分中,正辛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)9-十六烯酸和油酸呈现极显著差异(T-test,sig=p<0.01)。
  5.利用气相色谱和触角电位仪联用技术(gas chromatography coupled with electroantennographic detector,GC-EAD)分析了两组分的电生理活性,结果表明:萜烯类的香叶醇、香叶酸和(反,反)-法呢醇均能引起工蜂明显的触角电位反应,而脂肪酸中仅正辛酸能引起工蜂的触角电位反应。
  6.对纳氏信息素的生物活性测定分析表明:无论是全组分还是单成分的脂肪酸,对东方蜜蜂和西方蜜蜂的行为均未起到明显的诱导或疏散作用。
  7.由于东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素成分的差异性,单独对脂肪酸在其他功能上的实验发现,死亡工蜂的尸体会释放出脂肪酸,并且不同时间段各成分释放的量也不同,因此这些脂肪酸可能在作为蜜蜂的尸体识别信号(necronome pheromone)参与群体的清理行为。
  综上所述,东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏信息素在组分上存在很大的差异,西方蜜蜂纳氏信息素参与的已报道的各种行为多是萜烯类成分主要介导的,而东方蜜蜂不含有此类物质,却仍有类似的行为,可能是其他腺体或者行为起作用。目前实验表明,有机酸类物质对蜜蜂并不起作用可能与蜜蜂的进化有关,在进化中西方蜜蜂含有较多的萜烯类物质,而东方蜜蜂纳氏腺的功能逐渐退化。这为东方蜜蜂比西方蜜蜂更古老的假说提供了一定的依据,也为今后纳氏腺及相关的有机酸类功能研究提供了参考。
[硕士论文] 李利
养殖 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂除用来生产蜂产品外,对于提高农作物产量、维护生态平衡也有重要意义。狄斯瓦螨是瓦螨属的一种专性寄生于蜜蜂体表的外寄生螨,自二十世纪中叶成功实现宿主转移而寄生西方蜜蜂之后,已成为全世界西方蜜蜂的首要病害,但其对原始宿主东方蜜蜂却没有显见危害。
  寄生于东方蜜蜂群的狄斯瓦螨目前已发现8个单倍体基因型,但西方蜜蜂群中却只有朝鲜型(K1)和日本型(J1)两种单倍型,其中以K1为主。已有研究表明,浙江省内寄生于东方蜜蜂和西方蜜蜂群内的狄斯瓦螨都属于K1型,根据Navajas等(2010)研究结果,K1和J1可被进一步细分为多个单倍亚型,有理由推测浙江省内不同宿主来源的K1型狄斯瓦螨虽然同为K1型,但很可能为不同的单倍亚型。而这两种不同蜜蜂种来源的K1型狄斯瓦螨是否属于同一单倍亚型,对于后续研究狄斯瓦螨的宿主转移和东方蜜蜂的抗螨机制有重要价值。为探究这一问题,本课题对杭州(西湖区)、淳安(千岛湖)、金华(婺城区)、永康、南昌、吉林(吉林市)等6个不同地区的东方蜜蜂群进行狄斯瓦螨的自然侵染率调查,采用人工交叉转染实验及线粒体DNA序列分析对中蜂群和意蜂群来源K1型狄斯瓦螨的繁殖特性和遗传多样性进行分析。具体研究结果如下:
  (1)自然状态下,中蜂蜂群狄斯瓦螨寄生率在蜂群间有很大差异。本调查在约一半的蜂群内没有发现狄斯瓦螨寄生,而在部分中蜂雄蜂巢房中瓦螨寄生率却超过10%,最高可达14.52%。寄生于中蜂雄蜂巢房一半以上的狄斯瓦螨均在中蜂雄蜂巢房繁殖,狄斯瓦螨可寄生中蜂工蜂巢房,但在发现的22个被瓦螨寄生的中蜂工蜂巢房中却未见有繁殖的现象。
  (2)人工转染条件下,意蜂群来源K1型狄斯瓦螨可在中蜂工蜂巢房、意蜂工蜂巢房、中蜂雄蜂巢房和意蜂雄蜂巢房正常繁殖。绝大多数中蜂群来源K1型狄斯瓦螨可在中蜂雄蜂巢房正常繁殖,极少数个体在中蜂工蜂巢房和意蜂工蜂巢房能繁殖;可能因为样本量问题,本研究未发现中蜂群来源K1型狄斯瓦螨在意蜂雄蜂巢房繁殖的例子。
  (3)线粒体cox1、cytb基因片段串联序列比对结果显示:目前K1型狄斯瓦螨已发现8种单倍亚型,其中5种在本研究中首次被报道。综合前人研究结果可知:侵染东方蜜蜂蜂群的狄斯瓦螨已知共有7种单倍亚型,侵染西方蜜蜂蜂群的共有3种单倍亚型。
  (4)综合遗传多样性分析和人工转染实验结果显示,不同宿主来源K1型狄斯瓦螨各单倍亚型之间繁殖能力有很大差异。意蜂群来源的K1-1/2单倍亚型狄斯瓦螨在中蜂工蜂巢房、中蜂雄蜂巢房、意蜂工蜂巢房、意蜂雄蜂巢房均能繁殖。绝大多数中蜂群来源K1-1/2亚型狄斯瓦螨可在中蜂雄蜂巢房中繁殖,只有极少数中蜂群来源K1-1/2亚型狄斯瓦螨可在中蜂工蜂巢房和意蜂工蜂巢房中繁殖,且繁殖能力较低。中蜂群来源的K1-5单倍亚型狄斯瓦螨只能在中蜂雄蜂巢房中繁殖。但因样本量较低,没有在任何类型的巢房中观察到K1-3和K1-7单倍亚型繁殖的现象。K1-8和K1-9单倍亚型狄斯瓦螨未在本研究人工转染实验中涉及。
  综上所述,本课题研究结果对K1型狄斯瓦螨的种群特征,以及不同宿主来源的K1型狄斯瓦螨在不同类型巢房中的繁殖特性有了更进一步的认识。本研究结果不仅揭示了K1型狄斯瓦螨遗传多样性的丰富度,还明确了K1型狄斯瓦螨各单倍亚型之间存在显著的繁殖能力差异。本研究所得结果将有助于进一步理解狄斯瓦螨的宿主转移现象和机制。
[硕士论文] 孙政
分析化学 西北大学 2017(学位年度)
摘要:蜂蜜是由蜜蜂采集植物花粉在蜂巢中酿制的一种药食同源的营养物质,富含酚酸、黄酮、维生素、氨基酸、蛋白质、矿物元素等多种人体所需的物质。花源植物是影响蜂蜜品质的直接因素,但是蜂蜜的产地、采集和加工方式以及储存条件等也会对蜂蜜品质造成影响。因此,建立准确、可靠的方法来鉴别蜂蜜花源,并严格控制蜂蜜加工过程是保证蜂蜜的质量关键因素。氨基酸是蜂蜜中的一类营养物质,主要来源于蜜蜂所采集花源植物的花粉,因此氨基酸可以用于鉴别蜂蜜花源。而且氨基酸是美拉德反应的反应物,在热加工过程中含量会发生变化,可以用于监控蜂蜜的加工过程。本论文以蜂蜜的色值、产地以及市场价格为依据,选择了5种中国蜂蜜(枣花蜜、荆条蜜、龙眼蜜、洋槐蜜和油菜蜜)为研究对象。对这5种蜂蜜中18种游离氨基酸和由蛋白质水解后的氨基酸含量进行研究,结合化学计量学方法对蜂蜜的花源进行归属。本论文还对枣花蜜和荆条蜜进行模拟热加工,研究了加工过程中氨基酸含量的变化。本论文共包括4章内容,主要工作包括:
  1、应用waters AQC氨基酸衍生试剂盒衍生5种蜂蜜中的游离氨基酸,高效液相色谱法测定蜂蜜中游离氨基酸含量。结果表明,花源不同的蜂蜜,氨基酸含量也存在较大的差异,如枣花蜜中的脯氨酸、荆条蜜中的苯丙氨酸等。基本论文于氨基酸含量差异,应用化学计量学方法对5种蜂蜜进行分类,结果表明5种蜂蜜可以按照花源不同准确分类。
  2、应用考马斯亮蓝法和电泳法测定了5种蜂蜜中的蛋白质含量和蛋白质电泳图谱。结果表明不同花源蜂蜜中蛋白质含量和种类都存在较大差异,如枣花蜜的电泳谱图在17KDa处有一条其他蜂蜜均不存在的条带。基于蜂蜜中蛋白质的差异,本论文采用超滤法富集蜂蜜中的蛋白质,并采用酸式水解法将蛋白质水解为氨基酸。以蛋白质水解氨基酸含量为变量,应用化学计量学方法归属蜂蜜花源植物。结果显示,5种蜂蜜可以正确归类,但荆条蜜和油菜蜜之间距离较近,分类结果不如以游离氨基酸为变量取得的分类结果好。
  3、选择了氨基酸含量较高的枣花蜜和荆条蜜为研究对象,模拟热加工过程。分别测定了热加工过程中蜂蜜色值、5-HMF和18种游离氨基酸含量的变化。以测得的这些数值为变量,应用化学计量学方法,发现蜂蜜样品可以按照加工程度分类。因此,在热加工时建议45℃是最佳的加工温度,65℃加热应不超过8h,而且热加工时应尽量避免80℃高温加热。结果还显示在热加工过程中,荆条蜜受影响比枣花蜜大。
[硕士论文] 贺琼
食品科学 西北大学 2017(学位年度)
摘要:荔枝蜜和枣花蜜是中国市场上较为常见的两大单花种蜂蜜。枣花蜜多产自中国北方地区,而荔枝蜜多产自南方地区。虽蜂蜜采自不同的植物源,色泽口感各有特色,但都具有丰富的营养价值。然而,目前对荔枝蜜和枣花蜜的研究却有所不足,对花源标识物的研究以及在细胞水平对有害细胞的作用均鲜有报道。鉴别蜂蜜花源标识物是判别蜂蜜真假、区分掺假蜂蜜的一种重要手段。而细胞活性研究则对了解蜂蜜的药用价值以及功能开发具有重要意义。因此,本课题围绕荔枝蜜的花源标识物和枣花蜜对HepG2人肝癌细胞的促凋亡作用进行初步探究。
  1、构建了采自中国不同地区的13批荔枝蜜和13批枣花蜜的HPLC-DAD指纹图谱,获取相关系数矩阵数据,并对样品进行聚类分析。指纹图谱结果显示,荔枝蜜共有28个共有峰,枣花蜜共有32个共有峰。于荔枝蜜中发现2种化合物,枣花蜜中发现4种化合物可作为其花源标识物。聚类分析结果表明基于相关系数矩阵进行最远距离聚类可在一定程度上分析样品的地理源,为地理源差异研究提供支持。
  2、对荔枝蜜中发现的2种花源标识物(B1和B2)进行分离纯化和结构鉴定。采用XAD-2吸附树脂和半制备型液相色谱分离,分别得到两种花源标识物22.5mg和4.7mg,经Q/TOF-MS验证,其分子量均为264,是脱落酸及其同分异构体。
  3、对荔枝蜜和枣花蜜的体外抗氧化活性进行研究,分别测定了总酚含量、DPPH·清除能力和氧自由基清除能力(ORAC)。结果显示,枣花蜜的总酚含量高于荔枝蜜,均值为525.1±72.35mg GAE/kg。枣花蜜DPPH·清除率(IC50)均值和ORAC均值为32.55±4.16mg/mL和3.39±0.85μmol TE/g,明显高于荔枝蜜,且与总酚含量表现出正相关。因此,选择枣花蜜为研究对象进行下一步研究。
  4、研究了枣花蜜对HepG2人肝癌细胞的促凋亡作用,并探究了其诱导凋亡的机制。结果显示,经枣花蜜处理的HepG2细胞活力会随着枣花蜜浓度的增加而下降。枣花蜜可以引发HepG2细胞凋亡,使其细胞核发生破裂,凋亡特征明显,且凋亡细胞比例与枣花蜜的浓度也表现出浓度正相关性。此外,枣花蜜会引起线粒体膜电位降低、增加Bax和Bad蛋白的表达量,降低Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达量。同时,抑癌基因p53的表达量也伴随处理浓度增大而增加,caspase-9和下游蛋白caspase-3表达上调,最终导致凋亡。可见,枣花蜜可能通过p53介导线粒体依赖途径诱导HepG2细胞凋亡。
[硕士论文] 苏中渠
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:硒对动物的生理机能具有重要作用,硒元素可以提高机体的抗氧化能力,维持细胞膜的正常结构功能增强机体免疫性能,促进动物生长发育等。由于蜜蜂在农业生态链中发挥重要传粉作用,蜜蜂产品价值高、用途广,因而蜜蜂在世界上得到广泛饲养。硒对蜜蜂的生理机能研究较少,蜜蜂对硒的营养需要还不明确。意大利蜜蜂是世界上饲养最多的西方蜜蜂亚种(Apis mellifera L.),探索意大利蜜蜂对硒的营养需要具有重要的理论和实际意义。本研究以意大利蜜蜂为研究对象,通过配制不同亚硒酸钠添加水平的饲粮,饲喂工蜂幼虫和成年工蜂(简称成蜂),测定幼虫体重、抗氧化、免疫、化蛹率、成蜂寿命、硒蛋白合成相关基因mRNA表达水平等指标,在生理生化和分子生物学水平上探索硒对蜜蜂生理机能的影响;以化蛹率、成蜂寿命等为指标做拟合曲线,获得意大利蜜蜂工蜂幼虫及成蜂饲粮中适宜硒水平。
  试验一:饲粮亚硒酸钠水平对意大利蜜蜂幼虫的影响。取1日龄(1d)意大利蜜蜂工蜂幼虫1440只,平均分为两批,每批720只,一批用于化蛹率、羽化率的测定,一批用于生理生化指标和分子生物学指标的测定。两批幼虫均按单因素完全随机设计分成6组,每组内5个重复,每个重复24只幼虫。分别饲喂亚硒酸钠添加量为0.0 mg·kg-1、0.2 mg·kg-1、0.4 mg·kg-1、0.6 mg·kg-1、0.8 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1的日粮。获得以下结果:(1)日粮硒水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫的化蛹率及体重影响显著。日粮添加亚硒酸钠水平为0.4 mg·kg-1时幼虫化蛹前体重显著高于对照组(P<0.05);与对照组相比,日粮添加亚硒酸钠水平为0.2 mg·kg-1时,幼虫化蛹率显著提高(P<0.05)。(2)日粮硒水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫的抗氧化能力和免疫能力影响显著。与对照组相比,日粮添加亚硒酸钠水平为0.2-0.6 mg·kg-1时显著提高了幼虫的T-AOC(P<0.05),日粮添加亚硒酸钠水平为0.2-0.8 mg·kg-1时显著提高了幼虫的T-SOD活性(P<0.05),各试验组均显著降低了幼虫的MDA含量(P<0.05)。日粮添加亚硒酸钠水平为0.4 mg·kg-1时幼虫的PO活性显著高于对照(P<0.05)。(3)日粮硒水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫硒蛋白合成相关基因的影响显著。日粮添加亚硒酸钠水平为0.6 mg·kg-1时5日龄幼虫的SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因的mRNA水平显著高于对照(P<0.05)。(4)由幼虫化蛹率做拟合曲线得出意大利蜜蜂工蜂幼虫的适宜硒水平为0.32-0.36 mg·kg-1。
  试验二:饲粮亚硒酸钠水平对意大利蜜蜂离群成蜂的影响。取1d意大利蜜蜂工蜂2450只,分为两批,1200只用于测定存活率,1250只用于测定生理生化指标和分子生物学指标。两批成蜂均按单因素完全随机设计分成5组,分别饲喂亚硒酸钠添加水平为0.0 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1、4 mg·kg-1的日粮。获得以下结果:(1)日粮硒水平对意大利蜜蜂离群成蜂的寿命影响显著。日粮添加2 mg·kg-1亚硒酸钠的试验组成蜂的平均寿命显著高于其余各组(P<0.05)。(2)日粮硒水平对意大利蜜蜂离群成蜂的抗氧化能力和免疫能力影响显著。与对照组相比,日粮添加亚硒酸钠水平为1 mg·kg-1、2 mg·kg-1时显著提高了离群成蜂的总抗氧化能力(P<0.05),日粮添加亚硒酸钠水平为1-3 mg·kg-1时显著提高了离群成蜂的T-SOD活性(P<0.05),各试验组均显著降低了离群成蜂的MDA含量(P<0.05)。日粮添加亚硒酸钠水平为1 mg·kg-1时成蜂的PO活性显著高于对照组(P<0.05)。(3)日粮硒水平对意大利蜜蜂成蜂硒蛋白合成相关基因表达的影响显著。日粮添加亚硒酸钠水平为2 mg·kg-1时,5d成蜂的SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因的mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。(4)由离群工蜂寿命和抗氧化性做拟合曲线得出意大利蜜蜂离群工蜂的适宜硒水平为0.56-0.63 mg·kg-1。
  本研究表明,室内人工饲养意大利蜜蜂工蜂幼虫时,幼虫饲粮中硒的适宜水平为0.32-0.36 mg·kg-1;离群饲养成蜂时,成蜂饲粮中硒的适宜水平为0.56-0.63 mg·kg-1。
[博士论文] 马兰婷
动物营养生理 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:在养蜂生产中,花粉的充足供应是工蜂咽下腺发育的重要保证。同时,人们也时常发现,幼虫的存在刺激着工蜂咽下腺的发育。也就是说,花粉供应是否充足(营养因素),以及蜂巢内是否存在幼虫(幼虫诱导),是影响工蜂咽下腺发育的二大重要因素。迄今为止,营养和幼虫诱导对蜜蜂咽下腺发育的分子调节机制仍不清楚。本研究以意大利蜜蜂为试验对象,以营养和幼虫诱导为试验因子,利用组织细胞学、分子生物学和生物信息学技术探索其对咽下腺发育的分子调控机制,为阐明工蜂泌浆的分子机制奠定基础。主要研究内容及结果如下:
  1.营养和幼虫诱导对意大利蜜蜂咽下腺发育的影响
  为探究营养和幼虫诱导对蜜蜂咽下腺发育的影响,试验选取健康、群势一致的姐妹蜂王群9群,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复1群蜂。1个组饲喂蜂蜜(honey),命名为Hon组,作为对照组;1个组饲喂蜂蜜和花粉(pollen),命名为Pol组;1个组在饲喂蜂蜜和花粉的同时,以幼虫(brood)诱导,命名为 Bro组。试验期间,各组提供充足的蜂蜜或花粉,试验期为12天。试验第1天标记足量新出房工蜂,分别于试验的第6天、9天、12天采集被标记蜜蜂。采用BCA试剂盒测定第6、9、12天被标记蜜蜂咽下腺组织蛋白含量;利用透射电镜观察第9天被标记蜜蜂咽下腺细胞的超微结构;应用IlluminaHiSeqTM2500双末端测序技术测定第9天被标记蜜蜂咽下腺总RNA转录水平。结果如下:(1)Bro组、Pol组和Hon组的工蜂咽下腺组织蛋白含量在各日龄差异极显著,均是以9日龄最高,6日龄最低(P<0.01);同时发现9日龄工蜂咽下腺蛋白含量在3组中差异极显著,Bro组>Pol组>Hon组(P<0.01)。(2)超微结构结果发现,Bro组和Pol组咽下腺细胞内粗面内质网多呈长管状或小泡状,其外表面附有大量核糖体,而Hon组粗面内质网腔很窄、其外表面附着核糖体较少;各组咽下腺细胞胞内分泌管体积依次为: Bro组>Pol组>Hon组。(3)采用生物信息学分析转录结果,共检测到7种可变剪切类型,累计SNP位点数达87792个;共发现新基因360个,其中有230个注释到COG、GO、KEGG等数据库中;共检测到2,801个差异表达基因,其中Hon组和Pol组、Hon组和Bro组、Pol组和Bro组间的差异基因个数为220、2,380、1,658,分别有213、2328、1617个注释到各类数据库中;途径富集分析表明,与幼虫诱导相关的基因主要参与了氧化磷酸化生物过程和Wnt信号通路,营养特异基因主要参与了过氧化物酶体、果糖和甘露糖的代谢活动,而花粉和幼虫诱导共同作用的特异基因主要参与了核糖体蛋白、氧化磷酸化和TOR信号通路及支链氨基酸代谢过程;特别关注了9个mrjps基因,对mrjps基因进行聚类分析,发现mrjp4和mrjp7、mrjp5和mrjp8是功能相近的两组基因。
  2.候选基因的功能分析及验证
  为了挖掘调控咽下腺发育的重要基因,我们首先采用维恩分析比较了试验一中Hon组、Pol组和Bro组两两之间的共同差异基因,共发现36个,其中mrjp2、mrjp3、Loc724114和Loc410337受花粉和幼虫的叠加诱导,表达水平升高幅度较大,因此我们以这4个基因作为我们的目的基因,对其进行功能分析及验证分析。
  试验采集新出房工蜂1980只,随机分为6组(A组、B组、C组、D组、E组、F组),每组3个重复,每个重复110只蜜蜂,于室内蜜蜂饲养盒中饲养,试验期为15天。A组饲喂蜂蜜;B组饲喂蜂蜜和油菜花粉;C组饲喂蜂蜜和油菜花粉,并将一块带有小幼虫的巢脾放入饲喂盒内,以诱导蜜蜂哺育;D组前9天饲喂蜂蜜,后6天饲喂蜂蜜和油菜花粉;E组前9天饲喂蜂蜜,后6天饲喂蜂蜜和油菜花粉,并用具小幼虫巢脾诱导;F组前9天饲喂蜂蜜和油菜花粉,后6天在饲喂蜂蜜和油菜花粉的基础上,用小幼虫诱导。首先,A(Hon)、B(Pol)、C(Bro)三组在饲养的第1、3、6、9和12天各取10只蜜蜂解剖,分离其头部、胸部肌肉、腹部表皮、中肠和毒腺5个部位,提取各部位总RNA,采用qRT-PCR方法测定目的基因在不同发育时期和不同组织部位的表达水平。其次,在饲养的第9天,A、B、C组每盒取30只蜜蜂;第15天,A、B、C、D、E、F组每盒取30只蜜蜂;解剖分离蜜蜂咽下腺,提取总RNA,测定目的基因mRNA表达水平。结果表明:(1)花粉+幼虫诱导基因 Loc724114和Loc410337在9日龄头部和中肠中高表达;而基因mrjp2和mrjp3主要在9日龄工蜂头部、肌肉和表皮中表达;(2)Loc724114、Loc410337、mrjp2和mrjp3在花粉和花粉+幼虫的诱导下,均是在9日龄具有高表达,到15日龄时,表达量显著降低(P<0.01);(3)基因Loc410337和Loc724114主要受花粉+幼虫的共同调控作用;而mrjp2和mrjp3受花粉和幼虫的叠加调节作用。
  本研究表明,营养和幼虫诱导刺激咽下腺细胞内各种细胞器增多,提高了其合成组织蛋白的能力,促进工蜂咽下腺的发育;营养和幼虫诱导影响工蜂咽下腺基因组的转录。营养和幼虫诱导下的DEGs,主要通过在 Ribosome通路中正调控作用和在 TOR、Wnt信号通路中的负调控作用共同影响工蜂咽下腺的发育;花粉(营养)是咽下腺发育的必需营养物质,幼虫的存在是促使咽下腺发育的关键诱因,营养和幼虫诱导是调控咽下腺发育的两种关键因素。
[硕士论文] 陈秀贤
养殖 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:养蜂业不仅是畜牧业的重要组成部分,在提高农作物产量和质量以及维护生物多样性等方面也发挥重要作用。然而,近年来,世界养蜂业形势普遍严峻,许多欧美养蜂国家蜂群严重衰退,不仅给蜂农造成巨大损失,也引起人们对授粉危机的担忧。东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)是一种以专营成年蜜蜂肠道细胞为主的寄生虫,通过吸取蜜蜂的营养和能量,实现其在蜜蜂体内的大量繁殖。作为西方蜜蜂(Apis melliferaL.)的一种新型病原,N.ceranae严重威胁西方蜜蜂健康。该病原不仅破坏蜜蜂肠道组织、影响蜜蜂正常的消化道功能,降低蜜蜂的免疫力,促使蜜蜂采集行为提前,同时也会为其他病原菌的入侵提供可乘之机,最终使蜜蜂寿命缩短,蜂群群势下降。
  研究发现,在我国,N.ceranae已基本取代(西方)蜜蜂微孢子虫(Nosemaapis)。然而,关于N.ceranae在我国西方蜜蜂中的流行病学研究较少。浙江省是我国主要的养蜂大省之一,由N.ceranae在西方蜜蜂中引起的蜜蜂孢子虫病在浙江尚未有系统的研究。此外,我国目前缺乏防治N.ceranae的有效且安全药物。因此,为了明确N.ceranae在浙江省西方蜜蜂中的流行情况和危害,开发出有效防治蜜蜂孢子虫病的药物,本课题于2013年4月至2016年1月对浙江省西方蜜蜂蜂群中N.ceranae的流行情况进行定期调查,并结合欧盟利用植物制剂防治蜜蜂孢子虫病和我国防治其他动物孢子虫病的经验,筛选有效抑制孢子增殖的植物提取物。研究内容和主要结果如下:
  1.N.ceranae在浙江省西方蜜蜂蜂群中的流行情况
  (1)2013年4月至2016年1月,从浙江省8个县、市地区19家定地蜂场采集的701份样品用于蜜蜂微孢子虫种类的鉴定及其孢子量的检测。调查发现,目前感染浙江省西方蜜蜂的微孢子虫主要为N.ceranae,未检出N.apis。
  (2)在2013年至2016年的不同季度中,8个地区19家蜂场均有N.ceranae感染。在701群蜜蜂中,有74%的蜂群感染N.ceranae,其中,以中等感染水平为主(58%);严重感染率为0;轻微感染率为16%。
  (3)从季节性感染情况看,N.ceranae在浙江省不同地区西方蜜蜂蜂群中全年感染,且春、夏两季感染水平普遍相对偏高,平均感染率都在85%以上。N.ceranae在秋、冬两季的感染率相对较低,但也均在50%以上。
  (4)自2014年3月起,金华地区N.ceranae的总体平均感染率逐渐升高,并以中等感染水平为主。其中,DJH、WFH和ZGQ等3家蜂场全年严重感染N.ceranae;尽管CWC蜂场在2014年3月至2014年12月期间均未检出N.ceranae,但自2015年4月起,N.ceranae的感染水平显著增加。
  (5)平湖地区不同季度N.ceranae的总体感染水平季度差异不显著,但均以中等感染水平为主。总体上,5家蜂场N.ceranae的平均感染率均在80%左右,但冬季的感染水平略低。
  2.植物提取物防治蜜蜂孢子虫病的效果
  (1)实验室条件下,采用1%浓度研究11味植物提取物防治蜜蜂孢子虫病的效果。结果表明,穿心莲水煎剂、葡萄皮醇提物以及黄柏水煎剂均能有效抑制N.ceranae孢子的增殖。
  (2)采用0.5~7%之间不等的5个浓度探究3种有效植物提取物抑制孢子增殖的剂量效应。结果表明,穿心莲水煎剂和黄柏水煎剂对孢子增殖的抑制具有显著的剂量效应(p<0.05),浓度越高,其抑制孢子增殖的效果越好。5个不同浓度的葡萄皮醇提物均能显著降低患病蜜蜂体内的孢子数,但剂量效应不显著(p>0.05)。
  3.穿心莲水提物对蜜蜂健康的影响
  通过初筛和剂量效应研究发现,穿心莲水煎剂不仅能有效抑制孢子增殖,且对蜜蜂安全。因此,我们从蜜蜂寿命水平和肠道稳态(组织形态水平以及分子水平)探讨7%穿心莲水煎剂对蜜蜂健康的影响,并对穿心莲水煎剂及其有效成分单体抑制孢子的效果进行比较。研究结果表明:
  (1)穿心莲水煎剂能显著提高感染N.ceranae的蜜蜂存活率(p<0.05)。
  (2)与感染N.ceranae且不给药的蜜蜂相比,感染N.ceranae的蜜蜂在给饲穿心莲水煎剂后,其中肠组织更加致密、完整。这表明,穿心莲水煎剂促进了患病蜜蜂肠道组织的修复。此外,无论是患病蜜蜂还是健康蜜蜂,在饲喂7%穿心莲水煎剂后,其中肠组织中再生细胞数目明显增多,这表明穿心莲水煎剂能促进蜜蜂肠道细胞的更新。
  (3)穿心莲水煎剂通过促进armadillo、basket以及frizzled等3个基因的上调表达,并抑制groucho的上调表达,从而促进了Wnt信号通路的上调表达。
  (4)与7%穿心莲水煎剂相比,其相应浓度的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在单剂使用情况下,对孢子增殖的抑制作用不显著;两种单体配伍后,显著降低孢子数。
[硕士论文] 徐健
食品工程 华南农业大学 2016(学位年度)
摘要:黑水虻(Hermetia illucens L.)是一种腐生性的水虻科资源昆虫。黑水虻原产于美洲,目前已经广泛分布于全世界,主要分布在南北纬40度之间。近些年我国开展了黑水虻研究,结果发现黑水虻分布于我国广西、广东、云南、台湾、湖南和湖北等地。
  黑水虻幼虫可以处理禽畜粪便和餐厨垃圾;而且黑水虻幼虫本身含较高比例的蛋白质、粗脂肪等,可以作为高质量的动物蛋白和能量饲料。研究并利用黑水虻对解决人类目前所面临的环境污染和资源短缺问题有重要的意义。
  本课题以黑水虻为研究对象,通过复合菌发酵处理猪饲料、餐厨余、猪粪作为昆虫饲料养殖4日龄的幼虫,进而研究复合菌发酵昆虫饲料对黑水虻幼虫存活率、幼虫历期、幼虫平均增重、料重比、转化率、蛹羽化率的影响。采用 Folin-酚法和碘-淀粉比色法分别确定黑水虻幼虫消化酶活的最佳测定方法,研究饲料的灭菌处理以及幼虫的消毒处理对黑水虻幼虫消化酶酶活的影响。利用16S rRNA基因测序技术,检测分析饲料的灭菌处理以及幼虫的消毒处理对黑水虻幼虫肠道菌群的影响。
  结果如下:
  (1)发酵猪饲料将幼虫存活率提高5.34%(p<0.05),发酵餐厨余对幼虫存活率无影响(p>0.05),预发酵猪粪会降低幼虫存活率(p<0.05);发酵餐厨余和猪粪养殖的幼虫平均增重分别提高了0.0190 g、0.0813 g(p<0.05);发酵猪饲料、餐厨余、猪粪均能降低料重比(p<0.05),分别降低0.426、0.272和0.163。发酵猪饲料和餐厨余均能显著提高饲料的转化率(p<0.05),分别提高了0.066、0.116,但发酵猪粪的转化率无影响(p>0.05)。发酵猪饲料、餐厨余、猪粪还能提高黑水虻成虫羽化率(p<0.05),分别为8.58%、21.03%、15.43%。
  (2)测定黑水虻幼虫蛋白酶活性最佳方法:取1.0 mL粗酶液在1.0 mL酪蛋白溶液浓度为2%(w:v),反应温度为40℃,磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)浓度为0.05 mol/L的条件下反应5 min,加2.0 mL三氯乙酸(0.4 mol/L)终止反应,然后用Folin-酚法在紫外分光光度计波长680 nm处测定OD值。黑水虻幼虫蛋白酶活达到193.82 U/mL。
  (3)测定黑水虻幼虫淀粉酶活性最佳方法:取0.5 mL粗酶液在0.1 mL淀粉溶液浓度为3%(w:v),反应温度为40℃,磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)浓度为0.05 mol/L的条件下反应8 min,然后用碘-淀粉法在紫外分光光度计波长660 nm波长下测OD值。淀粉酶活达到591.25 U/mL。
  (4)黑水虻幼虫的蛋白酶活性大小与饲料种类有关(p<0.05),猪饲料组幼虫蛋白酶活性较大,同种饲料的灭菌处理和幼虫的消毒处理无明显影响(p>0.05)。幼虫的淀粉酶活性与饲料种类和幼虫消毒处理有关(p<0.05),猪饲料组幼虫淀粉酶活性较高,同时幼虫不消毒处理淀粉酶活性较大。
  (5)黑水虻幼虫肠道菌群的种类数量与饲料的灭菌与否有关,饲料不灭菌的黑
  水虻幼虫肠道微生物种类较多。摩根氏菌属(Morganella)为SF-m-1、SF-m-2、SF-m-3、SF-m-4、SF-p-1、SF-p-4六个处理样品的黑水虻肠道的主要菌,所占比例分别为
  92.05%、90.65%、66.68%、97.31%、94.04%、27.91%。肠球菌属(Trabulsiella)在样品SF-p-2、SF-p-3中所占比例较大,分别为40.80%、25.83%。
  结论:本研究说明复合菌发酵饲料能显著提高黑水虻的存活率、平均增重、料重比、转化率、羽化率。饲料的灭菌处理不会影响幼虫消化酶活性,而幼虫的消毒处理只降低幼虫淀粉酶活性。饲料灭菌会降低黑水虻幼虫肠道菌群的种类数量。
[硕士论文] 李帅东
养殖 四川农业大学 2016(学位年度)
摘要:我国畜牧业的快速发展,为我国人民生活水平的提高做出了巨大贡献,同时也给我国的环保事业带来了极大的挑战。蚯蚓堆肥处理畜禽粪污是目前广泛采用的一种生物发酵方式,不仅能够有效的解决畜禽粪污带来的环境压力,还能最大限度的变废为宝。目前,在蚯蚓研究工作中,处理畜禽粪污效率和蚯蚓自身应用价值的研究是主体方面;在利用调理剂提高蚯蚓生长和繁殖方面的研究较少。因此,本文在畜禽粪污中添加调理剂,改善基料营养,研究调理剂对蚯蚓的生长繁殖性能的影响,可以为蚯蚓高效养殖和处理有机废弃物提供技术储备。
  本文以青年期和成年繁殖期的“大平二号”蚯蚓为研究对象,以柠檬酸钠、磷酸氢二钾和尿素作为调理剂,探究调理剂对青年期和成年繁殖期蚯蚓生长速度的影响及成年繁殖期蚯蚓产茧数的影响,探寻促进蚯蚓生长和繁殖的最适调理剂添加水平。根据预实验结果,将柠檬酸钠和尿素分别设置8个浓度梯度,磷酸氢二钾设置9个浓度梯度,每个浓度设置3个重复组。本试验采用单因素控制变量法,将柠檬酸钠和磷酸氢二钾分别单独加入畜禽污泥中,将磷酸氢二钾和尿素分别单独加入牛粪中,分别饲养青年期蚯蚓和成年繁殖期蚯蚓。试验开始时每个试验组放入15条蚯蚓,其中青年期蚯蚓体重为175±15mg/条(15条共计2625±25mg),每周对各试验组的蚯蚓整体进行称重和记录,以畜禽污泥为基料的试验进行7周,以牛粪为基料的试验进行6周;成年繁殖期蚯蚓为550±25mg/条(15条共计8250±50mg),每周对各试验组的蚯蚓整体进行称重和产茧数计数,并做好记录,试验进行4周。同时,对上述试验始末基料中的总碳、总氮、总磷、碳氮比和pH进行检测和分析。研究结果表明:
  1、适量水平的柠檬酸钠、磷酸氢二钾和尿素对蚯蚓的生长和繁殖有促进作用,过量水平会降低效果;调理剂的影响效果具有时效性,需不断补充。
  2、调理剂对促进蚯蚓青年期个体增重、成年繁殖期个体增重和成年繁殖期产茧增量的最适宜添加水平均不同。
  畜禽污泥养殖青年期蚯蚓最适宜的柠檬酸钠添加水平为1000mg/kg,在第4周单条蚯蚓平均重0.6249g;最适宜成年繁殖期个体增重的柠檬酸钠添加水平为3500mg/kg,在第4周单条蚯蚓平均重0.8019g;最适宜成年繁殖期产茧的柠檬酸钠添加水平为7000mg/kg,在第2周平均每条蚯蚓产茧3.44枚。
  畜禽污泥中添加磷酸氢二钾饲养青年期蚯蚓最适合的水平是3000mg/kg,在第4周单条蚯蚓平均重0.6583g;最适宜成年繁殖期个体增重的磷酸氢二钾添加水平为1000mg/kg,在第3周单条蚯蚓平均重0.8922g;最适宜成年繁殖期产茧的磷酸氢二钾添加水平为3000mg/kg,在第2周平均每条蚯蚓产茧3.91枚。
  牛粪中添加磷酸氢二钾饲养青年期蚯蚓最适合的水平是3000mg/kg,在第3周单条蚯蚓平均重0.7601g;最适宜成年繁殖期个体增重的磷酸氢二钾添加水平为2000mg/kg,在第2周单条蚯蚓平均重0.9079g;最适宜成年繁殖期产茧的磷酸氢二钾添加水平为3000mg/kg,在第2周平均每条蚯蚓产茧7.09枚。
  牛粪中添加尿素饲养青年期蚯蚓最适合的水平是5000mg/kg,在第3周单条蚯蚓平均重0.6592g;最适宜成年繁殖期个体增重的尿素添加水平5000mg/kg,在第3周单条蚯蚓平均重0.9260g;最适宜成年繁殖期产茧的尿素添加水平为4000mg/kg,在第2周平均每条蚯蚓产茧5.27枚。
  3、“大平二号”蚯蚓成年后或早或迟都出现各个体间体重趋近某一极限体重的现象,最终体重没有受到饲养条件和生长速度的明显影响。
  4、基料中总碳的变化受调理剂的种类和添加水平,蚯蚓的生长阶段和生长速度,基料种类的影响。
  5、牛粪中碳氮比(本试验)对青年期蚯蚓的生长速度无显著影响(P>0.05),对成年繁殖期蚯蚓的生长速度和产茧数均有显著影响(P<0.05)。
[硕士论文] 邓建玲
食品工程 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:自古以来,蜂蜜被认为是一种有价值的食品和药品,其药理活性和营养特性已经成为最近几十年蜂产品科学研究的主题。其中,荞麦蜜是蜜蜂采集荞麦花的花蜜酿造而成的蜂蜜,其呈深琥珀色,属于深色蜜的一种。相关研究表明,与市场上其他大宗单花蜂蜜相比,荞麦蜜含有更高的蛋白质、矿物质和酚类物质等,具有很高的营养价值。本文以麦卢卡蜜、荆条蜜和油菜蜜为对照,对荞麦蜜、荞麦蜜制品黑蜜的相关成分进行分析,并对其抑菌活性和细胞抗氧化活性进行评价,旨在对5种蜂蜜的质量特性、营养价值及相关功能活性进行综合评估。采用传统理化分析方法对5种蜂蜜中总酚酸、蛋白质、灰分、水分、单糖、双糖、酸度、羟甲基糠醛含量和淀粉酶活性进行分析,并通过ICP-MS和GC-MS对5种蜂蜜的矿物质元素和挥发性成分进行分析,综合评估5种蜂蜜的质量特性和营养价值;选取伤口感染的优势菌金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌,评价5种蜂蜜对这两种菌的抑菌活性,并分析其抑菌成分;采用大孔树脂富集提取、乙酸乙酯萃取纯化得到蜂蜜提取物,通过HPLC-DAD和HPLC-MS相结合对5种蜂蜜提取物中的酚酸和黄酮进行分析,并对其乙酸乙酯提取物进行细胞抗氧化活性评价。本文主要研究内容和实验结果如下:
  1.5种蜂蜜的理化成分和生物活性成分分析:
  黑蜜和荞麦蜜中的总酚含量和蛋白质含量远高于其它3种蜂蜜,黑蜜、荞麦蜜、麦卢卡蜜、荆条蜜和油菜蜜中的总酚含量分别为1938.43μg/g、1497.57μg/g、561.27μg/g、361.90μg/g、185.74μg/g,蛋白质含量分别为1671.15μg/g、1826.09μg/g、626.19μg/g、937.42μg/g、581.06μg/g。粗灰分含量由高到低分别为麦卢卡蜜(1537.36μg/g)、荆条蜜(804.65μg/g)、黑蜜(737.40μg/g)、荞麦蜜(556.32μg/g)、油菜蜜(222.77μg/g)。水分含量由低到高分别为麦卢卡蜜(13.80%)、油菜蜜(17.16%)、荆条蜜(18.46%)、黑蜜(21.73%)、荞麦蜜(26.22%)。果糖含量范围为29.47%~38.83%,葡萄糖含量范围为27.26%~38.01%,除油菜蜜外,其它4种蜂蜜的果/葡比均大于1,5种蜂蜜样品中均有检测出少量蔗糖,而麦芽糖只在黑蜜和麦卢卡蜜中检测到。酸度由高到低分别为黑蜜(24.55 mL/100g)、荆条蜜(23.74 mL/100g)、荞麦蜜(20.22 mL/100g)、麦卢卡蜜(15.69 mL/100g)、油菜蜜(15.12 mL/100g);HMF含量由高到低分别为黑蜜(146.57 mg/kg)、麦卢卡蜜(66.46 mg/kg)、荆条蜜(31.11 mg/kg)、荞麦蜜(11.53 mg/kg)、油菜蜜(9.21 mg/kg),其中黑蜜和麦卢卡蜜高于欧盟规定的40 mg/kg。淀粉酶值都符合欧盟的标准,其中荞麦蜜(59.29 mL/g.h)的淀粉酶值远高于黑蜜(13.90 mL/g.h)、麦卢卡蜜(9.27 mL/g.h)、荆条蜜(21.32 mL/g.h)和油菜蜜(10.03 mL/g.h)。
  2.5种蜂蜜中矿物质元素的鉴定分析:
  5种蜂蜜中的主要常量元素包括钙、镁、钠、钾、铁6种。其中,钙元素含量最高,范围为1381 ppm~1568 ppm,黑蜜中钙含量最高,麦卢卡蜜中最低;其次为钠、钾元素,其中钠元素含量相近,为310.68 ppm~385.34 ppm,而麦卢卡蜜中钾元素的含量远高于其它4种蜂蜜,达到1227.56 ppm;黑蜜中铁元素含量最高,为25.05 ppm。在检测的11种微量中,猛、锌、硼、铝、钡这5种微量元素的含量高达几千ppb,铜、铬、镍3种元素含量约为几百ppb,铜元素并未在麦卢卡蜜、荆条蜜和油菜蜜中检测到,钴、钒、钼这3种元素含量最低,均小于50 ppb。有毒金属元素中,5种蜂蜜样品都未检测出元素铅,砷和镉的含量也很低。
  3.5种蜂蜜中挥发性成分的鉴定分析:
  5种蜂蜜中主要的挥发性物质包括呋喃类、醇类、醛类、酯类、酸类、酮类、醚类、烯烃类、烷烃类等,共统计出113种挥发性物质。5种蜂蜜共有的挥发性物质包括:糠醛、2-(5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基)丙-2-基酯、苯乙醇、棕榈酸乙酯,糠醛对蜂蜜挥发性成分的贡献率很高。黑蜜和荞麦蜜中主要的成分有正戊酸、苯乙醛、对甲酚、苯乙醇、癸醛和苯乙酸乙酯等。麦卢卡蜜中检测到的主要挥发性物质有邻甲氧基苯乙酮,含量最高,为24.53%,其次有2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、芳樟醇、对甲氧基苯甲醛、3,4,5-三甲基苯酚等。荆条蜜中检测到的主要挥发性物质有苯乙醛、苯乙醇、L-α-松油醇、2-苯基巴豆醛、癸醛和 D-柠檬烯等。油菜蜜中检测到的挥发性物质种类最多,主要为各种酯类,包括苯丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、癸二酸二乙酯、十四烷酸乙酯、2-丁烯羧酸二甲酯、油酸乙酯等,其次油菜蜜中也检测到一系列的烷烃类化合物,包括十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷以及二十烷等物质。
  4.5种蜂蜜抑菌成分分析和抑菌活性评价:
  5种蜂蜜中都未检测到过氧化氢,麦卢卡蜜中的甲基乙二醛含量高达350.59mg/kg,远高于其它4种蜜。随着各蜂蜜溶液浓度的增加,抑菌圈直径和抑制率也在增加,不同浓度的蜂蜜样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于绿脓杆菌。琼脂扩散法中,荞麦蜜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于其它4种蜜,麦卢卡蜜对绿脓杆菌的抑菌效果优于其它4种蜜。肉汤稀释法中,黑蜜、荞麦蜜、麦卢卡蜜、荆条蜜和油菜蜜对金黄色葡萄球菌的IC50值依次为22.5%~45.0%、11.25%~22.5%、5.63%~11.25%、5.63%~11.25%和22.5%~45.0%,麦卢卡蜜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于其它4种蜜;上述5种蜜对绿脓杆菌的IC50值依次为11.25%~22.5%、5.63%~11.25%、11.25%~22.5%、11.25%~22.5%和22.5%~45.0%,荞麦蜜对绿脓杆菌的抑菌效果优于其它4种蜜。油菜蜜和黑蜜对两种菌的MBC值均大于90%,荞麦蜜、麦卢卡蜜和荆条蜜对金黄色葡萄球菌的MBC值是22.5%,对绿脓杆菌的MBC值是44.5%。总体而言,荞麦蜜、麦卢卡蜜和荆条蜜对两种菌的抑菌效果优于油菜蜜和黑蜜。
  5.5种蜂蜜乙酸乙酯提取物中酚类化合物的定性、定量分析:
  建立了蜂蜜乙酸乙酯提取物的RP-HPLC-DAD分析方法:Hypersil GOLD C18柱(250×4.6 mm,5μm)为分析柱,进样量10μL,1.0%乙酸和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5mL/min,柱温30℃,二极管阵列检测器,检测波长280nm。15种酚酸、黄酮对照品在各自的线形范围内相关系数均满足实验要求,检出限范围0.31~2.09μg/mL,加标回收率为95.42%~107.53%,精密度和稳定性的RSD均小于5%。5种蜂蜜中,黑蜜、荞麦蜜、麦卢卡蜜均不含有阿魏酸、异阿魏酸和异鼠李素,黑蜜中也不含有苯甲酸;荆条蜜不含有苯甲酸;油菜蜜不含有阿魏酸和芹菜素。5种蜂蜜提取物中15种酚酸、黄酮的含量分别为荞麦蜜(109.56μg/mg)、黑蜜(70.60μg/mg)、荆条蜜(54.40μg/mg)、油菜蜜(16.50μg/mg)、麦卢卡蜜(7.39μg/mg)。
  6.5种蜂蜜乙酸乙酯提取物的细胞抗氧化活性(CAA)评价:
  5种蜂蜜提取物和槲皮素的PBS清洗体系中的EC50值均低于未经PBS清洗体系,表明其对应的细胞抗氧化能力强于未经PBS清洗体系。未经PBS清洗体系中,黑蜜、荞麦蜜、麦卢卡蜜、荆条蜜和油菜蜜的EC50值分别为193.07μg/mL、49.41μg/mL、82.43μg/mL、95.90μg/mL和162.03μg/mL,其中荞麦蜜的EC50值要低于其它4种蜂蜜,说明其提取物的抗氧化能力最强;PBS清洗洗体系中,EC50值分别为229.97μg/mL、226.30μg/mL、324.37μg/mL、179.83μg/mL和237.67μg/mL,其中荆条蜜的EC50值要低于其它4种蜂蜜,说明其提取物的抗氧化能力最强。未经 PBS清洗体系中, CAA值由高到低分别为麦卢卡蜜(24.82μmol/100g)、荞麦蜜(6.98μmol/100g)、荆条蜜(2.44μmol/100g)、黑蜜(2.04μmol/100g)、油菜蜜(1.16μmol/100g)。PBS清洗体系中, CAA值由高到低分别为麦卢卡蜜(8.63μmol/100g)、黑蜜(2.34μmol/100g)、荞麦蜜(2.09μmol/100g)、荆条蜜(1.78μmol/100g)、油菜蜜(1.08μmol/100g),PBS不洗和清洗体系中,CAA值最高的是麦卢卡蜂蜜,分别为24.82μmol/100g和8.63μmol/100g。
[硕士论文] 宾先丽
生物化学与分子生物学 重庆师范大学 2016(学位年度)
摘要:选取重庆地区13个区县的122群中华蜜蜂。系统地对重庆地区中华蜜蜂种质资源的遗传多样性进行了调查,此次研究主要运用形态特征标记和线粒体DNA标记两种方法对重庆地区中华蜜蜂的遗传多样性进行了分析,为进一步全面了解重庆地区中华蜜蜂种质资源的遗传多样性奠定基础,也为重庆地区中蜂的保护和发展提供重要依据。主要结果如下:
  1.形态特征多样性分析
  对重庆地区中华蜜蜂6项形态指标进行分析,发现部分地理种群中蜂形态特征值之间存在极显著性差异(P<0.01),显著性差异(P<0.05)或无显著性差异(P>0.05);6项形态指标相关分析发现,除肘脉指数与其余5项指标均无相关性外,其余5项指标相互之间存在极显著相关;6项形态指标直接聚类和主成分聚类分析一致,结果显示重庆地区与湖北荆门、四川乐山地区中蜂聚为两支,重庆地区的中华蜜蜂主要分为三大群,第一支是武陵山、大娄山地区类型,主要有武隆、南川、江津等地区,第二支是大巴山脉地区类型,主要以城口地区为代表,第三支是以合川地区为代表的重庆西北部类群;判别函数聚类结果显示湖北荆门、四川乐山地区中蜂与重庆地区中蜂仍然聚为两支,但重庆地区内部具有差异,城口地区与阿坝中蜂聚在外群,武隆、南川、江津地区聚为武陵山—大娄山地区类型,以上结果显示采用主成分聚类结果更能反映重庆地区中华蜜蜂形态分化与地理环境的关联性。
  2.线粒体DNA遗传多样性分析
  对139群中蜂线粒体tRNAleu~COⅡ段的序列进行测定并分析其中的非编码区,发现所有样本共有17个单倍型,其中8个共有单倍型和9个种群特有单倍型,整体单倍型多样度为0.711±0.00065,核苷酸多样度为0.01792,可见重庆地区中华蜜蜂具有丰富的遗传多样性;与已报道的东方蜜蜂线粒体DNA非编码区单倍型比对发现,单倍型 H_4、H_7、H_13为重庆地区新发现的单倍型,为首次报道;网络中介分析和聚类分析发现,17个单倍型主要聚为3大类,单倍型H_1、H_3和H_5为三个聚类簇,其中H_1为主要聚类簇,新单倍型H_4、H_13起源于单倍型H_1,单倍型H_7与其余单倍型表现出分离。
  3.重庆地区桶养中华蜜蜂的多样性分析
  通过对桶养中蜂的形态和线粒体DNA非编码区进行分析,形态聚类发现老桶养殖中蜂与地理关系比较明显,大部分中蜂保持其地理特性,城口中蜂为大巴山类型,而武隆、江津、南川、彭水均属于武陵山—大娄山型,这一结果支持了形态标记主成分聚类的结果,说明所采样本与记录结果一致,多为收捕野生中蜂,并且没有发生大的流动性,能够全面、真实的反映重庆地区中蜂遗传多样性。从选取的具有典型样本代表的桶养中蜂形态结果与单倍型对比分析发现同种单倍型中蜂其形态可能会发生分化,处于相同地理位置的中蜂其形态较近但单倍型也会有所差异。
[硕士论文] 袁安
特种经济动物饲养 江西农业大学 2016(学位年度)
摘要:蜜蜂是神经生物学模式生物,其学习记忆与导航能力受到广泛关注。研究表明,许多外界因素可影响蜜蜂的导航能力,并且这种影响可能与蜜蜂的CCD相关。
  本试验以意大利蜜蜂为研究对象,通过人工饲喂15%(试验Ⅰ)、25%(试验Ⅱ)与35%(试验Ⅲ)蛋白水平饲粮45d后,利用蜜蜂无线识别监控技术(RFID)测定各试验组采集蜂在1000 m与2000m的回归率,同时采用荧光定量PCR检测不同时期(刚出房、10日龄与20日龄)工蜂学习记忆相关基因(GluRA、Nmdar1与Tyr1)表达量。结果表明,在1000m与2000m距离,试验Ⅱ组与试验Ⅲ组采集蜂的回归率均显著高于试验Ⅰ组(P<0.05),但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组差异不显著;刚出房工蜂各试验组3个基因表达量差异均不显著(P>0.05);10日龄工蜂试验Ⅱ组与试验Ⅲ组Tyr1基因表达量显著高于试验Ⅰ组,但在20日龄三者差异不显著;10日龄和20日龄工蜂试验Ⅱ组与试验Ⅲ组GluRA与Nmdar1基因表达量均显著高于试验Ⅰ组,且试验Ⅲ组的GluRA基因表达量也显著高于试验Ⅱ组。说明饲粮蛋白质水平过低会影响蜜蜂的归巢能力及某些相关记忆基因的表达。
  本试验以意大利蜜蜂为研究对象,通过人工将刚封盖的蜜蜂封盖子分别放入33℃(试验Ⅰ)、35℃(试验Ⅱ)与37℃(试验1Ⅲ)孵化箱中孵化,出房后标记颜色放回原蜂群。利用蜜蜂RFID技术测定标记的采集蜂在1000m与2000m处回归率,同时采用荧光定量PCR检测不同时期(刚出房、10日龄、20日龄)工蜂GluRA、Nmdar1与Tyr1基因表达量。结果表明:在1000m与2000m距离,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组采集蜂的回归率均显著高于试验Ⅰ组(P<0.05),但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05);刚出房、10日龄和20日龄工蜂试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的GluRA和Nmdar1基因相对表达量均显著高于试验Ⅰ组,但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组之间差异不显著;刚出房工蜂试验Ⅱ组的Tyr1基因相对表达量显著高于试验Ⅰ组与Ⅲ组,但试验Ⅰ组与试验Ⅲ组之间差异不显著;另外,10日龄和20日龄工蜂各试验组的Tyr1基因相对表达量差异均不显著。因此,发育温度过低会影响蜜蜂的归巢能力及某些相关记忆基因的表达。
  本试验以中华蜜蜂为研究对象,通过人工饲喂试喂1∶1的糖水(试验Ⅰ)、1∶1糖水+100mg/kg维生素B2(Ⅱ组)、1∶1糖水+400 mg/kg维生素B2(Ⅲ组),每天记录各组蜜蜂死亡情况,按照工蜂饲养方法对1日龄工蜂喂养7d后,利用PER方法测定不同浓度维生素B2对蜜蜂短时学习记忆及长时学习记忆能力的影响,并通过荧光定量PCR检测学习成功后蜜蜂学习记忆相关基因的表达量。研究结果表明:工蜂的平均寿命随维生素B2浓度的升高而延长,而且试验组(Ⅱ组、Ⅲ组)的平均寿命显著高于对照组(Ⅰ组)(P<0.05),但Ⅱ组与Ⅲ组差异不显著(P>0.05)。饲喂高浓度维生素B2(Ⅲ组)的蜜蜂长时学习记忆及短时学习记忆能力均显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05),而且饲喂低浓度维生素B2(Ⅱ组)的蜜蜂在长时学习记忆能力也显著高于对照组(Ⅰ组)(P<0.05);饲喂高浓度维生素B2(Ⅲ组)蜜蜂的Acdop3、AcCREB基因相对表达量均显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05),而且饲喂低浓度维生素B2(Ⅱ组)蜜蜂Acdop3基因的相对表达也显著高于对照组(Ⅰ组)(P<0.05)。
[硕士论文] 周林斌
特种经济动物饲养 江西农业大学 2016(学位年度)
摘要:蜂王是蜂群中唯一具有繁殖能力的雌性个体,其品质的优劣与整个蜂群的群势及产量等息息相关。
  本试验利用不同直径王台(9.4mm、9.6mm、9.8mm与10.0mm)培育西方蜜蜂蜂王,检测王台大小对育王质量的影响。结果表明,随着王台直径的增加,蜂王的初生重、卵巢管数、胸长与胸宽指标均显著上升。荧光定量PCR结果表明,随王台直径的增加,蜂王腹部的卵黄蛋白原基因(Vg)表达量也逐步上升,各组间差异显著。说明王台的大小直接影响蜂王的质量。
  通过控制囚王时间(0d、2d与4d)来培育优质蜂王。结果表明,囚禁蜂王的时间越长,其产下卵的卵重、卵长与卵宽均显著上升,培育出的蜂王在初生重、卵巢管数、蜂王胸长与胸宽上均显著上升。同时,荧光定量PCR结果发现蜂王腹部的Vg表达量也随囚王时间的增加而显著上升。说明囚王时间显著影响蜂王的产卵质量,进而影响培育出新蜂王的质量。
  利用工蜂巢房中的受精卵、1、2和3日龄幼虫分别培育蜂王,比较分析各组蜂王的形态、基因表达与DNA甲基化差异。结果表明,随着移虫日龄的增长,其蜂王和3日龄幼虫的体重逐步下降,且蜂王胸长与胸宽也逐步下降。利用RNA-Seq测序分析发现,随着移虫日龄的增长,其与卵发育组蜂王幼虫的基因逐步增加。1日龄幼虫与卵发育组蜂王幼虫对比组差异基因为10个,2日龄对比组为47个,3日龄对比组为366个。许多差异基因参与了蜂王的身体发育、新陈代谢、繁殖性能、寿命与免疫系统。同时,DNA甲基化测序结果表明,移虫日龄的增加,也逐步提高了其蜂王幼虫的全基因组甲基化水平,这也说明利用工蜂幼虫培育蜂王会显著降低蜂王的质量和寿命。
[硕士论文] 施腾飞
动物遗传育种与繁殖 安徽农业大学 2016(学位年度)
摘要:蜜蜂是真社会性昆虫,蜂群中的工蜂具有年龄依赖性的劳动分工行为,而且工蜂的这种行为是可塑性的,工蜂可以根据蜂群的需要转变自己的行为。MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子,长度一般在18~24 nt左右,它能通过与靶标mRNA分子互补结合抑制蛋白质翻译或导致mRNA降解,从而调控靶基因表达。本研究运用荧光定量PCR技术检测了6种miRNA(let-7,miR-13b,miR-31a,miR-210,miR-275,miR-279)在不同日龄(4,8,12,17,22,26和30日龄)工蜂脑部的表达水平;同时本研究还组建了同日龄蜂群,并通过荧光定量PCR和northern blot技术检测了其中3种miRNA(let-7,miR-13b和miR-279)在同日龄(12和30日龄)哺育蜂和采集蜂脑部的表达水平,筛选可能与蜜蜂行为转变相关的miRNA。主要结果如下:
  1、不同日龄工蜂脑部6种miRNA的表达水平
  let-7,miR-13b和miR-279这3种miRNA在工蜂中的表达具有明显的时间特异性:let-7的表达量随工蜂日龄的增加逐渐降低,在17日龄后其表达量趋于稳定;miR-13b的表达量则随着工蜂日龄的增加逐渐增加,但在26和30日龄的工蜂中稳定表达;miR-279的表达量则呈类似正态分布状态,其中在12日龄工蜂中表达量最高,且在17日龄后稳定表达。而另外3种miRNA(miR-31a,miR-210,miR-275)的表达则没有明显的时间特异性。
  2、同日龄哺育蜂与采集蜂脑部3种miRNA的表达水平
  荧光定量PCR结果显示let-7在12和30日龄采集蜂表达量与同日龄的哺育蜂相比均极显著下调表达(P=0);miR-13b在12日龄采集蜂中表达量显著低于同日龄哺育蜂(P<0.05),而在30日龄采集蜂中则显著高于同日龄的哺育蜂(P<0.05);miR-279在12日龄采集蜂中的表达量极显著低于同日龄哺育蜂(P<0.01),在30日龄哺育蜂中也显著高于同日龄哺育蜂(P<0.05)。Northern blot分析结果与荧光定量PCR结果一致。
  let-7和miR-279这2种miRNA在工蜂脑部的表达均表现出显著的规律性及时间和行为特异性。
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