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[硕士论文] 袁野
生物物理学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:科技的发展加快了激光器的研发进程,飞秒激光器由于瞬时功率超高、作用生物组织时损伤较小、脉冲时间与生物化学反应时间相近等优点,已成为诱变育种领域的先进设备。目前,激光辐照技术为增加农作物的产量与优化农作物的品质做出了极大的贡献,是我国农业发展的必要的技术手段。拟南芥因个体小、生命周期短、易于培养、基因组少等特点,被广泛应用于生物领域的研究。
  本文以哥伦比亚野生型拟南芥种子为材料,利用波长800nm、频率1KHz的飞秒激光对其进行不同功率与时间的辐照处理,经固体MS组织培养后,统计其发芽率、根长、鲜重、株高,测量叶绿素含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶活性及丙二醛含量,通过对实验组与对照组(未经辐照处理)的数据进行分析,研究飞秒激光对拟南芥种子萌发、幼苗的生长发育及生理生化方面产生的影响。主要研究结果如下:
  (1)适当条件的飞秒激光均能提高拟南芥种子萌发,促进幼苗的形态发育,随着辐照剂量的增加促进作用减弱,直至抑制作用
  (2)在适当的辐照条件下,飞秒激光能同时提高拟南芥幼苗的叶绿素含量、可溶性糖含量及过氧化氢酶的活性,降低丙二醛的含量,提升了拟南芥幼苗的光合作用,增强了拟南芥的抗逆性。
  (3)辐照功率175mw、辐照时间4-12s的飞秒激光能全面提高拟南芥的各项测量指标,包括种子的萌发、幼苗的生长发育、幼苗的光合作用与抗逆性。
[硕士论文] 黄朝琨
设施园艺学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:我国设施作物生产中土壤营养元素失衡,土壤呈现酸化趋势是一个较为严重的问题。土壤酸化会增加可溶性铝的含量,抑制植物正常生长和损害其生理功能。植物体内合成的铝激活苹果酸转运蛋白(ALMT1)能促进根系苹果酸的分泌,从而缓解植物受铝离子的胁迫。因此ALMT1在调节苹果酸分泌和植物对铝胁迫耐受的过程中起着关键作用。为深入研究植物耐铝基因ALMT1表达的调控机制,本研究通过诱导获得对铝胁迫不敏感的拟南芥突变体,鉴定和筛选参与铝胁迫信号转导和AtALMT1表达转录因子的相关基因。主要研究结果为:
  利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导携带绿色荧光蛋白(GFP)AtALMT1启动子的转基因拟南芥,使其产生突变且引起AtALMT1的表达异常,筛选出7个对铝不敏感的拟南芥突变体。通过对比铝离子胁迫拟南芥突变体与野生型的表型差异,发现突变体在根和下胚轴生长上受抑制的程度不同,其中MD1下胚轴长度受到显著抑制,MD4、MD5、MD6、MD7则显著抑制根系生长,而MD2和MD8未能观察到生长明显受抑制。
  通过检测7个突变体的苹果酸释放量、AtALMT1表达量及铝胁迫相关基因(CAMTA2、STOP1、ALS3、MATE)的表达量,发现除MD5以外,其它突变体中苹果酸的分泌量明显降低,AtALMT1的表达量也有不同程度下降。根据前人有关铝诱导拟南芥AtALMT1的表达归类为早期调控和晚前调控两个阶段,本研究筛选的铝敏感型突变体MD4、MD6、MD7归类为早期调控,MD1、MD2、MD5、MD8归类为晚期调控。
  在吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)处理下,突变体的AtALMT1表达量受到不同程度抑制,其中突变体MD4、MD6、MD7与IAA诱导型表达相关,MD1、MD4、MD6与ABA诱导型表达相关。分析铝离子处理下突变体的转录组,结果显示参与铝胁迫信号转导和转录因子活性调控的ALS3、MATE、PLT3、SUL TR3等基因在MD4和MD5中被抑制,这与野生型和STOP1突变体有明显的差异。
  利用根长和下胚轴长的性状分离,筛选人工杂交获得的铝不敏感型突变体F2代和BC代群体进行图位克隆研究,结合AtALMT1表达和相关分子标记,对5个突变体的突变位点进行了粗略定位。根据分子标记连锁分析,得出MD1的突变位点在第四染色体前半段,物理图距为5.2Mbp;MD4、MD6和MD7的突变位点分别位于第一染色体后半段的不同标记处,物理图距分别为20.9Mbp和27.6Mbp;MD5的突变位点有两个,分别位于第二染色体末端和第五染色体中部,物理图距分别为14.7Mbp和19.5Mbp。
  进一步对铝不敏感型突变体进行InDel(插入缺失多态性)分子标记和PCR精确定位研究。得出MD1在第四染色体上突变位点的范围为5.15Mbp至6.14Mbp之间,MD5在第二染色体上突变位点的范围为14.7Mbp至15.8Mbp之间。结合全基因组测序(NGS)结果,分析得到MD1的4个突变候选基因和MD5的14个突变候选基因。筛选这些基因的纯合T-DNA敲除株系,并研究铝胁迫下它们的表型特征和AtALMT1表达量,结果表明,MEKK3、CRY1和PGM可能参与调控拟南芥中AtALMT1的表达。
  根据以上结果,提出AtALMT1表达的调控模型,阐明筛选出的7个突变体在AtALMT1表达调控中早期阶段和晚期阶段的关系。研究结果为深入探明植物耐受铝胁迫的分子机制和遗传分析奠定了基础。
[硕士论文] 董江艳
遗传学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:随着化石能源的日渐枯竭,全球范围内的能源危机正不断加重,因此寻找新的替代能源是今后发展的必由之路。生物能源是可再生、高效清洁的绿色能源,生物燃料乙醇利用植物纤维素为原料经酶解糖化、发酵产生乙醇,可直接按一定比例添加到汽油中作为燃料使用。但木质纤维素原料结构复杂,其中高含量的木质素直接影响了纤维素酶的转化效率,导致纤维素的降解效率降低,这已经成为制约该产业发展的重要因素。甜高粱因其具有生物量大,抗逆性强、茎秆含糖量高等优点已成为当今世界广泛关注的新型能源作物。通过基因工程改变木质素合成途径中关键基因的表达而调控木质素的合成,适当降低其木质素含量,已成为提高生物乙醇生产技术的重要途径之一。
  SbbHLH1是高粱木质素合成中的负调控因子(闫丽博士论文,2011),但对其作用机制还缺乏深入的认识。本文通过其与其他转录因子及蛋白质的互作以及靶基因启动子的识别、结合等研究其调控木质素的合成机理。对已经筛选出的两个拟南芥过表达纯系(SbbHLH1-GFP),通过苯丙烷类代谢途径相关Marker基因的表达和Wiesner染色,进一步证明转录因子SbbHLH1对木质素的合成有负调控作用,未受到GFP对其功能的影响,同时这有利于进一步通过该标签研究该转录因子的表达部位、互作蛋白等信息。通过SbbHLH1-His重组蛋白与野生型甜高粱(S213)茎叶总蛋白、SbbHLH1-GFP过表达拟南芥总蛋白亲和层析-质谱分析(AS-MS),最终从苯基丙烷途径中识别出11个可能的“互作”蛋白,经酵母双杂、BiFC等实验进一步验证,最终找到参与木质素的合成的细胞色素P450(CYP98A3)与SbbHLH1发生互作,因为AtCYP98A3就是木质素代谢途径中的C3H基因,与其互作可能影响其活性,进一步影响木质素的合成;同时SbbHLH1转录因子与靶位点的结合及与其他蛋白的互作、降解也可能受到与C3H结合的影响。本实验通过竞争结合实验进一步确认SbbHLH1转录因子可结合AtPAL1启动子的E-box(CANNTG),同时还发现At4CL1启动子的E-box也可和SbbHLH1结合。这就进一步证明了SbbHLH1转录因子最少通过结合两个苯基丙烷途径中的重要基因E-box,调控木质素的合成(AtPAL1和At4CL1)。
  对已获得的SbbHLH1转基因毛白杨五年生实生苗,因其为嵌合体,需进一步进行分子检测,对其阳性枝条进行纤维素降解实验,实验结果证明SbbHLH1转基因毛白杨中木质素的降低,有利于纤维素酶对其中纤维素的降解;而且木质素的含量与纤维素的转化率呈显著负相关。该结果为通过基因工程技术创制低木质素含量的杨树等能源植物新品种提供一条有益的途径。
[硕士论文] 魏斐
遗传学 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus L.,AACC,4n=38),由白菜(B.rapa,AA,2n=20)与甘蓝(B.oleracea,CC,2n=18)经天然杂交形成,是异源多倍体多倍化进程研究的模式植物。其不仅经历了古老的γ、β和α全基因组多倍化事件,还在这些多倍化事件的基础上又经历了一次芸薹属特有的全基因组三倍化事件(Bra-αWGT event)。
  GRAS基因家族是一类植物特有的转录因子,对植物生长发育具有重要的作用,例如信号转导、抗病和抗逆等多种生物过程。然而全基因组多倍化事件与异源多倍化对GRAS基因家族的特征、功能等因素所造成的影响并不清楚,进而限制了该基因家族在分子改良育种上的应用。本研究中,我们在完成甘蓝型油菜GRAS基因家族鉴定与综合分析的基础上,系统的分析了全基因组多倍化事件和异源多倍化对甘蓝型油菜GRAS基因家族的影响。主要结果如下:
  (1)通过对已公布的基因组序列进行分析与修订,在甘蓝型油菜中鉴定出96个GRAS基因,可分为不同的13个亚家族与17个OG(orthologous groups)。与其他物种比较,甘蓝型油菜在在进化中丢失了4个亚家族、12个OG中的成员。PAT、LISCL等亚家族在全基因组三倍化事件、异源多倍化后得到了明显的扩张,同时也发现LS、SCR、NSP1等亚家族在数量上趋向于保守。
  (2)通过基因结构、蛋白保守模序分析,甘蓝型油菜GRAS基因家族的各个成员在基因结构上都比较保守,每个亚家族内各个成员的基因结构都高度相似,但是亚家族之间的基因结构经比较分析后却发现有一定的分化。异源多倍化后,一些甘蓝型油菜GRAS基因相对于其祖先种中的同源基因会产生新的内含子,但大多数GRAS基因结构依旧保留单外显子或只含有1个内含子。
  (3)异源多倍化后,大多数甘蓝型油菜GRAS基因的染色体定位都与其祖先种同源基因高度相似,可利用该特点推测基因组注释文件中未精准确定的GRAS染色体定位。同时也发现有2个白菜GRAS基因的同源基因定位于甘蓝型油菜Cn亚基因组中,这可能是由染色体易位造成的。
  (4)经转录组数据分析,甘蓝型油菜GRAS基因广泛参与各类器官、组织的生长与发育过程,但是一些基因在甘蓝型油菜与其祖先种之间的组织特异性表达有所区别。GRAS基因受生物胁迫与非生物胁迫的诱导可出现上调表达。
  (5)甘蓝型油菜GRAS基因在进化中受纯化选择作用,并没有出现基因的新功能化,大多数GRAS基因在进化上非常保守。
[硕士论文] 刘欢
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:植物的正常生长离不开茎尖分生组织和花分生组织的正常发育。拟南芥中研究结果表明,WUSCHEL(WUS)基因主要参与茎尖干细胞的维持,在胚珠和花粉发育过程中也起着重要的作用。WUS可以通过诱导细胞分裂素响应调节因子来调控分生组织的发育,还可以和CLAVATA(CLV)形成负反馈调节环来决定干细胞分裂与分化之间的动态平衡,同时WUS可以与AGAMOUS(AG)基因协同调控花分生组织向花器官的转化。但是在豆科作物中该基因如何调控并影响干细胞的维持和发育目前还没有明确的研究结果。
  蒺藜苜蓿是研究豆科功能基因组学的模式生物,其基因组较小,且遗传转化体系较为成熟。以本实验室前期得到的三个茎尖分生组织发育异常的突变体headless(hdl)为基础,成功克隆到了HDL基因,通过对hdl-1突变体的表型分析和对HDL基因功能进行解析,初步明确了HDL基因在蒺藜苜蓿茎尖分生组织发育和叶型发育中的调控作用。主要研究结果如下:
  通过正向遗传学的方法,我们在豆科模式植物蒺藜苜蓿中克隆了一个拟南芥WUS的同源基因HDL,该基因主要参与蒺藜苜蓿茎尖分生组织维持和叶片发育。当HDL突变后,茎尖分生组织发育异常,主要表现在茎尖分生组织形态和功能不完整以及腋芽分生组织的不规则发育,导致hdl突变体丧失顶端优势,只进行营养生长,没有明显的茎秆出现。hdl-1突变体叶片由于尖端伸长减少而导致其叶片长度变短,这导致突变体叶片呈现心形的表型,这是拟南芥wus突变体中没有描述的新表型。对HDL蛋白进行转录活性分析得出,HDL可以与TOPLESS(TPL)相互作用形成共抑制子,且二者的互作需要HDL蛋白保守的WUS-box和EAR-like结构域。进一步遗传学分析发现,尽管HDL和蒺藜苜蓿叶片生长的关键调节因子STENOFOLIA(STF)都可以招募TPL蛋白,但是在调控蒺藜苜蓿叶片发育中,二者功能是相对独立的。我们的研究结果表明,和拟南芥相比,WUS/HDL在调控蒺藜苜蓿分生组织和叶片发育中的功能既有保守又存在分化,为理解豆科植物分生组织发育和叶型发育提供了新的思路。
[硕士论文] 董美
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:伴随着测序技术的高速发展,下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)是目前核酸序列分析领域的主流测序技术,被广泛用于各类组学的研究。NGS是一种通量高、覆盖度广、快速有效的全基因组重测序手段,为生物技术作物分子特征解析提供了新的选择。分子特征是对生物技术作物在基因组上的改变及其产生的影响进行全面准确的描述。本研究以生物技术水稻作为实验材料,构建生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。主要研究内容与结果如下:
  1、建立了生物技术作物分子特征解析的NGS分析方法。以抗虫水稻科丰2号为研究材料,利用NGS技术初步建立生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。分析结果与hiTAIL-PCR方法获得的科丰2号水稻分子特征结果一致,证明了该分析体系的可行性及可靠性。同时,该分析体系提供了一种较为简单的分子特征解析策略,即只需利用NGS解析插入位点,采用PCR扩增获得插入位点处的外源DNA全长序列。对于外源DNA片段相对较短的情况,这种方法简单易行、适用性强。
  2、获得了T1C-19和T2A-1两种水稻的分子特征信息,并进一步完善了基于NGS的分子特征解析体系。针对两种材料外源片段结构的复杂性,采用了个性化分析的方式,通过测序数据的挖掘分析、外源片段拷贝数预测,获得了两种材料的分子特征:T1C-19水稻的外源插入片段为2个拷贝的T-DNA同向串联重复,采用PCR验证了此结构;T2A-1水稻ubiquitin基因部分序列反向互补,采用PacBio三代测序验证了此结构。因此,该分析体系提供了另一种分子特征解析策略,即利用NGS获得分子特征信息,利用PCR扩增、三代测序等进行验证,该解析策略对解决外源DNA串联重复问题提供了参考方法。此外,对于单株作物获得的测序数据,直接可以对其纯合及杂合状态进行判定,为生物技术作物的遗传选育、品种鉴定提供服务。
  综上,本论文的研究结果显示,基于NGS技术的生物技术作物分子特征解析体系,克服了传统分析方法的不足,对于生物技术作物的审批、监管、追溯和标识等方面具有重要意义,此外,也为生物技术作物成分检测技术的发展提供技术支持。
[硕士论文] 闫法领
精密仪器及机械 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:农作物表型信息是育种专家判别种子优良与否的重要依据,是种子筛选的重要参考。长期以来农作物表型信息检测主要依靠育种专家蹲守地头,人工采集,不仅工作量大,而且效率低,特别由于农作物生产周期的限制,育种专家手工采集的农作物表型信息往往不够充分,影响了种子性能的准确评估。因此研发一种农作物表型快速检测机器人系统,实现农作物表型信息的快速检测对育种领域而言具有重要研究意义和价值。
  本文从农作物表型信息快速检测的迫切需求出发,开展了农作物表型快速检测机器人系统的研究工作,在中国科学院重点部署项目“现代农资经营与智能农业服务系统(编号2012BAH20B02)”子课题“高通量育种作物本体与环境快速检测装置(编号Y622A21291)”支持下,研制了一套农作物表型快速检测机器人系统,用以实现农作物表型的快速检测。
  本文在分析农作物表型快速检测研究现状和技术需求的基础上,明确了机器人系统的指标参数,设计了机器人系统结构,分析了机构的有限元特性,开发了农作物表型快速检测机器人控制系统,研究了基于机器视觉的机器人操作对象的定位问题,研制了一套农作物表型快速检测机器人系统。该系统目前安装在龙亢农场,为育种专家实时掌握农作物表型信息解决了平台问题。论文的主要工作如下:
  1、针对农作物表型检测的任务需求,研发了一套作物表型快速检测机器人系统,该系统包括作物表型快速检测平台和数据采集系统两部分,实现了农作物表型的快速检测任务,其中农作物表型快速检测平台负载不低于200Kg,定位精度高于40mm,数据采集系统重复定位精度高于1mm。
  2、设计了农作物表型快速检测移动机构,采用有限元分析软件ANSYS workbench,分析了农作物表型快速检测机器人相关机构的有限元特性,验证了系统设计的合理性。
  3、设计了基于红外测距仪和PLC的农作物表型检测机器人控制系统,编写了控制程序,实现了对于机械臂的可编程控制,实验结果表明系统定位精度达到设计目标。
  4、阐述了双目立体视觉的定位原理,分析了相机的成像模型,实现了基于OpenCV的摄像机内外参数的标定,以及基于MFC的双目立体视觉的软件的编程。
[博士论文] 雷娜
园艺学(蔬菜学) 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱胁迫与高盐胁迫是全球范围内严重影响农作物产量的两种主要非生物胁迫。对于生长调节而言,盐和干旱胁迫包括离子信号通路和渗透平衡信号通路。传统的育种方法耗时耗力,并且对于提高作物对高盐和干旱的耐力效率极低。为了探究非生物胁迫的抗性机理,前人从形态学、生理学、生物化学以及之后的分子水平等方面进行了大量的研究。目前,番茄已成为茄科的一种经济蔬菜作物,并作为双子叶植物基因研究的模式植物。属于一个多基因家族的膜联蛋白在植物胁迫反应和多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。在本研究中,我们从具有抗旱性的野生番茄潘那利(Solanum pennelli)克隆了AnnSp2,并在栽培种中对其进行了功能研究。主要研究成果如下:
  1、对AnnSp2进行克隆和测序,结果表明AnnSp2编码一个有316个氨基酸组成的膜联蛋白。
  2、通过实时定量PCR对AnnSp2表达谱分析,结果表明AnnSp2在叶片和花中大量表达,AnnSp2蛋白主要定位于细胞核。AnnSp2能够被植物激素以及非生物胁迫强烈诱导,如失水,高盐以及脱落酸。
  3、通过农杆菌介导的遗传转化,获得了16个AnnSp2过表达的转基因株系。
  4、对3个AnnSp2过表达株系进行了非生物胁迫的抗性鉴定。通过对发芽率、根系发育状况、存活率、叶片失水率和叶绿素含量等生理学指标的测定,结果表明过表达AnnSp2能增强番茄对干旱及盐胁迫的抗性。
  5、AnnSp2转基因植株在种子萌发期和幼苗期对脱落酸不敏感,这一现象揭示了转基因植株对胁迫抗性有所增强。
  6、此外,ROS的清除,叶绿素总含量的提高,脂质过氧化水平的降低,过氧化酶活性的增强(包括APX,CAT和SOD)以及脯氨酸含量的升高—这些现象均在AnnSp2超表达植株中被观察到,这和那些与胁迫相关的基因的在转录水平的变化联系紧密。
  7、通过与胁迫相关的基因表达量的变化而得到的关于发芽和幼苗实验的结果显示,超量表达AnnSp2基因的转基因番茄株系通过ABA信号调节与ROS的清除提高了对于盐与干旱的抗性。
[博士论文] 王欣
作物遗传育种 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:基因组选择(genomic selection,GS)在全基因组范围内同时估计出所有标记的效应,进而对表型未知的群体做出合理的预测,为动植物育种提供了新的方法。目前已有的GS方法主要包括:RR-BLUP、GBLUP、BayesA、BayesB、BayesCπ和Bayesian LASSO等。明确以上各种方法的特点和适用条件,具有十分重要的理论价值和现实意义,因此本文开展了对这些GS方法的比较研究。此外传统的GS方法专注于对单一环境下单个性状的预测,忽略了性状之间的遗传相关和不同环境之间的关联。而且它们大多只考虑最简单的加性效应,不能有效估计显性等非加性效应。本研究开发了包含显性效应的多变量(multivariate,MV)GS模型,进行多性状或多环境的联合分析,以实现对目标性状更有效的预测。另外,本研究还开展了基于选择指数的GS方法研究,利用与作物目标性状相关的多个辅助性状进行综合预测,以实现更加全面、可靠的选择。本文的主要研究内容包括以下4个方面:
  1.基因组选择方法比较研究本文将RR-BLUP、GBLUP、BayesA、BayesB、BayesCπ和Bayesian LASSO等6种GS方法用于一组小麦数据集的分析,同时模拟了不同数目QTL和不同遗传率等情况,以比较各种方法的预测精度和预测能力。模拟设置主要包括两种处理:一是设定遗传率为0.5,QTL数目分别设置为20、60、180和540,得到模拟的育种值,并以之考察不同方法的预测表现;二是设定QTL数目为20,遗传率分别设置为0.3、0.5和0.7时,考察各种方法的预测表现。研究表明,在确定GS方法时要充分考虑所研究性状的遗传结构。选择压缩算法对QTL的数目较为敏感,RR-BLUP和GBLUP则具有较强的稳健性。如果确认某种性状由较少的QTL控制时(20个QTL),各种方法预测精度和预测能力的差异较大,应选择BayesCπ和BayesB。如果QTL数目较多(60和180个QTL),各种方法预测精度和预测能力的绝对差异较小,但是仍然发现BayesA和Bayesian LASSO略优于其它方法。如果性状由大量的微效基因决定(540个QTL),各种方法之间差异很小,但综合模拟分析和小麦实际产量的预测结果发现,RR-BLUP和GBLUP方法更适用于这种性状由大量QTL控制的情况。
  2.基于GBLUP模型的NCⅡ设计水稻杂交种表型预测研究本研究使用来一组水稻数据集(NCⅡ设计,以5个不育系为母本,115个品系为父本配制575个杂交组合),表型包括单株产量(GY)、千粒重(TGW)、有效穗数(PN)、株高(PH)、一次枝梗(PB)、二次枝梗(SB)、主穗实粒数(GN)和主穗穗长(PL),标记信息为基因组上329,9150个SNP。利用单变量GBLUP模型(UV-A为只包含加性效应的模型,UV-AD为同时包含加性和显性效应的模型)进行水稻杂交种的表型预测。交叉验证的研究结果表明该杂交水稻群体的各个性状主要由加性效应控制。不过成对比较显示,对于PH、PB、SB和GN等性状,UV-AD的预测能力显著高于UV-A,对于GY、TGW、PN和PL等性状,UV-AD和UV-A的预测能力无显著差异。本研究还对每次交叉验证预测的表型值进行降序排列,选择不同数目的最优top群体,结果表明各性状top群体的平均选择优势与性状的遗传率并无直接联系。对于较低遗传率的性状,适当增加所选top群体的数目,就能获得稳定的较高选择优势。对115个自交系两两之间杂交种的预测结果显示,top100的平均GY预测值为51.78±1.38,高于所预测杂交群体的均值(38.94)。对5个不育系与“3000基因组项目”中3023个品系之间的15115个杂交种的预测结果显示,top100的平均GY预测值为44.43±0.52,高于所预测杂交群体的均值(38.50)。这一研究结果为利用GS方法进行水稻等作物的杂种育种工作提供了新的参考路径。
  3.多变量GBLUP模型研究生物性状间往往具有明显的相关性,多性状联合分析既可利用性状之间的遗传相关又可利用环境相关信息,能够有效提高预测的准确度。本研究利用NCⅡ设计下的水稻数据集,开展了多性状和多环境联合预测的GBLUP模型研究,对只包含加性效应的一般多变量模型进行了扩展,发展了包括加性和显性效应的多变量预测模型MV-AD以及包含加性、显性和共同环境效应的多变量预测模型MV-ADE。另外,利用辅助变量构造的关系矩阵开发了一种新的多变量预测模型MV-ADV。研究结果表明,MV-ADE和MV-ADV的预测能力优于MV-AD和UV-AD。MV-ADV的预测能力略高于MV-ADE,而且成对比较表明这种优势是显著的。在多性状预测中利用与目标性状相关的其它性状,能够提高预测的精度。这一情况特别有利于GY等低遗传率的目标性状,对于TGW等高遗传率的性状,多性状模型的预测效果并无明显改进,此时只需应用单性状模型进行预测即可。多环境联合预测能力虽然优于单环境预测能力,但与多性状联合预测相比,其优势较小,这可能是环境的较大差异弱化了多变量预测所带来的好处。
  4.基于选择指数的基因组选择方法研究选择指数可以利用性状间的遗传相关构建一个综合指标进行多性状的联合选择。本研究使用一组水稻数据集,结合大量的模拟设计,利用与目标性状相关的多个辅助性状建立选择指数,并构造出指数预测能力、指数直接预测精度和预测能力、指数辅助预测精度和预测能力等指标,探讨基于选择指数的基因组选择(GS)新方法。交叉验证结果表明:该方法能够较大程度上利用与目标性状相关的多个辅助性状及其蕴含的目标性状遗传信息,构建选择指数以实现对目标性状的直接或辅助预测。辅助性状与目标性状遗传相关程度越高,指数直接预测精度和预测能力越高,在大多数情况下,指数的直接预测精度无法超越目标性状的GS预测精度,但是可以十分接近这一水平。利用选择指数辅助预测目标性状,能够获得比目标性状GS预测更高的精度,且辅助性状与目标性状的遗传相关程度越高,指数辅助预测精度和预测能力就越高。
[硕士论文] 徐进
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界公认的主要粮食作物之一,它的块茎不仅可以当作粮食作物,而且还可以用于工业生产淀粉等。在植物光合作用产生的碳水化合物,通过韧皮部筛管向储存库器官运输并积累的过程中,起到主要作用的就是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter)。双子叶植物中的蔗糖转运蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三类,主要功能就是对植物光合产物蔗糖的装载、运输和卸载过程的调节作用。在马铃薯中,StSUT1蛋白主要对蔗糖的装载进行调控,StSUT4蛋白主要对蔗糖的卸载过程进行调控,并且还与光周期相互作用来调节马铃薯植株的开花、茎长短和块茎形成,但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根据国内外多年来对高等植物SUT2的研究分析来看,它的结构与葡萄糖信号感受器类似,因此推测SUT2有可能是蔗糖信号感受器而不是蔗糖转运体。
  本研究主要通过构建马铃薯StSUT2基因的干扰载体,并对其转化至马铃薯中,为对StSUT2蛋白进行功能分析奠定了基础。实验主要分为两部分:一是干扰载体的构建,用Gateway克隆技术可将StSUT2基因干扰片段快速重组到表达载体中,通过对重组子进行测序,确定为干扰表达载体;二是马铃薯遗传转化,将构建好的干扰载体通过农杆菌介导法转化至马铃薯块茎中,使其再分化产生含有干扰基因的转基因植株。取得的主要成果如下:
  (1)利用TOPO克隆,将扩增出的干扰片段整合到pENTR中,构建出入门载体命名为pENTR-SUT2。
  (2)根据Gateway克隆技术进行LR重组,根据入门载体与表达载体的attL和attR位点重组,构建出干扰表达载体pSUT2-RNAi。
  (3)用冻融法将干扰载体pSUT2-RNAi转至农杆菌GV3101中。
  (4)将干扰载体转化至夏波蒂(SHB)和陇薯3号(L3)等马铃薯品种的块茎中,通过卡那霉素筛选和PCR扩增检测,初步确定干扰基因已经成功转入马铃薯植株中。用实时荧光定量 PCR对转化株进行相对表达量检测表明,干扰基因已经转入马铃薯植株,并对StSUT2基因表达产生抑制作用。
[硕士论文] 童普国
遗传学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:富含甘氨酸和脯氨酸的蛋白(glycine and proline-rich protein,GPRP)基因广泛分布于植物界中,且已被证实在植物的生长发育和逆境适应过程中扮演着非常重要的角色。然而,目前仅在少数几种植物中对其基因结构特征、表达特性和功能预测等进行了初步报道,水稻中有关这类家族基因的研究鲜有报道。
  本研究克隆了3个候选的水稻OsGPRP基因,结合生物信息学分析手段,对这3个OsGPRP基因的结构特征进行了分析;基于荧光定量PCR等方法对正常和逆境下OsGPRP家族基因在水稻不同组织部位的表达模式进行了分析;利用烟草叶片瞬时表达法对预测的OsGPRP蛋白进行了初步的亚细胞定位分析。此外,还对OsGPRP1和OsGPRP3蛋白进行了原核表达分析;利用pCXUN质粒构建了OsGPRP1和OsGPRP2基因的过量表达载体,以农杆菌介导法转化水稻,获得了转基因T2代植株。为进一步研究水稻OsGPRP家族基因的生物学功能奠定了基础。主要研究结果如下:
  1.水稻OsGPRP家族基因结构特征分析
  借助生物信息学分析手段,成功筛选并克隆了3个水稻OsGPRP家族基因;3个水稻OsGPRP基因含有2-3个外显子和1-2个内含子,编码170-197个氨基酸,蛋白大小为16.8-19.7kDa,等电点为7.53-9.82;启动子中含有多种逆境响应元件;蛋白序列结构特征分析表明,3个OsGPRP含有典型的植物GPRP蛋白保守结构域(N端XYPP重复序列、中部富含A的疏水区和C端HGK重复区),符合植物GPRP蛋白家族的结构特征。系统进化树分析结果显示,OsGPRP1和OsGPRP3属于同一分枝,OsGPRP2属于另一分枝。
  2.正常和逆境下OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式
  荧光定量PCR结果显示,正常情况下3个OsGPRP基因在水稻幼苗的根、茎、叶和抽穗期的幼穗中存在差异表达,均在叶中表达量最高;在低温、干旱和高盐逆境下,3个OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式存在明显差异,OsGPRP2和OsGPRP3在根和茎中均显著上调表达,OsGPRP1和OsGPRP2在叶中下调表达;在干旱胁迫下,OsGPRP1基因在水稻根中显著上调表达;在盐胁迫下,OsGPRP3在叶中显著上调表达。
  3.水稻OsGPRP蛋白亚细胞定位分析
  分别成功构建了3个OsGPRP家族蛋白与GFP蛋白融合表达载体,利用农杆菌介导法进行了烟草叶片瞬时表达,荧光显微镜观察结果显示,OsGPRP1和OsGPRP3蛋白可能在细胞核、细胞膜和各种细胞器膜中均有表达,而OsGPRP2蛋白可能主要在细胞核中表达。
  4.OsGPRP1和OsGPRP3蛋白的原核表达
  成功构建了水稻OsGPRP1和OsGPRP3蛋白的原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功诱导表达了OsGPRP1和OsGPRP3蛋白;为探究水稻OsGPRP蛋白的性质与功能奠定了基础。
  5.OsGPRP1和OsGPRP2过量表达转基因T2代水稻植株的获得
  利用pCXUN质粒成功构建了水稻OsGPRP1和OsGPRP2基因过量表达载体,采用农杆菌介导法成功转化粳稻中花11,目前已获得了OsGPRP1和OsGPRP2过量表达转基因水稻T2代纯合植株各1个株系,为深入研究这2个基因的生物学功能奠定了基础。
[博士论文] 王永
昆虫与害虫防治 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:目前,我国的转基因农作物检测技术研究还停留在以PCR技术为核心的核酸序列检测阶段,而生物安全评价技术研究处于田间试验和室内动物试验阶段,缺乏行之有效的转基因作物精准检测和生物安全评价方法用于指导生产实践。本研究以目前我国主要进口作为加工原料的转基因玉米、大豆以及我国自主研发的尚未商业化种植的抗虫转基因水稻为研究材料,分别在基因组、转录组以及代谢组水平,利用核酸等温扩增技术、焦磷酸测序技术、miRNA分析技术以及代谢指纹分析技术,开展转基因农作物可视化快速检测技术,高通量筛查技术以及生物安全评价技术。主要研究结果如下:
  1.建立和完善了转基因抗虫水稻TT51-1可视化等温扩增快速检测技术
  以Bt基因特异性核酸序列为目标,设计等温扩增反应引物,并对反应体系、反应程序、产物分析方式、特异性和灵敏度等进行优化和确定,结果表明本研究建立的方法特异性与PCR检测方法一致,方法灵敏度是PCR检测方法的10倍,检测效率较常规技术提高了75-90%。
  2.建立了Bt基因原核表达体系,获得了原核表达蛋白抗体
  本研究成功从转基因水稻中克隆全长Bt基因至pGEM-T载体,测序验证后利用HindⅢ与BamHI双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体,转化重组构建的pET-28a-cry至BL21宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下成功表达并纯化回收分子量约71kD的目的蛋白。使用纯化Bt蛋白免疫动物制备抗体,试验验证抗体效价>1/300。
  3.开发出转基因农作物精准Special-base焦磷酸测序检测技术
  本研究首次创建Special-base焦磷酸测序检测方法,用于精准鉴定转基因作物NOS/plasmid构建特异性以及crylAb目标基因特异性,该方法有望成为转基因检测和鉴定的黄金标准。本研究以转基因作物中常见的NOS/plasmid构建和crylAb基因为靶标,以转基因大豆GTS-40-3-2、转基因玉米GA21、NK603、Bt11、Bt176和MON810等转基因作物为试验材料,针对NOS/plasmid构建特异性和crylAb基因特异性序列设计引物,经复合PCR扩增及焦磷酸测序,建立Special-base焦磷酸测序模型,该技术提高了转基因作物检测的精准性、检测通量和自动化程度。
  4.建立了转基因抗虫水稻与其非转基因受体在代谢产物上差异性分析方法
  优化了水稻代谢物提取方法,建立了完整的水稻样本制备方法和仪器的数据采集方法。试验最终得到优化的样本预处理方法,水稻样本经液氮冷冻粉碎后称取100mg于2mL的离心管中,加入提取溶剂(甲醇:水=80∶20)1mL,涡旋使其混匀,放入高速冷冻离心机中,16000g(4。C)离心15min,取400μL上清液,即得。试验结果表明,主要差异表现在幼苗期“+”模式下共鉴定到4个化合物,分别为MDB32906、HMDB02060、HMDB35482和HMDB32784,“一”模式下,4.73491.1927m/z化合物;分蘖期“+”模式下差异最大的化合物是HMDB38469,“一”模式下,差异最大的化合物是1.10_579.137m/z,但是转基因水稻与其非转基因受体之间未发现非预期代谢途径。
  5.建立了转基因大豆及其非转基因亲本品系的干种子中的miRNA成分进行差异分析方法
  利用高通量测序平台对转基因大豆及其非转基因亲本品系的干种子中的miRNA成分进行差异分析。试验结果证实,多个保守的gma-miRNA在不同大豆品系间存在成分差异,包括转基因与非转基因之间,也包括非转基因与非转基因之间。与A3244相比,转基因大豆MON89788中的10个保守miRNA全部下调表达,包括miR1507、miR1510、miR166、miR319、miR390、miR396和miR482家族成员,其中下调幅度最大的是gma-miR166a-3p和gma-miR166h-3p。miR166的功能是通过调控Homeodomainleucine zipper(HD-ZIP)基因从而影响苗期发育。在转基因大豆DP-3(O)5423×GTS40-3-2与非转基因大豆Jack之间存在3个保守gma-miRNA差异表达,其中miR482c-3p下调表达,miR398c和miR1511上调表达。值得注意的是在两个非转基因大豆之间共发现了13个差异表达的保守gma-miRNA,这些gma-miRNA的ID不同,变化趋势也不一样。这些结果说明,不同大豆品种之间确实存在miRNA成分差异,但这种差异很可能是与亲缘关系远近直接相关的。
[硕士论文] 吴婷婷
自然地理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:湿地土壤种子库是湿地植被自然更新与演替的种质资源,是湿地植被生态恢复的物质基础。土壤种子库的规模及其物种组成、多样性与丰富度特征等可用来评估湿地植被的恢复潜力,其储量与受损后相应生态系统的恢复速度成正比。本文以图们江下游不同类型湿地土壤种子库为研究对象,通过选取图们江下游四个类型湿地的七块标准样地,采用标准样地调查与取样,野外植被调查与室内种子库不同水分条件萌发控制试验相结合的手段,探究图们江下游不同类型湿地土壤种子库特征及其在湿地植被生态恢复过程中的应用潜力。
  主要研究结果如下:
  (1)图们江下游湿地各样地土壤种子库中优势物种地位突出,储量丰富,具有进行湿地植被生态恢复的种质资源潜力,土壤种子库的储量在垂直方向上基本呈现随深度增加而下降的趋势。本试验共出现物种60种,计植物幼苗数14723株,其中湿润处理条件下出现物种数46种显著高于沉水/淹水处理33种,但从萌发植物幼苗数量上看,沉水/淹水处理条件下种子库萌发数量占土壤种子库总数的60%,表明水文恢复在图们江下游湿地植被恢复过程中具有重要意义。
  (2)图们江下游湿地各样地地上植被群落物种组成较丰富,地上植被群落调查过程中共计出现植物79种,隶属28科58属,优势物种以禾本科、莎草科、菊科、蓼科类植物为主。各湿地样地地上植被群落单位面积内植被数量差异明显,湖泊型湿地地上植被密度最大,约1458株/m2。从植被群落的物种重要值来看,除沼泽型湿地与自然湖泊型湿地仍以以湿生植被:蔗草、密穗莎草、通泉草、雨久花为优势种外,其余湿地样地地上植被群落优势种都已趋向旱化,问荆、稗草等杂草类植物优势突出。
  (3)图们江下游湿地各样地土壤种子库中出现的植物科与地上植被群落调查时出现的植物科相似性系数达到80.77%。但各样地间物种相似性系数均较低,在7.14%-42.86%之间,表明地表植被与种子迁移过程受外界生境因子影响较明显,不同湿地类型植被恢复潜力存在差异,从数据分析结果来看,同等情况下图们江下游地区湖泊型湿地植被的恢复潜力较其它样地大。
  (4)图们江下游湿地各样地土壤种子库特征与地上植被群落物种组成结构特征在时间尺度上均存在差异,主要表现为:植被的物种数量增加,多年生物种比例与湿生植被物种比例均降低。从物种生物多样性指数来看,受人为干扰较小的沼泽型湿地生态系统土壤种子库与地上植被群落稳定性较好。
  (5)针对不同湿地类型的植被群落结构特征,在湿地植被生态恢复过程中应选取适合的修复技术,如:自然恢复法更适用于干扰程度在一定阈值内的区域;表层沉积物去除法,适用于受到强烈人为干扰的区域,但可能需要重播种;种子库移植法对主要依靠无性繁殖的物种恢复效果较好,但大面积施用存在困难。
[硕士论文] 杨雪
园林植物与观赏园艺 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:草本植物野菊的药物应用价值已具有几百年的历史记载,含消炎、抗氧化及免疫调节等成分。野菊花黄色,抗逆性强,易于繁殖,在园林中具有较高的应用价值。基因工程研究对改良观赏植物野菊的观赏及品质性状,培育优良的野菊新品种具有十分重要的意义。MYB转录因子对植物的生物进程起重要的调控作用,本研究欲探究野菊MYB转录因子在其生长发育进程中的作用,通过转基因方法使ChiMYB在烟草中过量表达,来研究ChiMYB基因的调控潜能。本研究以野菊(Chrysanthemum indicum)为实验材料,利用本实验室前期已获得的特异性引物克隆野菊MYB基因,并对其进行生物信息学分析;构建过表达植物载体,转化烟草;测定转ChiMYB基因烟草的表型和光合特性,初步探究了ChiMYB基因能够抑制光合通路上光合酶及光合色素基因表达,使相关酶及色素合成受阻,导致净光合速率下降,即ChiMYB基因具有转录抑制因子的功能。以期更好的发挥野菊的多途径利用价值及改善野菊品质,同时也为野菊分子育种奠定基础。研究结果如下:
  1.以野菊实生苗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到一个MYB类转录因子基因,将其命名为ChiMYB,利用生物信息学方法对ChiMYB基因编码的氨基酸序列进行分析,结果表明:MYB基因全长为1194bp,ORF为948bp,编码315个氨基酸;该基因所编码氨基酸序列属于SANT超家族,含SANT结构域,行使DNA结合结构域的功能,且分析结果显示ChiMYB基因可能具有转录抑制因子的功能;系统进化树分析显示,野菊的ChiMYB与菊花和神农香菊的MYB同源性较高,次之是与菊科菜蓟的同源域蛋白同源性较高。
  2.在已获得野菊ChiMYB基因全长的基础上,构建克隆载体;利用双元表达载体pBI-121上的XbaI和SpeI两个酶切位点,双酶切构建pBI121-MYB植物表达载体;利用电转化法成功将pBI121-MYB重组质粒和pBI121空载体质粒导入农杆菌EHA105中;农杆菌介导法将ChiMYB基因和pBI121转入烟草植株体内,通过抗性筛选和抗性植株DNA的PCR检测,证明已成功过获得多个转ChiMYB基因和转pBI121空载体的阳性株系,共选出3个转ChiMYB基因株系和1个转pBI121株系。
  3.对转ChiMYB基因烟草与对照WT、EV进行外观及光合特性测定,初步探究ChiMYB基因功能。研究结果发现,转ChiMYB基因烟草与对照WT、EV相比,在表型及光合特性上有一系列变化:转ChiMYB基因烟草三个株系L1、L2、L3与WT、EV比较,叶片黄化,且叶面积显著下降,茎发生了横向弯曲,且萌蘖出侧芽;转基因烟草三个株系L1、L2、L3较WT、EV的最大净光合速率、气孔导度、蒸腾速率及表观量子效率显著下降;绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量下降显著,其平均值分别仅为WT和 EV的53.8%、46.5%、52.1%、49.1%和47.6%、46.1%、47.2%、48.5%,叶绿素a/b差异不显著;叶绿素荧光参数中只有非光化学猝灭系数显著下降,其平均值较WT和EV分别降低了23.8%和23.3%,光化学猝灭系数下降但差异不显著,初始荧光、最大荧光、PSII最大光化学效率,PSII实际光化学效率与WT和EV没有显著差异。
[硕士论文] 周元委
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素E,包括生育酚和生育三烯酚,是一种重要的脂溶性有机物,它具有很强的抗氧化性,在动植生命中有着不可替代的重要地位。人类对维生素E的需求量巨大,但其中90%左右靠人工合成。天然维生素E主要来源于植物叶片和油料作物种子,人工合成的维生素E在生物活性上与天然维生素E相差甚远。因此提高绿色植物特别是油料作物种子中维生素E的含量就显得尤为重要。
  油菜是世界上最重要的油料作物之一,油菜种子宫含维生素E且种植面积大,因此油菜维生素E育种日渐成为研究的热点之一,越来越受到育种工作者的关注。GWAS分析表明,油菜BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量有着很强的效应。因此猜测油菜种子中生育酚合成的“瓶颈”在于叶绿素合成酶对生育酚合成的前体物质PDP进行“回收”,重新合成叶绿素,导致PDP浓度过低。想要打破这一“瓶颈”,就有必要研究叶绿素合成酶(Chlorophyll synthetase,CHLSYN)与生育酚合成之间的关系。本研究借助拟南芥这一载体研究种子中CHLSYN的表达量与种子中生育酚合成之间的关系,主要研究结果如下:
  1.不同甘蓝型油菜的BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量的效应不同,据此将这些材料分为两组,H组和L组(分别对应BnA9CHLSYN位点对种子中生育酚含量呈正向效应和负向效应),H组材料种子中BnA9CHLSYN的表达水平低于L组材料种子中该基因的表达水平,生育酚含量相反。
  2.野生型背景下,采用特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的表达之后,种子中生育酚含量提高,最多可提高33.69%,种子特异性超表达CHLSYN,最多可使拟南芥种子中生育酚含量降低44.73%,即拟南芥种子中CHLSYN的表达水平与生育酚含量呈负相关关系。拟南芥vte5纯合突变体背景下也得到相同的结论。
  3.采用相同种子特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的同时超表达AtHPT,种子中生育酚含量最多能提高125.38%,而在种子中特异性超表达AtHPT最多可使生育酚含量提高123.56%,两者未达到显著差异。
  4.更换超表达AtHPT的启动子,采用不同种子特异性启动子干扰拟南芥种子中CHLSYN的同时超表达AtHPT,种子中生育酚含量最多能提高161.71%,而使用新的启动子超表达AtHPT之后,最多只能使生育酚含量提高95.99%。
[硕士论文] 肖敏
农业推广 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:蝴蝶兰(Phalaenopsis),属多年生草本植物,其独特的花形和艳丽的色彩引起了全世界花卉爱好者们的关注,素有“洋兰王后”的美称。广东省农业科学院环境园艺研究所于2007年3月以来对优良亲本‘聚宝红玫瑰’(简称JB,下同)和‘红龙’(HL)进行杂交,从杂交后代中选育了多个优良品系,其中7个品种‘富韵’(A8)、‘初阳’(A46)、‘滴彩’(DC)、‘福美’(FM)、‘翔凤’(XF)、‘宫粉’(GF)、‘莞蝶2号’(GD)通过了广东省农作物品种审定,另外3个优良株系‘深红B-305’(B3)、‘深红中小A’(A0)、‘PhcA-295’(PH)也形态各异,各具特色。本研究采用形态特征分析和SRAP分子标记,调查分析了这10个子代与其亲本的形态特征,并对其之间的遗传多样性差异进行了研究,为蝴蝶兰遗传育种与品种区分提供理论依据。主要研究结果如下:
  1、对蝴蝶兰植物学形态特征的主成分分析及农艺性状评价结果表明,可将12份供试品种或株系分为3类,第1类是与杂交后代在形态特征上差异较大的亲本HL;第2类是在主要性状上遗传了父母本优势性状并较优于父母本的杂交后代XF;第3类是亲本JB以及介于父母本性状之间且总体与JB更为相似的杂交后代B3、A8、A46、A0、DC、PH、FM、GD、GF,这与根据欧式距离进行的系统聚类结果基本吻合。杂交后代的表现型有优于、相似于或不同于父母本的表现,选择品种间不同的优良性状进行杂交是杂交选配亲本的重要依据,有利于蝴蝶兰多样性的创造和利用。
  2、改良DNA提取方法及模板材料选择。对原来的DNA提取方法进行改良实验比较,并使用改良后的DNA提取方法分别提取蝴蝶兰A8和A46的嫩根、嫩叶和花的DNA,检测结果显示:嫩根比叶和花的条带更明亮清晰,可能是由于叶和花的色素含量高,纤维较多,不易研磨充分。色素含量高和研磨不充分都会影响到提取的DNA质量,因此将嫩根作为提取DNA的最佳材料。
  3、蝴蝶兰SRAP-PCR反应体系的优化。针对PCR反应体系中关键的6个因素,设计多因素正交实验,挑选最优的PCR buffer、Mg2+、模板DNA、Tap聚合酶、dNTP和引物的浓度组合。最后得到蝴蝶兰SRAP-PCR反应最佳体系是:即25μL反应体系为:10×buffer2.5μL,MgCl22μL(2mmol/L),dNTP2μL(0.2mmol/L),正反向引物各5.625μL(0.45μmol/L),DNA模板45ng(20ng/μL),Taq酶0.2μL(5U/μL),ddH2O4.8μL。
  4、对12份蝴蝶兰进行SRAP分析,从1,254个引物组合中筛选出带型稳定、多态性较好的24对引物,共扩增出172条谱带,单个引物扩增最多10条,最少4条,每个引物平均扩增7.17条,其中多态性条带100条,多态性比率58.14%。基于24个引物对12份蝴蝶兰的SRAP标记扩增结果,利用NTSYS.2.10e软件计算出所有供试材料间的遗传相似系数GS,并进行UPGMA聚类。在遗传距离0.778处,可将12份蝴蝶兰分成4类,第1类是亲本HL;第2类是杂交后代A0;第3类是杂交后代XF和A46;第4类包含两个亚组,一组是杂交后代A8和DC,另一组是亲本JB与杂交后代GF、FM、B3、GD、PH。这与形态特征聚类分析的结果吻合度较高,表明分子水平上的遗传多样性与形态特征差异之间存在相关性,但可能由于环境因素的影响,分子水平上的遗传多样性与形态特征差异不完全一致。
[硕士论文] 杨姗
作物学;作物栽培学与耕作学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:玉米是我国主要粮食作物,其保障粮食安全的地位毋庸置疑。由于不合理灌溉的影响,加之施肥及环境恶化等因素的干扰,耕地盐碱化给农业生产造成的损失仅次于干旱,并成为当前影响玉米生产的主要因素之一。玉米是中度感盐植物,尤其在幼苗生长时期受伤害表现最为明显。其耐盐碱性是一个受微效多基因控制的数量性状,仅利用常规育种技术改良品种有很大难度。随着分子生物学的快速发展,各类作物遗传连锁图谱的构建及相关的分子遗传学研究为改良作物耐盐碱性提供了新的机遇。结合精准表型鉴定的QTL定位及功能标记的开发可以更准确地检测和跟踪优势等位基因,极大地推动标记辅助选择在育种实践中的作用,加快育种实践的效率。本研究以(郑58×昌7-2)F2为构图群体,以SSR标记构建遗传连锁图谱。通过发芽率、相对电导率、脯氨酸含量、单株重量及苗情等5个性状对F2∶3群体及其双亲进行苗期耐盐碱性评价。使用Windows QTL Cartographer V2.5软件,采用复合区间作图法(CIM)对五个性状进行QTL定位。最后,基于本实验室耐盐QTL定位结果,结合20份自交系的耐盐性表型鉴定结果,筛选出用于鉴定的有效标记。
  本研究主要内容包括:⑴以郑58/昌7-2构建的142个玉米F2∶3家系为试材,分别用200 mmol/L NaCl溶液和100 mmol/L Na2CO3溶液进行胁迫处理,测定发芽率、相对电导率、pro含量、单株重量和苗情5个性状,并进行性状间相关性分析。结果表明:盐处理条件下,耐盐率除与发芽率不相关外,与其他性状均呈极显著相关,耐盐率与相对电导率及pro含量呈正相关,与单株重量呈负相关,pro含量与相对电导率呈显著正相关;碱处理条件下,除相对电导率与其它性状不相关外,其它性状两两相关。⑵分析F2群体142个株系的276个SSR位点的差异性,采用JoinMap4.0构建了一张拟合233个SSR位点,覆盖玉米全基因组10个连锁群的SSR标记遗传图谱,遗传图谱全长共4507.798 cM,标记间平均间距19.35 cM。⑶采用复合区间作图法在盐胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关3个、与相对电导率相关1个、与Pro含量相关3个、与耐盐率相关1个;碱胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关2个、与相对电导率相关1个、与单株重量相关4个、与Pro含量相关1个、与耐碱率相关1个。⑷通过主成分分析法(PAC)对69份玉米自交系进行耐盐性分析,并从中选取耐盐和盐敏感材料各10份。基于本研究耐盐QTL定位结果,选用已构建连锁图谱中第五条染色体上的全部引物作为筛选标记,结合20份耐盐性已知的玉米自交系,通过对24个SSR位点各等位变异耐盐等级的方差分析,检测到4个用于耐盐筛选的有效SSR标记(umc1416、umc1349、umc2295和umc1686)。
[硕士论文] 殷香丽
作物遗传育种 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:酸性土壤上铝毒害是限制大豆生长和产量的重要因素之一。南方野生大豆比栽培大豆具有更广泛的遗传多样性,对酸铝胁迫具有较强的适应性,其中有多种基因参与大豆对酸铝胁迫的应答。本研究利用野生大豆耐酸铝基因表达谱,克隆到酸铝诱导表达上调的GsMYB7基因进行组织表达模式分析、生化特性分析和耐酸铝功能验证。主要研究结果分述如下:
  GsMYB7基因全长编码序列2179bp,编码区(coding DNA sequence,CDS)序列长度为1002bp,编码333个氨基酸。在GsMYB7起始密码子上游1500bp的核苷酸序列区间含有与光、乙烯、生长素、热、逆境响应等相关的应答元件,如AE-box、ERE、TGA、HSE、TC-rich重复序列等。蛋白质结构预测表明,GsMYB7蛋白具有R2R3 MYB转录因子的典型特征,含有2个保守的结构域,分别位于10-60和70-120的位置。系统进化分析显示,GsMYB7与拟南芥(Arabidopsis thalianaColumbia)中的R2R3 MYB类蛋白亲缘关系较近。
  将GsMYB7基因编码序列插入到pYL322-d1载体GFP序列的下游,利用拟南芥原生质体进行亚细胞定位。结果显示,GsMYB7蛋白定位在细胞核中。将GsMYB7基因序列插入到pGBKT7载体的限制性内切酶NcoI和BamHI之间,并转化酵母。实验结果表明,GsMYB7蛋白具有转录激活活性。
  设置0、15、30、50、75、100μM(pH4.5)AlCl3溶液浓度梯度,处理野生大豆BW69株系的幼苗,定量RT-PCR的结果表明,GsMYB7基因在根中上调表达,在AlCl3溶液为75μM时GsMYB7基因的相对表达量达到最高。
  将含有35S-GsMYB7-NOS的DNA序列插入到pZY101多克隆位点限制性内切酶HindIII位点处,以华春6号为受体材料并采用农杆菌介导大豆子叶节法进行大豆遗传转化,获得GsMYB7基因转化体,经加代繁殖、分子鉴定后获得7个过表达转基因株系。采用华春6号、GsMYB7转基因T4代过表达株系进行酸铝胁迫处理,测定结果表明,GsMYB7转基因株系的相对根伸长、相对总根长、相对根系总表面积、相对根体积,均显著大于野生型。在30μMAlCl3处理下,GsMYB7基因在转基因株系中较野生型表达量高,最高可达到2倍左右。
[硕士论文] 王茂辉
作物遗传育种 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻斑点叶突变体是一类特殊的遗传材料,对探究水稻细胞程序性死亡、过敏性反应及抗病调控机理等具有重要意义。水稻斑点叶突变体Spl34(Spotted leaf34)是从两个正常绿叶材料粤晶丝苗2号和H4的F2群体中获得的自然突变体。前人已对突变体Spl34进行了遗传分析和基因初步定位,表明Sp l34斑点叶表型受一个显性基因Spl34(t)调控,利用F2(02428/Spl34)群体将其初步定位于第11号染色体19.84-22.48Mb区间。在此基础上,本研究进一步对突变体Spl34的农艺性状和理化指标进行鉴定,并利用SSR/InDel标记及高通量测序对斑点叶基因进行精细定位,同时对定位区间的序列进行比较研究。所取得的主要结果如下:
  1、突变体Spl34主要农艺及品质性状未受到斑点性状的不利影响。以F8代Spl34单株分离的无斑点植株为对照(CK),田间表型调查发现Spl34与CK相比未出现早衰现象,两者农艺性状没有明显差异。稻米品质分析发现,突变体Spl34和CK的整精米率在0.01水平上差异显著,其他指标没有显著差异。种子活力鉴定表明,突变体Spl34与CK的发芽率、发芽势出现差异。
  2、突变体Spl34斑点的出现对生理生化指标的影响。紫外光照射试验表明,Sp l34的斑点可能是由紫外光诱导产生的某种未知色素积累引起。开花期Spl34的SPAD值和可溶性蛋白均低于对照,并且下降速度较快。田间光合作用测定结果表明,开花期突变体Spl34的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均低于对照,表明突变体Spl34植株斑点的出现可能影响到了水稻叶片的光合作用。NBT和DAB的染色试验结果显示,突变体Spl34叶片染色后斑点部位仍然是褐色,因此推测Spl34比对照有更强的抗氧化能力。
  3、突变体Spl34斑点叶性状受单显性基因控制,利用SSR/InDel标记将该基因精细定位于第11染色体46.99kb范围内。前期研究所用的F2(02428/Spl34)群体较小,而且部分晚熟单株的斑点叶表型不够明显,无法满足精细定位Spl34(t)的需求。因此,本研究利用粳稻Franc is和Sp l34杂交构建了F2基因定位群体,用于斑点叶基因的精细定位研究。遗传分析表明,F2(Franc is/Sp l34)群体有无斑点植株的比例符合3:1的分离比,进一步确认Spl34的斑点叶表型受单个显性基因Spl34(t)调控。以日本晴基因组为参考序列,利用SSR/InDel标记对无斑点叶隐性单株进行连锁分析,将Spl34(t)精细定位于第11号染色体23.483-23.530Mb之间,定位区间长度为46.99kb,包含8 个已注释基因。以该区间内日本晴8个基因的序列为参考设计引物进行扩增,Sp l34和对照均无法获得扩增产物,而日本晴和Francis均能够获得特异产物。因此,推测定位区间内Sp l34和日本晴的序列存在很大差异,无法以日本晴序列为参考筛选出Spl34(t)的候选基因。
  4、利用BSA-seq与单分子测序对突变体基因组从头组装,进一步缩小定位区间至40kb。利用Illumina高通量测序技术,对F2(Francis/Spl34)的有斑点个体混合池、无斑点个体混合池以及双亲进行重测序。利用基因组SNP对有斑点和无斑点混合池进行关联分析,将Spl34(t)定位于第11染色体23,223,221bp至23,791,314bp之间,区间大小约568kb。进一步利用单分子测序技术对Spl34突变体进行测序,通过从头组装产生4290个大于10kb的重叠群,平均长度61.97kb,累加总长度达到265.86Mb。以此为参考,对混合池进行BSA关联分析,在两个重叠群tig00001409和tig00003011检测到紧密连锁。进一步将两个重叠群的局部序列在日本晴基因组上进行Blast,发现两个重叠群分别与日本晴chr11:23.46-23.51Mb两侧序列高度一致。通过对两个重叠群之间序列进行Sanger测序填补gap,产生的新重叠群长度达到233.95kb,其中Spl34(t)定位区间大小约为40kb。定位区间内,Spl34突变体与对照的扩增产物,存在明显的片段长度差异。
  在前人研究基础上,本研究进一步明确了斑点叶突变体Spl34的表型及生化指标,同时利用基于高通量测序的基因定位方法将斑点叶基因Spl34(t)精细定位于第11染色体约40kb的区间,为该基因的进一步功能研究奠定了良好基础。
[硕士论文] 梁庆钊
作物 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:果皮柔嫩度不仅是甜玉米籽粒抵抗咀嚼破碎的程度,还是影响甜玉米品质、口感的一个重要因素并与果皮厚度显著负相关。近年,随着甜玉米逐渐受到大众关注,相应的甜玉米产业也相继兴起。甜玉米的普及使得人们对果皮厚度的结构与功能了解越来越透彻,但关于该性状的基因定位、效应值估计等的报道较少。人们对甜玉米消费需求日益增长,这促使了农民需要更高产的甜玉米品种。粒重是构成甜玉米产量的重要因素,也是甜玉米高产育种的关键。深入研究甜玉米粒重、果皮厚度的遗传机理,对挖掘甜玉米的遗传潜力和提高育种效率具有重大意义。本实验以华南农业大学甜玉米课题组选育的甜玉米自交系M06和M01为亲本,考察其果皮厚度和百粒重,并以此群体来定位甜玉米果皮厚度和粒重的基因位点,为进一步开展甜玉米的品质与产量育种提供依据。本研究结果如下:
  1.比较测量甜玉米果皮厚度的两种方法,千分尺法操作简单能够大规模进行;改良冰冻切片法虽然步骤较繁琐,但是较石蜡切片法要简单,且真实反映籽粒实际的果皮厚度,更能反映甜玉米籽粒背胚侧果皮的真实发育情况。
  2.构建得到包含51个SSR标记位点的遗传连锁图谱,覆盖10条连锁群,图谱总长1813.7cM,10条染色体上的标记的平均间距在26.8~51.5cM。
  3.对果皮厚度进行基因定位,以千分尺法检测籽粒背胚侧果皮厚度,共检测2个QTL位点,均在第7染色体,分别解释表型变异14.21%和7.33%,;以冰冻切片法检测籽粒背胚侧果皮厚度为表型,共检测到3个QTL位点,分别在第5、6、7染色体,分别解释表型变异40.75%、33.78%、8.60%。
  4.对百粒重进行基因定位,以鲜籽粒百粒重为表型,共检测到5个QTL位点,第6、7染色体各2个,第9染色体1个,分别解释表型变异6.39%、18.31%、17.16%、12.74%、5.40%;以干籽粒百粒重为表型,共检测到3个QTL位点,第6染色体1个,第7染色体2个,分别解释表型变异7.06%、6.10%、14.47%。
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