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[博士论文] 雷娜
园艺学(蔬菜学) 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱胁迫与高盐胁迫是全球范围内严重影响农作物产量的两种主要非生物胁迫。对于生长调节而言,盐和干旱胁迫包括离子信号通路和渗透平衡信号通路。传统的育种方法耗时耗力,并且对于提高作物对高盐和干旱的耐力效率极低。为了探究非生物胁迫的抗性机理,前人从形态学、生理学、生物化学以及之后的分子水平等方面进行了大量的研究。目前,番茄已成为茄科的一种经济蔬菜作物,并作为双子叶植物基因研究的模式植物。属于一个多基因家族的膜联蛋白在植物胁迫反应和多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。在本研究中,我们从具有抗旱性的野生番茄潘那利(Solanum pennelli)克隆了AnnSp2,并在栽培种中对其进行了功能研究。主要研究成果如下:
  1、对AnnSp2进行克隆和测序,结果表明AnnSp2编码一个有316个氨基酸组成的膜联蛋白。
  2、通过实时定量PCR对AnnSp2表达谱分析,结果表明AnnSp2在叶片和花中大量表达,AnnSp2蛋白主要定位于细胞核。AnnSp2能够被植物激素以及非生物胁迫强烈诱导,如失水,高盐以及脱落酸。
  3、通过农杆菌介导的遗传转化,获得了16个AnnSp2过表达的转基因株系。
  4、对3个AnnSp2过表达株系进行了非生物胁迫的抗性鉴定。通过对发芽率、根系发育状况、存活率、叶片失水率和叶绿素含量等生理学指标的测定,结果表明过表达AnnSp2能增强番茄对干旱及盐胁迫的抗性。
  5、AnnSp2转基因植株在种子萌发期和幼苗期对脱落酸不敏感,这一现象揭示了转基因植株对胁迫抗性有所增强。
  6、此外,ROS的清除,叶绿素总含量的提高,脂质过氧化水平的降低,过氧化酶活性的增强(包括APX,CAT和SOD)以及脯氨酸含量的升高—这些现象均在AnnSp2超表达植株中被观察到,这和那些与胁迫相关的基因的在转录水平的变化联系紧密。
  7、通过与胁迫相关的基因表达量的变化而得到的关于发芽和幼苗实验的结果显示,超量表达AnnSp2基因的转基因番茄株系通过ABA信号调节与ROS的清除提高了对于盐与干旱的抗性。
[硕士论文] 徐进
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界公认的主要粮食作物之一,它的块茎不仅可以当作粮食作物,而且还可以用于工业生产淀粉等。在植物光合作用产生的碳水化合物,通过韧皮部筛管向储存库器官运输并积累的过程中,起到主要作用的就是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter)。双子叶植物中的蔗糖转运蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三类,主要功能就是对植物光合产物蔗糖的装载、运输和卸载过程的调节作用。在马铃薯中,StSUT1蛋白主要对蔗糖的装载进行调控,StSUT4蛋白主要对蔗糖的卸载过程进行调控,并且还与光周期相互作用来调节马铃薯植株的开花、茎长短和块茎形成,但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根据国内外多年来对高等植物SUT2的研究分析来看,它的结构与葡萄糖信号感受器类似,因此推测SUT2有可能是蔗糖信号感受器而不是蔗糖转运体。
  本研究主要通过构建马铃薯StSUT2基因的干扰载体,并对其转化至马铃薯中,为对StSUT2蛋白进行功能分析奠定了基础。实验主要分为两部分:一是干扰载体的构建,用Gateway克隆技术可将StSUT2基因干扰片段快速重组到表达载体中,通过对重组子进行测序,确定为干扰表达载体;二是马铃薯遗传转化,将构建好的干扰载体通过农杆菌介导法转化至马铃薯块茎中,使其再分化产生含有干扰基因的转基因植株。取得的主要成果如下:
  (1)利用TOPO克隆,将扩增出的干扰片段整合到pENTR中,构建出入门载体命名为pENTR-SUT2。
  (2)根据Gateway克隆技术进行LR重组,根据入门载体与表达载体的attL和attR位点重组,构建出干扰表达载体pSUT2-RNAi。
  (3)用冻融法将干扰载体pSUT2-RNAi转至农杆菌GV3101中。
  (4)将干扰载体转化至夏波蒂(SHB)和陇薯3号(L3)等马铃薯品种的块茎中,通过卡那霉素筛选和PCR扩增检测,初步确定干扰基因已经成功转入马铃薯植株中。用实时荧光定量 PCR对转化株进行相对表达量检测表明,干扰基因已经转入马铃薯植株,并对StSUT2基因表达产生抑制作用。
[硕士论文] 吴婷婷
自然地理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:湿地土壤种子库是湿地植被自然更新与演替的种质资源,是湿地植被生态恢复的物质基础。土壤种子库的规模及其物种组成、多样性与丰富度特征等可用来评估湿地植被的恢复潜力,其储量与受损后相应生态系统的恢复速度成正比。本文以图们江下游不同类型湿地土壤种子库为研究对象,通过选取图们江下游四个类型湿地的七块标准样地,采用标准样地调查与取样,野外植被调查与室内种子库不同水分条件萌发控制试验相结合的手段,探究图们江下游不同类型湿地土壤种子库特征及其在湿地植被生态恢复过程中的应用潜力。
  主要研究结果如下:
  (1)图们江下游湿地各样地土壤种子库中优势物种地位突出,储量丰富,具有进行湿地植被生态恢复的种质资源潜力,土壤种子库的储量在垂直方向上基本呈现随深度增加而下降的趋势。本试验共出现物种60种,计植物幼苗数14723株,其中湿润处理条件下出现物种数46种显著高于沉水/淹水处理33种,但从萌发植物幼苗数量上看,沉水/淹水处理条件下种子库萌发数量占土壤种子库总数的60%,表明水文恢复在图们江下游湿地植被恢复过程中具有重要意义。
  (2)图们江下游湿地各样地地上植被群落物种组成较丰富,地上植被群落调查过程中共计出现植物79种,隶属28科58属,优势物种以禾本科、莎草科、菊科、蓼科类植物为主。各湿地样地地上植被群落单位面积内植被数量差异明显,湖泊型湿地地上植被密度最大,约1458株/m2。从植被群落的物种重要值来看,除沼泽型湿地与自然湖泊型湿地仍以以湿生植被:蔗草、密穗莎草、通泉草、雨久花为优势种外,其余湿地样地地上植被群落优势种都已趋向旱化,问荆、稗草等杂草类植物优势突出。
  (3)图们江下游湿地各样地土壤种子库中出现的植物科与地上植被群落调查时出现的植物科相似性系数达到80.77%。但各样地间物种相似性系数均较低,在7.14%-42.86%之间,表明地表植被与种子迁移过程受外界生境因子影响较明显,不同湿地类型植被恢复潜力存在差异,从数据分析结果来看,同等情况下图们江下游地区湖泊型湿地植被的恢复潜力较其它样地大。
  (4)图们江下游湿地各样地土壤种子库特征与地上植被群落物种组成结构特征在时间尺度上均存在差异,主要表现为:植被的物种数量增加,多年生物种比例与湿生植被物种比例均降低。从物种生物多样性指数来看,受人为干扰较小的沼泽型湿地生态系统土壤种子库与地上植被群落稳定性较好。
  (5)针对不同湿地类型的植被群落结构特征,在湿地植被生态恢复过程中应选取适合的修复技术,如:自然恢复法更适用于干扰程度在一定阈值内的区域;表层沉积物去除法,适用于受到强烈人为干扰的区域,但可能需要重播种;种子库移植法对主要依靠无性繁殖的物种恢复效果较好,但大面积施用存在困难。
[硕士论文] 苏伯鸿
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:大豆是全世界最重要的经济作物之一,为人类供应了大量的植物蛋白和脂肪。由于我国大豆单产水平与发达国家相比仍然较低,因此提高大豆单产潜力仍是育种工作至关重要的内容。大豆理想株型形态能促进光能的利用效率,是选育高产大豆中重点关注的目标之一,在个体水平以及群体层面上塑造与生态环境相符合的理想株型是提高大豆产量潜力不可或缺的措施之一。突变体是科学家研究基因功能以及进行品种改善的重要基础材料,而通过突变体创制株型变异材料是获得优异种质资源的有效方法之一。鉴定大豆株型变异材料和克隆株型相关重要基因是进行大豆基因功能研究和品种改良的基础。本研究从EMS诱变中品661的突变体库中筛选出多个器官表型均发生变异的株型突变体(it1)。对突变体从农艺性状、生理特性与细胞学观察、遗传分析及基因定位、转录组分析等方面进行了初步系统的研究。
  本研究主要内容包括:⑴对株型突变体(it1)进行了表型和生理鉴定以及细胞学分析:与野生型相比,突变体株型紧凑,节间缩短,叶片变小呈深绿色且皱缩,种子子叶上具有不规则凹痕;突变体株高降低,但节间数目与野生型无显著差别,说明it1株高降低是由每个节间长度缩短造成的,与节间数目无关;突变体的分枝数、荚数、粒数、叶柄长度及夹角、百粒重等产量性状均显著或极显著低于野生型。与野生型相比,突变体叶片叶绿素相对含量显著高于野生型,叶绿素a/b以及木质素的含量显著低于野生型。叶片半薄切片观察发现,叶片皱缩程度不同,下表皮排列混乱程度不同,可能由于上下表皮细胞数目或大小存在差异导致叶片变异。⑵利用中品661×突变体组合进行遗传分析,卡方测验表明,该株型符合3∶1的表型分离比,说明突变表型受隐性单基因控制。对冀豆12×突变体组合进行基因定位,将it1基因定位在SNP标记SNP-147和SNP-836之间,其物理距离为114kb,并利用中黄13×突变体组合对定位结果进行验证,最后通过大豆基因组注释系统Soybase对候选区段进行预测,获得了17个候选基因。⑶利用野生型和突变体不同发育时期的叶片组织进行转录组测序,共在VC时期鉴定出827个差异表达基因,其中差异表达基因上调544个,下调283个;V1时期共得到657个差异表达基因,其中差异表达基因上调288个,下调369个;V8时期共得到871个差异表达差异基因,其中差异表达基因上调584个,下调287个。在转录组中对17个候选基因进行表达量分析发现,Gene4可能是一个调控株型的目的基因。野生型和突变体的差异表达基因GO分类表明,VC、V1、V8时期野生型与突变体的差异基因主要集中在生物过程中,在分子功能方面较少。野生型和突变体的差异表达基因KEGG注释分类显示,VC、V1、V8时期中70%以上的差异基因都参与新陈代谢通路。在新陈代谢通路中,VC时期的差异表达基因主要参与苯丙素生物合成以及淀粉和蔗糖代谢过程;V1时期的差异表达基因主要参与淀粉和蔗糖新陈代谢过程以及戊糖和葡萄糖醛酸酯代谢过程;V8时期的差异表达基因主要参与苯丙素生物合成以及淀粉和蔗糖代谢过程。
[硕士论文] 刘向峰
作物学;作物栽培学与耕作学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:适宜温度是作物生长、产量和品质形成的重要环境因子。我国幅员辽阔,地形复杂,冷害和冻害常年发生,作物生产常因冻害而遭受巨大损失。玉米是全国乃至世界第一大粮食作物,提高其抗冻能力对于增加玉米产量和改善玉米品质意义重大。利用基因工程技术,将已有的抗冻基因直接转入植物体内使其过量表达,能够直接有效的提高其抗冻能力,较传统育种技术,周期短,见效快。本试验在前人研究基础上,选择7个抗逆候选基因的过表达拟南芥材料(总计22个株系)进行抗冻性鉴定,以哥伦比亚野生型和空载体型拟南芥作为对照,筛选出抗冻性较强的转AT1G07890基因拟南芥株系,研究其基因对拟南芥的生长发育和生理代谢等的影响。拟南芥AT1G07890基因在玉米中的同源基因为GRMZM2G137839,通过对玉米自交系进行qRT-PCR,来观察GRMZM2G137839基因在玉米抗低温自交系(KR701、B125)以及玉米低温敏感自交系(黑8834、昌7-2)冻害胁迫处理前后的基因表达情况,为开展玉米抗冻基因工程来提供有力理论的依据。
  本研究主要内容包括:⑴在7个抗逆候选基因的过表达拟南芥的材料中,转AT1G07890基因型比其它转基因型、野生型和空载体型拟南芥株系在冻害胁迫处理后存活率高,电导率和含水量低,说明其抗冻能力强。⑵在正常生长条件下,转AT1G07890基因型与野生型和空载体型拟南芥的叶片及根系生长发育无显著差异,说明转AT1G07890基因对拟南芥的正常生长没有影响。⑶转AT1G07890基因型在4℃和0℃的低温萌发试验中均比野生型和空载体型拟南芥萌发更早,萌发率更高。⑷转AT1G07890基因型叶绿素的含量在正常生长条件下与野生型和空载体型拟南芥幼苗无明显的差异,冻害胁迫后转基因型的叶绿素含量与之相比更高。⑸转AT1G07890基因型MDA的含量在正常生长条件下与野生型和空载体型拟南芥幼苗无明显的差异,冻害胁迫后转基因型MDA的含量低于野生型和空载体型拟南芥幼苗的,说明其细胞膜受到的损害较轻。⑹转AT1G07890基因型SOD和POD的活性在冻害胁迫处理前与野生型和空载体型拟南芥幼苗无显著差异,胁迫后转基因型SOD和POD的活性明显高于野生型与空载体型拟南芥幼苗的,因为抗氧化酶系统可以提高植株抗冻的能力,说明转AT1G07890基因提高了拟南芥幼苗抗冻的能力。⑺转AT1G07890基因型可溶性糖和Pro的含量在冻害胁迫处理前与野生型和空载体型拟南芥幼苗是无显著差异的,胁迫后转基因型可溶性糖和Pro的含量明显高于野生型与空载体型拟南芥幼苗的,因为渗透调节物质可以提高植株抗冻的能力,说明转AT1G07890基因提高了拟南芥幼苗抗冻的能力。⑻玉米自交系在冻害胁迫处理前,GRMZM2G137839基因在KR701、B125、黑8834和昌7-2玉米自交系幼苗中的表达量无明显差异,KR701较高。冻害胁迫后,GRMZM2G137839在4份玉米自交系幼苗的表达量都升高了,抗冻玉米自交系品种KR701和B125上升幅度大,敏感玉米自交系品种黑8834和昌7-2上升幅度低,可见GRMZM2G13783基因在玉米自交系幼苗受到冻害胁迫时上调表达。
[博士论文] 王茂军
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:棉花是世界上重要的经济作物,棉花纤维是重要的天然纺织纤维。棉花纤维作为高度分化的单细胞,是研究细胞分化、细胞伸长和细胞壁合成的良好模型。本研究以组装和分析海岛棉基因组为基础,分析棉花纤维驯化历程和鉴定控制纤维品质性状形成的重要位点,并且分析纤维发育过程中的长链非编码RNA,进一步比较纤维和非纤维组织中可变剪接的差异,最后结合多组学数据,从表观遗传角度揭示纤维发育的动态过程。主要结果如下:
  1.海岛棉基因组测序和纤维细胞壁合成的重要基因家族分析
  本研究利用全基因组鸟枪法测序拼接四倍体海岛棉基因组。海岛棉基因组编码80876个基因,含有69%以上的重复序列。通过分析纤维素合酶(CesA)基因家族在棉花中的进化和各个成员在纤维发育过程中的表达模式,我们创造性地提出海岛棉纤维发育过程中CesA基因家族的接力模型,即At、Dt亚基因组合作调控四倍体棉花纤维发育。研究重点分析了果胶去甲酯化酶(PME)和果胶去甲酯化酶抑制基因家族(PMEI),发现PME的进化起源与细胞壁中果胶出现的时间一致。此外,研究发现这两个基因家族在高等植物中大量扩增,并且进化速率很快。我们推测PMEI结构域的起源可能是全基因组复制之后pro结构域的新功能化。这些结果促进了棉花基因组研究,加深了对植物细胞壁进化的理解。
  2.基因组重测序揭示了大量变异,这些变异是棉花驯化和顺式调控分化的基础
  本研究收集了352份陆地棉材料,包括半野生种和驯化种,构建了一个综合性的基因组变异图谱。研究鉴定了93个驯化选择区域,覆盖At亚基因组的74 Mb,Dt亚基因组的104 Mb,同时通过全基因组关联分析鉴定了19个与纤维品质性状相关的候选位点。结果表明长纤维的驯化与非对称的亚基因组选择相关。通过系统地分析DNaseⅠ酶切超敏感位点和三维基因组图谱,我们将一些可能存在的功能变异与基因转录联系起来,从而揭示了驯化对群体顺式调控元件分化的影响。本研究提出了一个重要作物中基因组的进化、调控和适应的新观点,为基于基因组的棉花遗传改良提供了丰富资源。
  3.棉花长链非编码RNA的鉴定和在纤维中的功能分析
  通过整合大量的转录组数据,本研究鉴定了30550个基因间区的长链非编码RNA(lincRNA)和4718个反义长链非编码RNA(lncNAT)位点。lncRNA的表达量比较低,并且大多数呈现出组织特异性表达模式。与蛋白质编码基因相比,lncRNA在基因区域的甲基化水平明显更高,并且其表达水平受基因区域甲基化影响较小。我们利用实验验证了一部分在棉花纤维发育起始期表达的lncRNA,发现这些lncRNA在纤维发育突变体和正常表型材料中差异表达,推测其可能与棉花纤维起始相关。最后,我们构建了共表达网络,对在纤维伸长和次生壁合成时期的lncRNA进行功能注释。
  4.棉花可变剪接图谱的建立及其复杂性和调控机制
  本研究利用单分子长读段转录本测序技术(Iso-Seq)对海岛棉进行转录组测序,开发了一套分析Iso-Seq数据的流程。我们从44968个基因中鉴定了176849个全长转录本,并更新了基因模型;同时,鉴定了15102个纤维特异的可变剪接事件,估计大约51.4%的亚基因组间的同源基因会通过可变剪接产生结构差异的转录本。进一步研究发现,同一个基因由可变剪接产生的转录本会受到miRNA的差异性调控。最后,我们发现核小体密度和DNA甲基化会在染色质水平定义外显子。本研究揭示了四倍体棉花中可变剪接的复杂性和新的调控机制,进一步增强了人们对多倍体植物中可变剪接的认识。
  5.棉花纤维发育动态表观组的建立和重要调控基因分析
  本研究建立了棉花纤维发育过程中的动态DNA甲基化组。随着纤维发育,DNA甲基化的比例会逐渐升高,呈现出与RNA介导的DNA甲基化相反的趋势。核小体定位分析表明发育中的纤维不断异染色质化,其可能与DNA甲基化的动态变化相关。绝大部分DNA高甲基化是由H3K9me2依赖的途径建立,与RNA介导的DNA甲基化不相关。通过分析四倍体棉花At和Dt亚组同源基因甲基化和表达量之间的关系,我们推测不同亚组基因的表观修饰差异可能会是基因偏向性表达的原因之一。最后,我们利用多组学数据的整合分析,揭示了DNA甲基化的动态变化可能会调控纤维细胞伸长和次生壁加厚时期活性氧含量的动态平衡。本研究首次绘制了棉花纤维发育过程中表观遗传修饰的动态图谱。
[硕士论文] 周彬
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:棉花作为重要的经济作物和纺织原料,是不可或缺的战略储备物资。虽然其具有较强的抗逆性,但随着种植面积的缩减,棉花逐渐从较好的种植环境转移至相对恶劣的环境,土地的盐碱化和水资源的不足,导致棉花产量下降,品质变差。所以,培育抗非生物逆境,特别是抗旱的棉花品种,对于农业生产和社会稳定都有很重要的意义。随着棉花基因组的测序完成,数年来积累下来的大量生物信息学数据为棉花分子育种奠定了良好的基础。bZIP家族转录因子根据其特有的碱性亮氨酸拉链结构被分为13个亚族,其中A亚族主要跟抗逆相关。近年来关于bZIP转录因子参与植物逆境响应的研究逐渐增多,其作用机制也逐渐清晰。本研究通过分析棉花逆境处理均一化文库,从中分离到一个bZIP家族基因GhABF1,对其在棉花中的抗逆功能进行初步鉴定和机制探索,主要结果如下:
  1.海岛棉不同逆境处理均一化文库的分析
  通过对本课题组海岛棉Hai-7124不同逆境处理(高温,低温,高盐,低钾低磷和黄萎病)均一化文库进行文库随机测序,得到6,047条高质量的EST序列,经过聚类拼接,组装成3,135条单一序列,其中包括638个contigs序列和2,497条singletons序列。同源比对结果显示,2,746条特异基因与目前已知的基因表现出高度的同源性,74条特异EST与预测的蛋白高度同源,而有315条特异EST特征不明显。功能分类揭示了这些特异EST在分子结合,催化活性和结构分子活性等三方面丰度极高。与植物转录因子数据库(PlantTFDB)和植物逆境蛋白数据库(PSPDB)比对发现,在这个文库中有相当多的转录因子(如MYB-related,C2H2,FAR1,bHLH,bZIP,MADS和mTERF)和逆境相关基因,我们对其中部分转录因子和逆境相关基因进行了RT-PCR实验再验证,有利于筛选出与抗逆相关的候选基因用于分子育种。
  2.GMBF1功能的初步分析
  基于上述的cDNA文库,我们筛选到一个bZIP家族基因GhABF1受干旱诱导上调表达。序列同源比对分析发现GhABF1与GrABI5最同源,并且具有bZIP转录因子典型的碱性亮氨酸拉链结构域;启动子顺式作用元件预测发现GhABF1上游启动子含有较多的脱落酸,茉莉酸,乙烯,赤霉素响应元件,厌氧、热胁迫等逆境防御响应元件和细胞循环、胚乳表达响应元件;逆境诱导表达分析表明GhABF1受ABA,PEG和NaCl等逆境因子诱导上调表达,表明其可能参与棉花抗非生物逆境过程。
  我们利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术抑制GhABF1在陆地棉品系Jin668中的表达。通过离体叶片失水率和叶盘法观察其在盐胁迫下的表型,发现沉默GhABF1基因后植株的耐早性和耐盐性增强;同时,我们以GhABF1蛋白为诱饵通过酵母双杂交筛选棉花非生物逆境文库,共筛选到12个与GhABF1蛋白互作的蛋白,点对点验证发现其中G蛋白偶联受体GhGCR2(Gh_D01G0507)能与GhABF1蛋白互作激活报告基因表达,具体的调控机制有待进一步研究。
[硕士论文] 陈凤仪
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:油菜是我国主要的油料作物,细胞质雄性不育是油菜杂种优势利用的重要途径。hau CMS是华中农业大学傅廷栋院士1999年发现的天然芥菜型油菜雄性不育,是一种全新的油菜胞质不育类型,不育彻底稳定,不受温度等环境因素影响,在生产上有广阔的应用前景。本研究以甘蓝型油菜hau CMS不育系、保持系、育性恢复株为材料,通过Western Blot检测不育基因的蛋白表达模式;结合iTRAQ和生物信息学技术鉴定甘蓝型油菜hau CMS不育系和保持系的差异表达蛋白,分析差异表达蛋白的代谢路径与花药败育的关系;以不育基因orf288为诱饵构建载体进行酵母双杂交,筛选甘蓝型油菜花蕾cDNA文库,寻找与不育蛋白发生互作的因子,旨在从蛋白水平分析hau CMS败育的分子机制。主要研究结果如下:
  1.orf288不育相关基因的翻译模式分析
  通过设计不育相关蛋白ORF288的特异性抗体对hau CMS不育系、保持系和恢复材料的小花蕾总蛋白进行Western杂交,从蛋白水平上验证了orf288可能是导致不育的基因,且可能是从转录本的第二个起始密码子处开始功能蛋白翻译的。
  2.酵母双杂筛选与orf288互作基因
  以基因orf288全长和截短orf288104-288片段构建BD诱饵载体,对甘蓝型油菜花蕾cDNA文库分别进行了三次筛库,BD-288共筛选到22个互作蛋白,其中三个定位在线粒体或核糖体上,BD-185共筛选到79个互作蛋白,其中12个定位在线粒体上,10个定位在核糖体上,点对点验证少数在四缺上可以长斑,但实验可重复性不高,综合所有结果,目前还没有获得能与BD-288或BD-185互作的蛋白。
  3.hau CMS不育系和保持系花蕾差异表达蛋白分析
  结合半薄切片结果确定的不育时期,通过对甘蓝型hau CMS不育系和保持系小花蕾iTRAQ结果中的186个差异表达蛋白数据进行生物信息学分析,发现不育系的两种蛋白质降解途径(蛋白酶体途径与细胞自噬途径)中关键蛋白表达量均存在显著差异。进一步的RT-PCR实验表明,蛋白酶体途径相关基因表达量在蛋白水平差异更为显著,细胞自噬途径相关基因在转录水平上差异更为显著,转录后修饰调控机制可能对甘蓝型油菜hau CMS败育过程有重要影响。
  依据以上结果,我们猜想可能是不育蛋白与相关因子作用,影响了细胞蛋白降解功能,导致ROS大量积累,线粒体空泡化,碳水化合物和能量代谢失常,最终引起不育。
[硕士论文] 夏雨
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:随着社会经济的发展,人们的保健意识不断加强,从而对含有特殊营养物质的水稻需求也越来越大。水稻特殊营养物质主要是指在水稻种子中积累的一类有利于人们健康的营养物质,包括维生素、油脂、活性多糖、自由基清除剂、黄酮类化合物、甾醇类化合物、必需微量元素、矿质元素、γ-氨基丁酸(GABA)、绿原酸类、含有特定必需氨基酸的谷蛋白、膳食纤维和特定含量的淀粉等成分。这些特殊营养物质的形成和积累过程受到自身遗传物质的调控。本研究通过分析代谢组与全基因组关联分析的数据,结合生物信息学分析筛选了大量影响水稻特殊营养品质代谢的候选基因,利用基因序列多态性的信息设计候选基因的基因标记,然后利用水稻代换系衍生分离群体和核心种质对部分候选基因进行功能验证,最后利用功能基因标记开展辅助选择育种,改良水稻品种中的特殊营养品质。
  主要研究结果如下:
  1.利用水稻代谢组与全基因组关联分析数据分析筛选了特殊营养物质代谢的候选基因共52个,并根据每个基因可能的功能位点设计了对应的分子标记,得到了其中41个候选基因的基因标记。
  2.对水稻花青素与原花青素的代谢途径中的关键基因包括Ra、Rc、Rd等设计了一套功能基因标记,不仅可用于水稻黄酮类物质代谢的研究,也能用于分子辅助选择改良稻米颜色。
  3.利用日本晴导珍汕97B的染色体片段代换系材料衍生的F2分离群体,定位到影响水稻种子胚中亚油酸与亚麻酸含量比值的一个候选基因LOC_Os11g01340。并且针对基因LOC_Os11g01340,设计了相应基因标记OSFA-5。
  4.利用基因标记OSFA-5可有效地检测到水稻核心种质群体的不同单倍型。不同单倍型中的亚油酸与亚麻酸含量及比值呈显著差异。
  5.利用目标功能基因标记开展分子辅助选择改良水稻品系2-33中的脂肪酸含量、甾醇含量、香味品质和花青素含量等特殊营养品质,获得了包括16W RR2-3-12在内的20个品质优良的家系。
[硕士论文] 朱恺毓
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:利用CRISPR/Cas9系统进行定向基因编辑,创造新型种质资源已经在多种重要作物中得到成功的运用。在甘蓝型油菜中,多室性状能够增加每角果粒数从而达到增产目的,但是在自然条件下还没有发现多室突变体。根据模式植物拟南芥中已发现的多室角果形成的相关途径和基因。我们挑选了甘蓝型油菜中的BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2作为甘蓝型油菜的多室候选靶基因,设计它们的CRISPR/Cas9编辑载体,通过农杆菌介导的遗传转化创建这些候选基因的突变体。在此基础上,一方面可以确定这些基因功能,另一方面也可以创建多室突变体,为油菜的高产育种提供新的种质资源。主要结果如下:
  1.生物信息学分析表明,甘蓝型油菜中BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2基因的结构和拟南芥的同源基因基本相同。根据这些基因的结构,我们针对各个候选基因设计了2-4个靶位点,构建了它们的多靶点CRISPR/Cas9载体,利用农杆菌介导的下胚轴遗传转化法分别获得了119、40、319和108株BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2的T0代转基因单株。阳性鉴定结果表明BnaCL V1、BnaCLV2、BnaC V3和BnaRPK2转基因单株的阳性率分别为84.9%、92.5%、85.3%和83.8%。对阳性单株进行非变性PAGE胶的编辑检测,发现47、22、35和38株材料发生了突变,突变的效率为12.9%-59.5%。
  2.进一步对BnaCLV1、BnaCLV3和BnaRPK2的T0代编辑单株的靶点进行了测序验证。,发现这些编辑单株都在PAM结构上游3-4bp处发生了不同形式的碱基缺失和插入,其中单碱基插入的频率最高。对部分T1代株系的分析发现,这些突变可以稳定地遗传到下一代。
  3.在BnaCL V1、BnaCLV2、BnaCLV3的T0代突变体中,观察到2.9%-10.8%的单株具有多室角果的突变表型,可能为纯合突变体。证明了BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3就是控制油菜多室性状的相关基因。同时我们成功地创造了纯合的多室突变体,为多室调控网络在甘蓝型油菜中的研究提供了实验材料。
  综上所述,本研究成功创建了BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2等重要多室候选基因的突变体,部分突变体出现多室角果性状。该研究结果为进一步鉴定这些基因的功能以及甘蓝型油菜的多室性状育种提供了研究宝贵的材料。
[硕士论文] 李璐
蔬菜学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:自1983年首次获得转基因株系以来,农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系在不断的改进和完善,目前已成功建立不同基因型和外植体类型的转化体系,但仍存在基因型依赖和转化效率低等问题。遗传转化技术的发展与成熟为马铃薯晚疫病抗性机制的研究提供了新的契机。StNTP是调控马铃薯晚疫病抗性机制的NAC转录因子,前期研究发现在本式烟中沉默NbNTP基因导致晚疫病致病力增强,本研究利用优化的转化体系进一步探究StNTP在马铃薯晚疫病抗性中的作用。
  选取马铃薯晚疫病感病材料304413.19、304413.89和Désirée及抗病材料301071.3、304413.40,通过观察试管薯形成特点选取幼嫩试管薯为外植体,探索筛选压、分化培养基组成对转化效率的影响,建立相应的转化体系。利用优化的体系获得StNTP转基因阳性株系,对StNTP基因进行晚疫病抗性功能验证。取得研究结果如下:
  1.对304413.19、304413.40和Désirée试管薯形成特点观测,结果表明304413.19初始结薯时间比Désirée和304413.40提前一周,初步确定自接种起培养55d形成的304413.19试管薯和接种60d的304413.40和Désirée试管薯为外植体优化遗传转化体系。
  2.基于组织培养条件下的试管薯形成表型,对301071.3和304413.89两种基因型试管薯形成进行两种光周期处理和对301071.3基因型进行蔗糖处理实验,结果表明全黑暗诱导试管薯的提前形成,短日照能增加单株结薯数和单薯块重。60g/L蔗糖浓度有利于301071.3基因型试管薯的形成。
  3.以304413.19、304413.40和Désirée为受体对卡那(Kan)浓度和分化培养基组成两个因素进行优化。304413.19、304413.40和Désirée最适Kan浓度分别为50mg/L,50mg/L和60mg/L。三个基因型中只有Désirée成功获得转基因株系,最优分化培养基组合为(MS+0.1mg/L IAA+2mg/L ZT+60mg/L Kan+400mg/LCef),植株再生率和外植体转化率分别为52.27%和11.36%。
  4.成功构建StNTP超量表达载体,利用优化的Désirée转化体系转入马铃薯受体材料Désirée中,获得StNTP1转基因株系5个,StNTP2转基因株系3个,经晚疫病抗性鉴定,病斑面积分析显示,与对照相比超量株系晚疫病抗性显著增强,说明StNTP增强马铃薯晚疫病抗性。
[硕士论文] 左西龙
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:从光温敏雄性不育系鄂丰1s的杂交后代获得一种苗期叶片间断失绿的材料,表现为苗期移栽后新生叶片及叶鞘出现横向间断失绿的斑马状条纹。经多代筛选育成斑马叶性状稳定的不育材料B03S。为了探明该性状的遗传生理基础,本研究对B03S在不同播期和不同时期移栽,对其突变表型观察鉴定,在斑马叶性状表现过程中测定叶片色素含量、叶绿素荧光和抗氧化酶活性以及观察叶绿体超微结构。用B03S与恢复系的杂交分离后代分析遗传特性,并通过低温处理及育性鉴定筛选带有标记性状的后代材料。同时利用转录组测序、蛋白质双向电泳和串联质谱鉴定技术分析斑马纹表现时期黄/绿部分叶片基因及蛋白表达差异,并通过qPCR和Western Blot分析对相应时期叶片转录组及蛋白质双向实验结果进行验证。主要研究结果如下:
  1.斑马叶性状属1对隐性基因控制的遗传性状。以B03S为母本,以常规材料9311、N22、RM5、TXZ为父本进行杂交,F1群体单株在移栽后无突变表型出现,F2群体单株出现性状分离并且符合3∶1的分离比。斑马叶植株的多代自交群体中不发生性状分离,能够稳定遗传。同时对较优的杂交组合B03S×9311的后代材料进行连续五年的低温处理和育性鉴定,选育出一套带有斑马叶标记性状的可育材料以及与母本表型相近的斑马叶不育系材料。
  2.在隐性纯合状态下斑马叶性状需经过移栽过程刺激产生。突变体在秧苗期表现为正常绿色,移栽后一周左右新生叶片及叶鞘表现出一种明显的横向间断失绿的表型。且突变表型仅在移栽后2-3片新生叶中出现,后期再生长的叶片为正常的全绿叶。分期播种移栽及不同时期移栽均能稳定表现出斑马叶性状。
  3.斑马叶属叶绿素合成与叶绿体发育缺陷类型。斑马叶表现过程中色素含量下降明显,Z-Y中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别下降82.8%、81.0%、67.7%,Z-Y叶绿素荧光值F0、Fm显著降低,φ PSⅡ、ETR下降幅度分别超过22%和28%,叶绿素荧光相关指标下降与叶片色素含量降低紧密相关。透射电镜结果显示:Z-Y中叶绿体大小正常,内部结构发育不完全,有许多自噬体结构,类囊体缺失严重,基粒数量明显减少,且片层垛叠较少。抗氧化酶活性测定表明Z-Y中SOD、POD酶活最高,且POD酶活差异达到极显著水平。
  4.斑马叶表现期转录组测序结果筛选出720 DEGs,在Z-Y中有303个基因上调表达,417个基因下调表达,这些基因主要富集在次生代谢产物合成、抗逆、光合、核糖体、内质网蛋白合成过程以及与能量相关的糖/淀粉代谢、氨基酸形成等途径,对抗逆及叶绿体形成相关目的基因进行qPCR验证,结果显示其表达趋势与转录组结果一致。
  5.斑马叶表现期叶片蛋白质双向电泳鉴定出表达丰度在2倍或2倍以上差异蛋白点46个,仅在Z-Y表达的蛋白点79个,仅在Z-G表达的蛋白点19个。结合已有Rubisco抗体,采用Western Blot对蛋白质双向结果做进一步验证,发现Z-G/Z-Y差异倍数在1.5倍左右,与双向凝胶分析结果一致。串联质谱分析鉴定出28个差异表达蛋白,大部分蛋白质参与蛋白结合、能量代谢、酶活及光合作用相关途径。同时对其中抗逆及叶绿体形成相关蛋白进行了转录水平的验证,基因转录水平与蛋白表达水平存在一定的关系。
  本研究获得了不育和可育的斑马叶形态标记性状材料和斑马叶性状发生的遗传生理初步结果,对叶绿素合成及叶绿体发育过程的调控基础研究有一定参考作用。在斑马叶性状基因及其对移栽刺激的诱导表达机制尚需深入研究。
[硕士论文] 杨梅
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:玉米株高属于株型育种目标性状之一,不仅与玉米籽粒的机械化收获及抗倒伏相关,也与玉米产量密切相关,是玉米遗传育种研究的重要目标性状之一。在课题组前期工作中,利用高代回交重组自交系W1和W2构建的F2和F2∶3群体在第三染色体上定位到两个主效QTL位点qPH3.2(C42-P17)和qPH3.3(C79-C103);在此基础上,本试验目标是利用剩余杂合群体对上述两个主效QTL进行重定位,鉴定其真实可靠性,进而利用目标区段的子代纯系和跨叠系精细定位qPH3.2和qPH3.3并对其进行遗传解析。本试验获得的主要结果如下:
  1、利用剩余杂合群体对qPH3.2进行重定位。将含有目标区段的2个剩余杂合单株自交构建分离群体,采用复合区间作图法和单标记分析法将qPH3.2剖分为2个主效QTL,分别命名为qPH3.2.1和qPH3.2.2。QTL重定位区间与初定位区间相一致,证实了QTL定位结果的准确性和真实性。
  2、qPH3.2.1的精细定位。将qPH3.2.1目标区段内的跨叠系纯系(1765株)在黄冈、山东进行一年两点试验,每点3次重复随机区组设计播种,将qPH3.2.1定位在标记Y72-Y91之间。随后利用Y72-Y91目标区段内筛选到的5种重组类型,交换单株自交构建的F2群体进行子代测验将qPH3.2.1定位在标YH305-Y72之间约7.6Mb范围内。
  3、qPH3.2.2的精细定位。将qPH3.2.2目标区段内的跨叠系纯系(2125株)在黄冈、山东进行一年两点试验,每点3次重复随机区组设计播种,将qPH3.2.2定位在标记P17-Y150之间。进而利用P17-Y150目标区段内筛选到的4种重组类型,不同类型的交换单株自交构建F2群体进行子代测验qPH3.2.2进一步精细定位,最终将qPH3.2.2定位在标记YH112-Y150之间约8Mb范围。
  4、利用剩余杂合群体对qPH3.3进行重定位。将含有目标区段的3个剩余杂合单株自交构建分离群体,采用复合区间作图法和单标记分析法对qPH3.3重定位,验证了初定位结果的准确性和真实性。
  5、qPH3.3的精细定位。根据重定位的结果,在目标区间筛选到11种重组类型。利用不同重组类型的交换单株自交构建的F2群体将qPH3.3定位在标记C79-C90之间约11Mb范围。
[硕士论文] 陶婧芬
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:基因组变异是生物多样性形成、发展和消失,以及物种进化的物质基础,主要由单核苷酸多态性和基因组结构变异两个方面构成。相比单个核苷酸位点突变,结构变异对于表型变化(如各种慢性疾病)和进化具有更显著的影响,因此基因组结构变异在人类遗传学研究中受到越来越多的关注。植物中结构变异相关的研究起步较晚,对于其发生和进化固定的机制更是知之甚少。已有研究结果表明染色质空间组织很有可能在基因组结构变异中发挥重要作用,为了在植物中验证这一假设,我们选择模式植物拟南芥为对象展开本研究。
  在本课题中,我们利用5组已发表的拟南芥高质量染色质空间交互数据,系统分析了由土壤农杆菌介导的外源T-DNA插入、减数分裂过程中发生的片段交叉互换以及在进化过程中的大规模染色质重排等三个层次的结构变异事件的特征,并整合交互与变异数据综合考察染色质空间组织和基因组结构变异之间的关系。结果显示,对于11,802个T-DNA插入的位点,它们有着更高的染色体间与染色体内交互比值,并且交互比值与T-DNA插入数量之间呈现显著性的正相关(R=0.869-0.906);同时,交互比值与T-DNA插入位点之间的距离也存在相关性(R=0.673-0.851)。对于375个减数分裂过程中发生交叉互换的片段,交叉互换频率越高的位点,交互比值也越高。而全基因组倍增事件中保留下来的两类印迹基因4,431对ohnologs和3,399对祖先相邻基因,相比随机基因对它们之间有着更强的交互,交互比值也高于其他的基因。综上所述,本研究考察的外源、内源及进化等三种不同驱动机制介导的,从干碱基、百万碱基到染色体级别多个层次的结构变异在基因组上均不是随机分布的,而是倾向于发生在基因组三维空间染色体间交互更高的位置,即局部染色体区域的边界。结合已有的相关研究,本课题的结果充分显示了染色质空间组织对于结构变异的影响作用,为更深层次挖掘结构变异产生及固定的内在机理和研究全基因组倍增后基因命运决定机制提供了理论基础和新的思路,也进一步佐证了三维基因组学在基因组进化研究中的重要性。
[硕士论文] 严莉
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界上重要的油料作物之一,提高产量是油菜育种研究的重要目标。油菜的产量由种植密度和单株产量共同决定,其中种植密度与油菜的株型紧密相关;而单株产量取决于单株角果数、每角果粒数和千粒重三个因子的协调作用。到目前为止,已有大量单株产量构成因子相关QTL被报道,但只有2个QTL通过图位克隆的方法得到基因:即控制千粒重的QTL(BnaA09.ARF18和控制每角果粒数QTL(BnaC9.SMG7b)。李世鹏在克隆甘蓝型油菜每角果粒数主效QTL qSS.C9(BnaC9.SMG7b)的过程中发现,NIL(Y106)每角果粒数显著性增加,但同时千粒重显著下降。这种随着每角粒数增加而千粒重下降的变化可能是Bna C9.SMG7b的一因多效,也可能由其他基因所致。进一步的序列分析显示,在qSS.C9定位区间的BnaC9.RINGb基因可能直接参与调控种子的发育。本研究在此基础上,通过比较基因组学和分子生物学的方法,对qSS.C9定位区间内的候选基因进行了研究分析。主要结果如下:
  1.BnaC9.SMG7b基因互补验证:转基因互补实验表明,BnaC9.SMG7b基因对千粒重没有显著影响。这表明可能存在其它基因对NIL(Y106)的千粒重起到调控作用。
  2.候选基因分析:对qSS.C9定位区间内的候选基因进行比较测序发现,BnaC9.RINGb在双亲之间存在明显差异;初步的转基因互补试验结果显示,BnaC9.RINGb基因负调控千粒重,使受体材料HZ396的千粒重显著下降,极可能是目标基因。
  3.BnaC9.RINGb同源拷贝分析:序列比对结果发现BnaC9.RINGb基因在拟南芥有1个同源基因,甘蓝型油菜中有8个,甘蓝中有3个,白菜中有3个。
  4.表达模式分析:GUS染色分析,该基因在拟南芥的子叶、叶片、角果皮、雌蕊和雄蕊中都有表达,亚细胞定位表明该基因表达蛋白定位于细胞核。
  5.拟南芥同源基因功能研究:部分ring突变体的角果长、角果宽和每角果粒数显著高于野生型:突变体的千粒重比野生型材料有一定的增加,但并未达到显著水平。
[硕士论文] 苏锐
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:624R是一个综合农艺性状优良的波里马细胞质雄性不育恢复系,以其作为父本已配制多个油菜杂交种,但是存在千粒重较小(约2.5g)且无除草剂抗性的缺点。本研究以624R为轮回亲本,以ZY50为大粒(约4.3g)供体亲本、7-5RS为苯磺隆除草剂抗性供体亲本,采用回交育种结合分子标记辅助选择和小孢子培养技术定向改良恢复系624R的千粒重和苯磺隆除草剂抗性。主要研究结果如下:
  1.624R千粒重改良DH群体构建。通过回交育种结合分子标记辅助选择,在BC3F1世代获得了35株4个千粒重主效QTL位点(QSWA3-1、QSWA3-2、QSWA3-3和QSWA9,分别可以解释5%、10%、10%和30%的千粒重表型变异)均为杂合的单株。再利用这些材料通过小孢子培养构建了一个含有606个单株的DH群体。
  2.624R千粒重改良DH群体基因型分析。利用与4个千粒重主效位点紧密连锁的分子标记对DH群体进行基因型分析,发现81个单株在这4个位点表现为同轮回亲本基因型,109个单株携带单位点的的优良基因,107个单株携带两位点的优良基因,56个单株携带3位点的优良基因,23个单株携带4位点的优良基因。
  3.624R千粒重改良DH群体遗传背景分析。利用在甘蓝型油菜染色体上均匀分布的37对SSR标记对DH群体进行遗传背景分析,发现36.27%单株的背景恢复率在85.00%至90.00%之间,43.73%单株的背景恢复率在90.00%以上,其中背景恢复率最高的达到100.00%。
  4.624R千粒重改良DH群体表型考察。对DH群体的千粒重、每角果粒数、角果长等产量相关性状进行考察。综合评价发现:QSWA3-1单位点对千粒重改良效果可能最大,而QSWA3-2、QSWA3-3和QSWA9三位点聚合改良千粒重效果可能最明显,综合考虑对每角粒数、角果长的影响,QSWA3-2、QSWA3-3和QSWA9三位点聚合改良效果可能最好。
  5.624R苯磺隆抗性改良DH群体构建。通过回交育种结合分子标记辅助选择和田间抗性表型鉴定,在BC3F1世代获得了26株苯磺隆抗性位点杂合单株。再利用这些材料通过小孢子培养构建了一个含有188个单株的DH群体。
  6.624R苯磺隆抗性改良DH群体前景选择和抗性鉴定。利用苯磺隆抗性基因内标记Scahas3-2对苯磺隆抗性改良DH群体进行前景选择,发现71个单株携带苯磺隆抗性基因,进一步通过田间表型(侧枝喷苯磺隆)确认了这些单株对苯磺隆的真实抗性。
  7.624R苯磺隆抗性改良DH群体背景分析。利用在甘蓝型油菜染色体上均匀分布的49对SSR标记对DH群体进行背景分析,发现30.99%单株的背景恢复率在85.00%至90.00%之间,38.03%单株的背景恢复率在90.00%以上,其中背景恢复率最高的达到95.91%。
[博士论文] 战宗祥
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:根肿病是一种专性寄生于芸薹属作物的世界性土传病害。近年来该病害在我国蔓延迅速,仅四川省发病面积达300万亩以上,湖北、安徽、云南、贵州等地也有不同程度的发病。随着机械化程度的提高,根肿病在我国的传播速度不断加快。由于目前没有切实有效的防控方法,根肿病已经开始对我国油菜产业产生了严重威胁。全世界普遍认为培育抗病品种是防治根肿病的最有效方法,但是目前我国油菜品种缺乏对根肿病的抗性,因此通过资源创新培育抗病新品种对保障我国油菜生产的安全性意义重大。针对以上问题我们在油菜抗根肿病资源创新与利用方面作了如下深入研究:
  1.通过远缘杂交将萝卜基因组中的抗病性状转育到甘蓝型油菜中RRCC(2n=18R+18C;Brassicoraphanus)是通过萝卜(RR=18;Raphanus sativus)和芥蓝(CC=18; Brassica alboglabra Bailey)杂交、染色体加倍后人工合成的异源四倍体。经鉴定对根肿菌2、4、7、10号生理小种具有免疫抗性,且抗性来自萝卜基因组。为了将来自萝卜R基因组的抗性位点导入油菜,我们首先将RRCC作为父本与国审常规品种华双5号(AACC=38;Brassica napus)杂交,通过胚挽救成功获得了杂种F1(ARCC)。经过回交两代分别获得BC1和BC2代植株,利用GISH,BAC-FISH等方法对杂种F1及其回交后代在减数分裂期进行了染色体配对行为观察和遗传分析,结果如下:
  (1)杂种F1中A、R染色体部分同源配对频率非常高,有73.53%的PMCs存在A-R配对情况,这说明R与A基因组具有较高同源性,因此R基因组的抗病位点有较高概率渗入到油菜A基因组。
  (2)随着回交代数的增加染色体逐渐恢复正常,花粉育性也逐渐提高。BC2代部分单株到染色体恢复正常(AACC;2n=20A+19C),花粉育性最高达到98.95%。
  (3)杂种F1对4号生理小种具有免疫抗性,BC1、BC2抗病率分别为77%、13.51%。说明抗病位点能够遗传给后代,另外在BC2中成功筛选得到了正常抗病甘蓝型油菜。证明通过这种方式创新油菜抗根肿病资源的可行性。
  2、与PbBa8.1位点紧密连锁标记开发与遗传转育。
  芜菁ECD04(Brassica rapa)中有5个抗病位点对不同的生理小种具有抗性。PbBa8.1位点对4号生理小种具有抗性,而目前4号生理小种是我国的优势小种。为了快速培育具有抗根肿病特性的新型甘蓝型油菜,我们以ECD04为抗源通过传统育种的方法和华双5号杂交、回交,利用分子标记辅助选择的方法对抗病位点进行定向转育。期间对ECD04进行全基因组测序通过比较基因组的方法开发连锁分子标记,结果如下:
  (1)根据ECD04和华双5号在A基因组位点差异共开发了36762个InDel标记。在染色体的平均密度约为154.0个/MB,其中位于5个抗病位点内的标记共4181个。其中一个与PbBa8.1位点紧密连锁的分子标记A08-300。
  (2) PbBa8.1可能是Crr1a的等位基因,利用同源克隆的方法分离出PbBa8.1的一段序列。通过比较分析其与Crr1a的序列差异开后发了一个Caps-134标记。
  (3)利用与PbBa8.1紧密连锁的分子标记A08-300和Caps-134进行辅助选择,通过传统育种方法培育了国内第一个油菜抗根肿病品种华双5R。经鉴定华双5R对安徽、湖北、四川等地的生理小种具有免疫抗性。
[博士论文] 陈杰
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:苎麻(Boehmeria nivea L.Gaud)是荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)的多年生宿根性草本开花植物。苎麻主要采用传统育种方法进行育种,由于种植面积大幅萎缩、科研人员不足以及研究基础薄弱等原因,其新品种的育种进程一直比较缓慢,需要尽快引入分子育种手段加快其育种进程。本研究对苎麻纤维发育进行了转录组测序和对expansin家族进行了基因克隆和功能分析,主要实验结果如下:
  1.进一步优化了苎麻不同样品总RNA提取技术,并使用该基于异硫氰酸胍作为主要裂解成分的提取技术,成功从苎麻不同部位茎皮材料分别提取得到高质量总RNA,以用于转录组测序。
  转录组测序分别使用黑杆前期苎麻不同部位茎皮材料代表韧皮纤维不同发育时期,连接不同接头之后使用罗氏454 FLX+平台进行混样转录组测序,共得到1030057个reads,平均读长457bp。对测序结果进行拼接后,共得到58369条unigene,序列长度范围为90bp到7641bp,其中51025条(占87.42%)序列长度大于200bp,8025条(占13.75%)序列长度大于1000bp。最后,58369条unigene(13386条contig和44983条isotig)中有25071条unigene(7065条contig和18006条isotig)得到了有效的注释,共对应于6283条GO条目和3076条KO条目。
  通过对差异性表达基因、GO条目富集情况等分析表明茎皮上部样品在所有的样品中更为特殊,其所对应的苎麻纤维发育早期可能更容易受分子调控影响,从而影响苎麻纤维发育状况。在这之中,属于纤维素合酶基因家族的isotig01514_77、isotig06919_78、isotig06943_25和isotig07154_19,属于expansin基因家族的isotig10345_23、isotig01251_6和isotig02054_18,以及属于XTH基因家族的HRX1MBH01BLWDW_9、 isotig00610_25、 isotig01663_22、 isotig04660_8、isotig09773_10和contig04902_19在该样品相对于其余三个样品均为上调表达,表明这些基因可能参与苎麻茎皮上部样品中针对纤维发育的相关调控路径。
  2.使用同源序列克隆的方法,获得了五条苎麻expansin基因全长编码序列,并对表达量进行了初步研究。基于本实验室的三个转录组测序信息,克隆得到的expansin基因扩充至16个(12个属于α-亚族,分别命名为BnEXPA1-BnEXPA12;4个属于β-亚族,命名为BnEXPB1-BnEXPB4),共有22条(其中6个expansin基因在基因组中均有两个序列相异的克隆,分别命名为-1和-2)全长DNA序列(GenBank登录号:KY748166-KY748187)。序列分析表明,其外显子长度跨度较小(107bp-485bp)而内含子长度跨度较大(86bp-1540bp),cDNA全长分布为732bp-831bp,而DNA全长跨度为1040bp-4259bp。
  在随后对所克隆得到的expansin基因进行表达分析中,BnEXPA2、BnEXPA3、BnEXPA5和BnEXPA6在六个样品(茎尖、幼叶、成熟叶、茎皮上中下部)中的整体表达量和其它基因相比较高,BnEXPA12在这六个样品中表达量差异性最大,BnEXPA3、BnEXPA5、BnXA10和BnEXPB2在苎麻三季麻(头麻、二麻和三麻)不同时期(苗期、快速生长期、纤维成熟前期和后期)茎皮不同部位(苗期下部茎皮、快速生长期上部和下部茎皮、纤维成熟期上部、中部和下部茎皮)样品中的表达量和其它基因相比较高,BnEXPA11在上述所有样品以及三种胁迫处理(氯化钠、高温和低温胁迫)条件下表达量均极低。最后,BnEXPA1在不同胁迫条件下其表达量均显著上升,也是所有苎麻expansin基因中唯一一个在三种胁迫条件下相对表达量均显著上升的基因。与之相反,BnEXPA4、BnEXPA5、BnEXPA12、BnEXPB1和Bn EXPB3在三种胁迫条件下其表达量均显著下降。这些在表达量研究过程中呈现一定表达规律的基因都可作为候选基因在后续实验中优先得到进一步的详细研究。
  综上,本项研究主要亮点如下:
  1.优化了苎麻RNA提取技术,并用于转录组测序中;
  2.转录组测序取样方法为苎麻中首创,与纤维发育状态对应;
  3.首次对苎麻茎皮样品进行转录组测序,研究纤维发育分子机理;
  4.使用同源序列克隆方法得到五条苎麻expansin基因序列;
  5.整合多个转录组测序结果进行苎麻expansin家族基因克隆;
  6.得到一批可能参与苎麻抗逆以及纤维发育相关通路的expansin基因。
  以上结果既对苎麻纤维发育分子机理进行了初步研究,也为后续苎麻基因工程以及相关领域研究提供了范式和平台数据。
[硕士论文] 余康宁
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:为探讨川东北地区由于季节性干旱所引起的杂交稻避旱错峰延长秧龄移栽以及耐长秧龄品种筛选的相关问题,以参试杂交稻品种为材料进行田间试验,设正常秧龄(T1)、长秧龄(T2)和超长秧龄(T3)三个处理,研究这些杂交稻品种产量性状对不同秧龄的反应,并对其秧龄耐性做出初步评价。其结果如下:
  1、不同杂交稻品种茎蘖数对秧龄处理的反应表现出明显差异。与正常秧龄处理相比,长秧龄处理下杂交稻移栽后15天茎蘖数平均下降了14.53%,变化幅度为-25.06%~15.71%;最高茎蘖数平均下降了13.94%,变化幅度为-28.02%~6.83%。
  与正常秧龄处理相比,超长秧龄处理下杂交稻移栽后15天茎蘖数平均下降了7.04%,变化幅度为-23.50%~9.57%;最高茎蘖数平均下降了15.11%,变化幅度为-25.60%~-6.75%。
  与长秧龄处理相比,超长秧龄处理下杂交稻移栽后15天茎蘖数平均上升了10.06%,变化幅度为-11.39%~31.76%;最高茎蘖数平均下降了0.68%,变化幅度为-12.71%~12.40%。
  2、不同杂交稻品种产量性状对秧龄处理的反应表现出明显差异。与正常秧龄处理相比,长秧龄处理下参试交稻品种单位面积有效穗数平均上升了3.74%,品种间变化幅度为-11.7%~16.89%。穗着粒数平均上升了0.38%,品种间变化幅度为-15.89%~16.51%。穗实粒数平均下降了2.68%,品种间变化幅度为-18.58%~16.36%。结实率平均下降了3.01%,品种间变化幅度为-9.55%~2.61%。千粒重平均下降了2.70%,品种间变化幅度为-7.45%~1.54%。穗实粒重平均下降了5.41%,品种间变化幅度为-21.03%~10.68%。
  与正常秧龄处理相比,超长秧龄处理下参试杂交稻品种单位面积有效穗数平均下降了0.25%,品种间变化幅度为-14.9%~13.86%。穗着粒数平均下降了1.90%,品种间变化幅度为-16.1%~11.32%。穗实粒数平均下降了7.48%,品种间变化幅度为-21.52%~3.92%。结实率平均下降了5.61%,品种间变化幅度为-12.63%~-0.56%。千粒重平均下降了4.87%,品种间变化幅度为-11.67%~-0.47%。穗实粒重平均下降了12.01%,品种间变化幅度为-26.75%~0.51%。
  与长秧龄处理相比,超长秧龄处理下参试杂交稻品种单位面积有效穗数平均下降了3.64%,品种间变化幅度为-15.94%~10.67%。穗着粒数平均下降了2.02%,品种间变化幅度为-12.15%~15.06%。穗实粒数平均下降了4.62%,品种间变化幅度为-14.56%~11.85%。结实率平均下降了2.64%,品种间变化幅度为-10.28%~4.48%。千粒重平均下降了2.20%,品种间变化幅度为-10.34%~2.45%。穗实粒重平均下降了6.79%,品种间变化幅度为-16.34%~2.85%。
  3、不同杂交稻品种产量对秧龄处理的反应变现出明显差异。与正常秧龄处理相比,长秧龄处理下参试杂交稻品种产量平均下降了2.25%,品种间变化幅度为-2.28%~9.69%;超长秧龄处理下平均下降了12.49%,品种间变化幅度为-27.58%~-4.46%。与长秧龄处理相比,超长秧龄处理下平均下降了10.29%,品种间变化幅度为-25.66%~-0.62%。
  4、将穗着粒数、穗实粒数、穗实粒重、产量和千粒重等5个指标相对于正常秧龄的变化率作为秧龄耐性的综合筛选指标。筛选出了宜香优2115、内5优39、泸香优177和川优727等4个适宜长秧龄移栽的品种,蓉18优188、川优8377、川优6203、内7优39、德优4727、德香4103、Q优28、乐优808、内香6优498、辐优6688、宜香优7808、广优9939和龙优8号等13个在长秧龄处理下秧龄耐性较强的品种,蓉18优198、蓉18优662、蓉优918、乐优198和川谷优399等5个在超长秧龄处理下秧龄耐性表现较强的品种。
[硕士论文] 滕守振
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:植物叶片的叶绿素含量与叶片的光合作用效率以及产量潜力紧密相关,因此是作物的一个重要生理指标。但是,目前已克隆的控制叶绿素含量的基因大多来自拟南芥和水稻,在玉米中研究较少,因此本研究采用了全基因组关联分析和人工诱变两种方法,旨在玉米中找到控制叶绿素含量的基因。
  本研究发现玉米苗期第一片叶片的叶绿素含量和吐丝期穗位叶的叶绿素含量高度相关,且与后者相比具有更高的遗传力。进一步分析了287份玉米自交系的第一片叶的叶绿素含量,利用558,269个单核苷酸多态性分子标记进行全基因组关联分析,获得9个显著关联SNP位点和16个候选基因。通过候选基因的序列分析和功能预测,发现两个可能叶绿素含量相关的基因,包括拟南芥Tic22基因的同源基因和水稻衰老相关基因SAG12的同源基因。此外,利用人工诱变技术,找到叶片叶绿素含量发生变化的light green1(lg1)突变体,遗传分析表明lg1突变是单位点隐性突变。在lg1×B73 F2群体中用SSR标记将lg1定位在8号染色体分子标记SSR389和SSR352之间。然后对lg1突变体的基因组进行二代测序,确定lg1突变发生在脱植基叶绿素a加氧酶基因(cao)上,由于C突变为T,造成一个精氨酸突变为色氨酸。本研究不仅为进一步解析玉米叶绿素含量的遗传结构提供了理论基础,而且为玉米的选择育种提供了新的目标基因。
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