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[博士论文] 雷娜
园艺学(蔬菜学) 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:干旱胁迫与高盐胁迫是全球范围内严重影响农作物产量的两种主要非生物胁迫。对于生长调节而言,盐和干旱胁迫包括离子信号通路和渗透平衡信号通路。传统的育种方法耗时耗力,并且对于提高作物对高盐和干旱的耐力效率极低。为了探究非生物胁迫的抗性机理,前人从形态学、生理学、生物化学以及之后的分子水平等方面进行了大量的研究。目前,番茄已成为茄科的一种经济蔬菜作物,并作为双子叶植物基因研究的模式植物。属于一个多基因家族的膜联蛋白在植物胁迫反应和多种细胞过程中发挥着不可或缺的作用。在本研究中,我们从具有抗旱性的野生番茄潘那利(Solanum pennelli)克隆了AnnSp2,并在栽培种中对其进行了功能研究。主要研究成果如下:
  1、对AnnSp2进行克隆和测序,结果表明AnnSp2编码一个有316个氨基酸组成的膜联蛋白。
  2、通过实时定量PCR对AnnSp2表达谱分析,结果表明AnnSp2在叶片和花中大量表达,AnnSp2蛋白主要定位于细胞核。AnnSp2能够被植物激素以及非生物胁迫强烈诱导,如失水,高盐以及脱落酸。
  3、通过农杆菌介导的遗传转化,获得了16个AnnSp2过表达的转基因株系。
  4、对3个AnnSp2过表达株系进行了非生物胁迫的抗性鉴定。通过对发芽率、根系发育状况、存活率、叶片失水率和叶绿素含量等生理学指标的测定,结果表明过表达AnnSp2能增强番茄对干旱及盐胁迫的抗性。
  5、AnnSp2转基因植株在种子萌发期和幼苗期对脱落酸不敏感,这一现象揭示了转基因植株对胁迫抗性有所增强。
  6、此外,ROS的清除,叶绿素总含量的提高,脂质过氧化水平的降低,过氧化酶活性的增强(包括APX,CAT和SOD)以及脯氨酸含量的升高—这些现象均在AnnSp2超表达植株中被观察到,这和那些与胁迫相关的基因的在转录水平的变化联系紧密。
  7、通过与胁迫相关的基因表达量的变化而得到的关于发芽和幼苗实验的结果显示,超量表达AnnSp2基因的转基因番茄株系通过ABA信号调节与ROS的清除提高了对于盐与干旱的抗性。
[硕士论文] 徐进
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界公认的主要粮食作物之一,它的块茎不仅可以当作粮食作物,而且还可以用于工业生产淀粉等。在植物光合作用产生的碳水化合物,通过韧皮部筛管向储存库器官运输并积累的过程中,起到主要作用的就是蔗糖转运蛋白(Sucrose transporter)。双子叶植物中的蔗糖转运蛋白包括SUT1、SUT2和SUT4三类,主要功能就是对植物光合产物蔗糖的装载、运输和卸载过程的调节作用。在马铃薯中,StSUT1蛋白主要对蔗糖的装载进行调控,StSUT4蛋白主要对蔗糖的卸载过程进行调控,并且还与光周期相互作用来调节马铃薯植株的开花、茎长短和块茎形成,但是StSUT2蛋白的功能仍是未知的。根据国内外多年来对高等植物SUT2的研究分析来看,它的结构与葡萄糖信号感受器类似,因此推测SUT2有可能是蔗糖信号感受器而不是蔗糖转运体。
  本研究主要通过构建马铃薯StSUT2基因的干扰载体,并对其转化至马铃薯中,为对StSUT2蛋白进行功能分析奠定了基础。实验主要分为两部分:一是干扰载体的构建,用Gateway克隆技术可将StSUT2基因干扰片段快速重组到表达载体中,通过对重组子进行测序,确定为干扰表达载体;二是马铃薯遗传转化,将构建好的干扰载体通过农杆菌介导法转化至马铃薯块茎中,使其再分化产生含有干扰基因的转基因植株。取得的主要成果如下:
  (1)利用TOPO克隆,将扩增出的干扰片段整合到pENTR中,构建出入门载体命名为pENTR-SUT2。
  (2)根据Gateway克隆技术进行LR重组,根据入门载体与表达载体的attL和attR位点重组,构建出干扰表达载体pSUT2-RNAi。
  (3)用冻融法将干扰载体pSUT2-RNAi转至农杆菌GV3101中。
  (4)将干扰载体转化至夏波蒂(SHB)和陇薯3号(L3)等马铃薯品种的块茎中,通过卡那霉素筛选和PCR扩增检测,初步确定干扰基因已经成功转入马铃薯植株中。用实时荧光定量 PCR对转化株进行相对表达量检测表明,干扰基因已经转入马铃薯植株,并对StSUT2基因表达产生抑制作用。
[硕士论文] 吴婷婷
自然地理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:湿地土壤种子库是湿地植被自然更新与演替的种质资源,是湿地植被生态恢复的物质基础。土壤种子库的规模及其物种组成、多样性与丰富度特征等可用来评估湿地植被的恢复潜力,其储量与受损后相应生态系统的恢复速度成正比。本文以图们江下游不同类型湿地土壤种子库为研究对象,通过选取图们江下游四个类型湿地的七块标准样地,采用标准样地调查与取样,野外植被调查与室内种子库不同水分条件萌发控制试验相结合的手段,探究图们江下游不同类型湿地土壤种子库特征及其在湿地植被生态恢复过程中的应用潜力。
  主要研究结果如下:
  (1)图们江下游湿地各样地土壤种子库中优势物种地位突出,储量丰富,具有进行湿地植被生态恢复的种质资源潜力,土壤种子库的储量在垂直方向上基本呈现随深度增加而下降的趋势。本试验共出现物种60种,计植物幼苗数14723株,其中湿润处理条件下出现物种数46种显著高于沉水/淹水处理33种,但从萌发植物幼苗数量上看,沉水/淹水处理条件下种子库萌发数量占土壤种子库总数的60%,表明水文恢复在图们江下游湿地植被恢复过程中具有重要意义。
  (2)图们江下游湿地各样地地上植被群落物种组成较丰富,地上植被群落调查过程中共计出现植物79种,隶属28科58属,优势物种以禾本科、莎草科、菊科、蓼科类植物为主。各湿地样地地上植被群落单位面积内植被数量差异明显,湖泊型湿地地上植被密度最大,约1458株/m2。从植被群落的物种重要值来看,除沼泽型湿地与自然湖泊型湿地仍以以湿生植被:蔗草、密穗莎草、通泉草、雨久花为优势种外,其余湿地样地地上植被群落优势种都已趋向旱化,问荆、稗草等杂草类植物优势突出。
  (3)图们江下游湿地各样地土壤种子库中出现的植物科与地上植被群落调查时出现的植物科相似性系数达到80.77%。但各样地间物种相似性系数均较低,在7.14%-42.86%之间,表明地表植被与种子迁移过程受外界生境因子影响较明显,不同湿地类型植被恢复潜力存在差异,从数据分析结果来看,同等情况下图们江下游地区湖泊型湿地植被的恢复潜力较其它样地大。
  (4)图们江下游湿地各样地土壤种子库特征与地上植被群落物种组成结构特征在时间尺度上均存在差异,主要表现为:植被的物种数量增加,多年生物种比例与湿生植被物种比例均降低。从物种生物多样性指数来看,受人为干扰较小的沼泽型湿地生态系统土壤种子库与地上植被群落稳定性较好。
  (5)针对不同湿地类型的植被群落结构特征,在湿地植被生态恢复过程中应选取适合的修复技术,如:自然恢复法更适用于干扰程度在一定阈值内的区域;表层沉积物去除法,适用于受到强烈人为干扰的区域,但可能需要重播种;种子库移植法对主要依靠无性繁殖的物种恢复效果较好,但大面积施用存在困难。
[硕士论文] 韩艳婧
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:7S球蛋白(β-Conglycinin)是大豆种子贮藏蛋白的主要组分之一,是由α-(57~58KD)、α'-(57~72KD)和β-(45~52KD)三个主要亚基组成的三聚体糖蛋白,以上3个亚基均是大豆主要的致敏原。目前的研究表明,7S球蛋白亚基缺失突变体可以在除去致敏蛋白的同时,改良大豆蛋白的营养及加工品质,但是,各个亚基对大豆种子蛋白营养及加工品质的作用及贡献大小尚无定论,其分子机理尚未解析。到目前为止,国内尚没有见到具有中国大豆遗传背景的α'-亚基缺失型大豆新材料的相关报道,单一α'-亚基缺失的遗传效应尚未明确。本研究利用回交转育法获得了具有中国大豆遗传背景的α'-亚基缺失型大豆新品系以及近等基因系,并对其主要农艺性状、营养与加工品质进行全面系统的评价,明晰α'-亚基缺失遗传效应;对α'-亚基缺失基因进行初步定位,为该基因的分子标记辅助育种及图位克隆与功能验证奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴利用回交选育法获得12个具有中国大豆遗传背景低致敏蛋白α'-亚基缺失型大豆新品系:C0909、C4802、C4808、C4809、C4819、C4821、C4833、C4840、C5206、C5210、C5211、Cc5-7,以上各品系的α'-亚基缺失特性稳定遗传,C4802、C4808、C4833、C5210的单株产量显著高于亲本东农47;营养品质方面,Cc5-7的蛋白含量显著高于亲本东农47,C4802、C4840的油分含量显著高于亲本东农47,所有品系17种氨基酸组分含量不同程度升高,游离精氨酸含量成倍增加,游离丙氨酸、游离缬氨酸、游离蛋氨酸、游离苯丙氨酸、游离组氨酸等5种游离氨基酸组分含量显著升高;加工品质方面,各品系豆腐产品的凝胶硬度和豆腐蛋白浓度显著增加,粘性等质构特性得到显著改善。⑵以东农47为轮回亲本,通过回交6代,自交4代(BC6F4),构建了一套α'-亚基缺失型近等基因系群体,将其命名为NIL-Δα',遗传效应分析结果表明:单一α'-亚基缺失提高了近等基因系大豆的株高和单株产量,α'-亚基的缺失导致17种氨基酸和游离氨基酸组分含量不同程度的升高,氨基酸和游离氨基酸总量升高;加工品质方面,α'-亚基缺失导致豆腐制品凝胶硬度显著增加,豆腐干重和豆腐蛋白浓度显著升高,弹性、咀嚼性等质构特性得到显著改善。⑶利用BSA(Bulked segregant analysis)法组建基因池,对α'-亚基缺失基因进行初步定位,通过SSR(Simple Sequence Repeat)标记分析,mapmaker3.0软件作图,将α'-亚基缺失基因(cgy-1)初步定位于大豆第10号染色体(O连锁群)上,介于Sat307和Sat231之间,α'-亚基缺失基因(cgy-1与Sat307间的遗传距离约为6.1cM。
[博士论文] NGUYEN BA HOANH
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一,为世界一半以上的人口提供主要食物。然而,全球气候的不断变化给水稻生产带来重大挑战,特别是干旱环境,这严重影响了世界经济和粮食安全。对水稻的抗逆性状进行遗传改良是应对这一状况的主要策略之一。根据已有报道,水稻抗旱性状是由多基因控制的,因此,多基因聚合的策略在理论上可以用于改善水稻的抗旱性。然而,目前这种策略仍然缺乏实验证据。在本研究中,我们通过MISSA(multiple-round in vivo site-specific assembly)系统组装了从水稻中分离的几个干旱应答基因,并且通过农杆菌介导转化法将聚合载体以及对应的单基因超表达载体导入KY131水稻品种中。之后,我们鉴定了T1代转基因植株中的目的基因转录水平和插入片段拷贝数,并选取单拷贝、超量表达目的基因的转基因家系和阴性转基因材料(KY131-N)用于大田干旱胁迫的预实验和之后的进一步实验中。
  在预实验期间,通过对叶片死亡程度和结实率的目测,我们发现共表达两个基因OsbZIP46CA1(编码bZIP转录因子OsbZIP46的组成型激活形式)和SAPK6(编码蔗糖非发酵1[SNF-1]相关蛋白激酶家族SnRK)的转基因材料在成株期的抗旱性明显高于相应的单基因超表达材料(CA1-OE与SAPK6-OE)和KY131-N。
  与相应的超量表达单基因的材料以及KY131-N相比,共表达两个基因的材料(称为XL22)对ABA的敏感性有明显增强。这一结果表明OsbZIP46CA1和SAPK6可能在水稻对ABA的应答过程中存在加性效应。
  利用大田中的农艺性状进一步对XL22,CA1-OE,SAPK6-OE超量表达转基因材料和KY131-N的抗旱性进行评估。结果表明XL22在中等干旱胁迫条件下具有更高的产量,干重,总粒数和实粒数。苗期的抗旱性和失水率试验表明,转双基因的株系XL22的耐旱性明显优于转单基因的株系CA1-OE和SAPK6-OE。此外,RNA-Seq的表达谱分析显示,在干旱处理的XL22家系中,涉及应答逆境的许多基因被特异上调,并且在CA1-OE和SAPK6-OE中激活的一些逆境相关基因是不同的,这可以部分地解释这些材料对于抗旱性的不同性能。
  另外,我们还在苗期对上述超量表达材料和KY131-N的高温(42℃)和低温(4℃)胁迫的耐受性进行了测试。结果显示,在以上逆境处理后,XL22与CA1-OE、SAPK6-OE以及KY131-N相比具有更高的存活率。此外,在高温胁迫条件下,我们还发现XL22植株的丙二醛(MDA)含量和相对离子渗漏率显著低于其他材料。这表明XL22植株在高温胁迫条件下膜脂质氧化程度更低,部分解释了其更强的高温抗性。以上结果表明共表达这两个基因可以显著增强水稻对高温以及低温环境的抗性。
  综上所述,本研的结果表明,将合适的抗逆相关基因进行聚合是水稻抗逆性状遗传改良的有效的策略。
[硕士论文] 胡美玲
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:非生物逆境胁迫严重影响棉花的生长发育、产量及纤维品质,培育抗逆的棉花新品种对棉花生产具有重要的意义。NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物对非生物逆境的响应。本研究基于前期棉花干旱胁迫表达谱分离到一个显著诱导表达的NAC基因GhNAC3,对其在棉花中参与响应干旱和盐胁迫的功能进行初步鉴定和机制探索,主要结果如下:
  我们在棉花中鉴定到232个NAC家族转录因子,并基于公共数据库表达谱数据对其组织表达模式和逆境诱导表达模式进行了分析。同时,我们从陆地棉中克隆到GhNAC3基因,氨基酸序列多重比对结果显示该基因具有保守的NAC结构域;亚细胞定位实验表明GhNAC3编码一个核定位蛋白;酵母反式激活实验揭示GhNAC3 BD结构域(1-160aa)不具有转录激活能力,AD结构域(161-298aa)具有转录激活能力。组织表达模式分析发现GhNAC3在根和花中优势表达;非生物逆境表达模式分析表明,GhNAC3受PEG和NaCl诱导显著上调表达。另外,对GhNAC3启动子的cis-element分析,发现该基因的启动子区域具有响应干旱、盐和ABA的一些顺式作用元件,如 ERD1(early responsive to dehydration)、 DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat)等。
  在拟南芥中超表达GhNAC3,萌发实验及根长实验表明超表达该基因可以增强转基因拟南芥对渗透压胁迫和盐胁迫的耐受性,对ABA的敏感性降低。利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)沉默GhNAC3的表达,ABA含量在干涉材料中显著降低;干旱处理后,在干涉材料中积累较多的过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA);离体叶片失水处理、自然干旱和叶盘实验表明在棉花中沉默该基因可以降低棉花对干旱和盐胁迫的耐受性。通过农杆菌侵染棉花下胚轴转化技术,我们获得了稳定转化的超表达材料,与阴性分离材料和野生型一起进行PEG6000模拟的渗透胁迫实验,结果表明,超表达材料较对照材料表现出更好的生长势。
  以上结果表明,GhNAC3是一个参与调控棉花响应非生物逆境的基因,我们推测该基因可能通过介导ABA信号参与棉花响应干旱和盐胁迫。本研究棉花抗逆育种提供基因资源和理论基础。
[硕士论文] 赵午斌
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以含有非洲栽培稻核基因的非洲新稻和非洲栽培稻基因渗入系共50份材料及其与普通栽培稻品种胜泰1号测交的部分种间杂交F1材料作为研究对象,通过对水稻结实率、单株有效穗数、千粒重等11个农艺性状的的考察分析,结合亲本的简化基因组测序(RRGS),对其农艺性状和杂种优势进行了全基因组关联分析(GWAS),其目的是为了开发分子标记,为进一步选育综合农艺性状好、杂种优势强的部分种间杂交稻新品种提供理论和实践依据。主要研究结果如下:
  1.对海南、武汉两地种植的亲本和杂交种的农艺性状及其杂种优势考察分析表明,在武汉部分种间杂交种F51,F55,F57,F59,F69,F81,F83的杂种优势较强;在海南部分种间杂交种F9,F31,F57,F63,F83,F91,F17-1的杂种优势表现较强;部分种间杂交种F57和F83在两地表现均较强的杂种优势。
  2.对50份亲本材料DNA样品的产出数据进行统计,样品clean data数据量均达标(每个样品clean data不低于0.52G),Clean data中已经不存在低质量碱基(Q≦20)占比20%以上的reads,测序质量达到较高水平(所有合格样品Q20不低于99%,GC含量在40%左右,大部分样品的比对率在95%以上,覆盖度在15%左右)。
  3.根据对50份亲本材料的群体结构分析,可分为4个组,Group1为非洲新稻;Group2、3、4为非洲栽培稻基因渗入系。以结实率、千粒重、有效穗数、穗粒数和单株产量为主要参考,对非洲栽培稻基因渗入系产量性状的多重比较结果,海南表现依次为Group4>Group2>Group3>Group1武汉表现依次为Group4>Group3>Group2>Group1。结合海南武汉两地的数据可以看出,非洲栽培稻基因渗入系Group2、3、4表现均优于非洲新稻Group1,最好的为Group4。
  4.对50份水稻亲本材料重要农艺性状数据进行全基因组关联分析,采用混合线性模型,共检测到与7个农艺性状(粒长、籽粒长宽比、千粒重、播始历期、穗长、穗粒数)相关的27个QTLs(qGL-1-2、qLWR-3-1、qTWG-1、qDSH-1、qSL-7、qGNPS-6、qSSR-7等),分别分布在9条染色体(Chr1,Chr2,Chr3,Chr5,Chr6, Chr7, Chr8, Chr9, Chr11)上。
  5.对50份测交种农艺性状杂种优势数据进行全基因组关联分析,采用混合线性模型,共检测到与4个农艺性状(粒长、籽粒长宽比、穗长、株高)杂种优势相关的23个HLs(hSL-1、hPH-2、hLWR-1、hGL-5等),分别分布在Chr1,Chr2,Chr3, Chr4, Chr5, Chr8, Chr9, Chr11, Chr12上。
[硕士论文] 张亚玲
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,从1996年到2015年的20年间,全球转基因作物累计种植面积达到20亿公顷,其中,转基因棉花累计种植面积达3亿公顷。转基因作物为农户及消费者带来的利益不言而喻。转Bt基因抗虫棉的应用及推广有效地解决了棉铃虫害对棉花生产的影响。随着研究的不断深入,发现其存在几个问题:一方面,Bt基因在棉花体内的表达存在时空差异;另一方面,目前抗虫棉花品种选育普遍采用的方法是利用获得转基因应用安全证书的品种作供体,与非转基因棉花杂交,转Bt基因抗虫棉品种间Bt蛋白表达量差异较大,尤其是其杂交后代Bt蛋白的表达量差异很大,对棉花的抗虫育种造成很大困难;第三,抗虫基因单一,现有的抗虫基因主要用于防治鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella),使得棉田其他害虫如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)等对棉花的危害逐渐加重,其中,甜菜夜蛾于2001年被列入重要害虫的潜在爆发名单。
  本研究测定了不同抗虫棉花品种、不同遗传背景棉花品种杂交F1代及不同熟性棉花品种杂交F1代棉花Bt蛋白表达量的差异,探究Bt基因在棉花中的表达及遗传规律,为抗虫棉的育种工作提供理论依据;在保证Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时,尝试将Cry1C*基因转入棉花,研究其对棉花害虫的控制效果,保证抗虫棉花的健康发展。主要结论如下:
  1)连续两年对6个不同抗虫棉花品种不同组织器官中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量进行测定及室内生物测定,结果表明:不同棉花品种间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量及棉铃虫幼虫校正死亡率均存在显著差异,其中冈383和鲁6269两个棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量和棉铃虫幼虫校正死亡率均较其他几个品种高,Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在不同品种组织中的表达规律大体相同:苗期叶片>蕾期叶片>铃期叶片>蕾期小蕾>铃期小铃;
  2)不同遗传背景棉花杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但与抗虫亲本相比,F1代显著低于抗虫亲本;二代、三代棉铃虫幼虫校正死亡率在不同杂交组合间存在显著差异,说明遗传背景对棉花的抗虫性有影响。
  3)不同熟性棉花品种杂交F1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显著,但F1代Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量显著低于抗虫亲本鲁6269;棉花熟性与各组织中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量、棉铃虫幼虫校正死亡率均不存在显著的相关性,说明棉花的熟性对其抗虫性没有显著的影响。
  4)得到转Cry1C*基因棉花T0代2株(能收到种子的),后续的转化工作仍在继续,T1代阳性植株22株,初步筛选到Cry1C*-5-7、Cry1C*-5-8、Cry1C*-5-14三个Cry1C*蛋白表达量较高,抗虫性好的植株。
[硕士论文] 李南南
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物的生长和抗性通常处于对立的地位,植物免疫系统的激活通常影响生长发育,从而影响作物的产量,因此抗病基因在抗病育种上的应用需要有精确的时空表达调控元件,一方面可以使作物获得抗性,另一方面不影响作物的产量。组织特异型启动子使抗性基因仅在特异的组织中表达,从而使植株获得抗性的同时能够正常生长。
  依赖于钙离子的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)不仅在生长发育中具有重要作用,在植物的免疫系统中也具有重要的作用。前期工作是对棉花参与JA合成的GhOPR3(1,2-氧-植物二烯酸(OPDA)还原酶)酵母双杂交结果进行分析,获得一个与GhOPR3互作的蛋白,同源比对分析后发现该蛋白的编码基因与GhCPK33like相似度度最高,因此命名为GhCPK33。
  本研究开展了棉花根优势表达启动子的分离与鉴定,并对GhCPK33的在棉花抗病方面的功能进行了初步探究,取得的主要结果如下:
  1.我们通过海岛棉组织表达数据库分析,筛选到22个可能在根中优势表达的基因,并克隆了这些基因。通过PCR扩增,获得了2个根优势表达的启动子,构建了表达载体分别转化拟南芥和棉花。
  2.表达分析发现GhCPK33在棉花的各个组织中均有表达,接种黄萎病菌后GhCPK33的表达变化不明显;Me-JA处理1h时该基因的表达量明显增加,但对于外源SA的处理,该基因的响应没有明显的规律。
  3.利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中抑制GhCPK33基因的表达后,增强了植株对黄萎病的抗性;同时发现在GhCPK33表达量下调的棉株中内源茉莉酸活化形式荣莉酸异亮氨酸的含量升高,并且JA信号路径的关键基因被激活;接种死体营养型真菌-灰霉菌后发现,GhCPK33表达量下调后增强了植株对灰霉菌的抗性。因此推测该基因可能通过影响茉莉酸信号路径来调控棉花对黄萎病的抗性。
  筛选根中优势表达的启动子,利用该启动子驱动抗性基因,如GhCPK33,在根中优势表达,是目前获得抗性品种的一个好的方法和方向。
[硕士论文] 李群
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:菜籽油是我国的传统食用油,因其较高的营养价值而得到国民的青睐。但是,目前我国每年进口的菜籽油占需求的30%以上。提高油菜的含油量,推广高含油量品种是提高我国菜籽油自给率的有效手段。一般地提高含油量的办法是通过改变脂肪酸合成路径中某些基因的表达来促进脂肪酸合成,从而达到增加油脂积累的目的,如何降低TAG在作物中合成后的分解对于油脂的积累也显得十分重要的。GDSL型酶是一类广泛存在于动植物中的水解酶,可以水解硫基酯、芳香酯、磷脂和氨基酸等多种类型的底物。本研究主要在拟南芥中鉴定了AT1G71250(GDSLlipase like,GLIPL)和AT5G15720(GDSL-motif lipase7,GLIP7)及油菜同源基因(BnGLIPL,BnGLIP7)对含油量的影响,结果如下:
  1)在油菜中克隆到GLIPL以及GLIP7的同源基因的CDS全长和完整启动子。
  2)在几种芸薹属植物中比对同源基因的DNA和氨基酸序列,发现GLIPL和GLIP7在芸薹属不同植物中的保守性非常高,序列相似度达90%,且都存在4个保守的结构域,也预示两个基因具有相似的功能。
  3)对拟南芥根、茎、叶、花蕾、角果做qRT-PCR,发现GLIPL在拟南芥各器官中都有不同程度的表达,在开花后4天的角果中表达量显著提高;对GUS阳性苗染色发现:BnGLIPL在萌发的种子、花器官以及发育的种子中表达量比较高;BnGLIP1在幼苗、花序以及幼嫩角果中有明显的表达。
  4)在拟南芥中得到GLIPL的纯合突变体;构建GLIPL以及GLIP7油菜同源基因的含双35s启动子的CDS过表达载体并得到阳性单株。
  5)通过检测过表达株系、纯合T-DNA插入突变体以及野生型的种子含油量发现:BnGLIPL比对照含油量下降9.54%,达到极显著水平;突变体与对照相比含油量上升7.63%,达到极显著水平;BnGLIP7的过表达株系含油量比对照低4.66%,差异显著。
[硕士论文] 王宏蕾
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:胞壁相关的类受体蛋白激酶WAKs胞外结构域可以绑定细胞壁果胶成分,能够感受胞壁结构发生变化的信号并参与植物生长及免疫的的过程。根据本实验室前期研究发现的一种受多种病原菌共同诱导表达的蛋白激酶[1]6683,推测该激酶可能是棉花响应广谱抗性的蛋白。聚类发现其与拟南芥胞壁相关的类受体蛋白激酶AtWAK3同源度较高,再将其于本课题组海岛棉数据库进行序列分析,将其在棉花中编码蛋白的基因进行克隆并命名为GbWAK3。对GbWAK3有关抗病作用研究的主要结果如下:
  表达分析表明GbWAK3在海岛棉不同组织中均有一定程度表达,其在棉花的根部组织中表达量最高,叶部组织次之。通过生物信息学方法对棉花接种黄萎病菌后GbWAK3受病原菌诱导的表达模式进行分析发现:海岛棉中GbWAK3受黄萎病菌诱导表达;外施SA处理后,GbWAK3表达变化并不明显;外施茉莉酸甲酯后,GbWAK3表达量迅速上升。因此GbWAK3在海岛棉根部优势表达,并且受黄萎病菌诱导,其表达水平受外源茉莉酸甲酯诱导迅速上升。
  利用病毒介导的基因沉默技术抑制GbWAK3表达后,海岛棉对黄萎病的抗病性降低;同时拟南芥突变体对黄萎病菌也更加感病。表达分析发现抑制棉花GbWAK3表达或拟南芥中wak3突变均导致JA路径相关基因和木质素合成相关基因的表达量降低,同时JA含量和木质素含量明显降低。接种灰霉后,抑制GbWAK3表达的棉花叶片发病更严重。以上结果表明GbWAK3可能通过调控JA信号路径及木质素代谢影响棉花免疫反应。
[博士论文] 马孝松
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:水稻(Oryza sativa L.)是最重要的粮食作物之一,全球一半以上人口以水稻作为主粮。但水稻抗旱性差,水稻生产耗水量大,随着全球气候变暖,干旱、高温等极端环境气候对水稻生产造成了极大的威胁,因而研究水稻的抗旱性,培育节水抗旱稻尤为重要。
  尽管水稻抗旱性研究已经取得了重要进展,发现了一些抗旱基因,同时也培育了一些抗旱品种。但是水稻的抗旱性是复杂的数量性状,而且水稻有多种不同的抗旱策略,因而关于水稻的抗旱性仍然有很多未解之谜待我们去探索。
  本研究尝试两种不同研究方法去发现一些新的水稻抗旱基因和探讨水稻的耐旱机制:一、通过对水稻微核心种质和节水抗旱核心资源的全基因组关联分析,发掘水稻种质资源中存在的抗旱性位点;二、利用转录组学和代谢组学相结合的方法探讨水稻的耐旱机制。主要研究结果如下:
  1.对270份种质资源进行抗旱性鉴定,发现水稻的株高、生物量、单株产量、穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、结实率、每穗颖花数、叶长、叶宽等表型性状都显著或极显著受到干旱胁迫的抑制,干旱胁迫使抽穗期极显著延迟,而叶绿素含量(SPAD值)则是受到干旱胁迫诱导上升。
  2.分别采用土壤水分梯度鉴定法、桶栽试验法、“篮子”实验法对14份综合抗旱性较好的水稻品种进行复原抗旱性、耐旱性和避旱性鉴定,发现6个品种属于避旱品种,3个品种属于耐旱品种,1个品种属于复原抗旱品种,2个粳稻品种同时具有较高的耐旱性和避旱性,2个籼稻品种同时具有避旱性、耐旱性、复原抗旱性。粳型旱稻品种IAC1246的综合抗旱性、避旱性与粳型旱稻品种IRAT109接近,但是耐旱性极显著强于IRAT109。因而IAC1246既可以作为水稻耐旱性研究的遗传材料,也可以作为水稻耐旱性改良的亲本。
  3.通过全基因组关联分析定位到sd1、GH3-2、OsGA2ox3、OsSAP11/OsDOG、OsGNA1、OsCYP51G3、OsRRMh、OsPYL2、OsGA2ox9等控制株高、抗旱性的已知功能基因,在抗旱系数关联位点附近发现了28个可能参与抗旱的候选基因,其中,OsPYL2、OsGA2ox9与抗旱性或者根系发育有关。本研究对候选基因OsRLK5进行了基因敲除,突变体的失水速率更快;在干旱条件下,突变体的结实率、产量等相关性状都显著或者极显著低于野生型。
  4.IAC1246具有更强的渗透调节能力和抗氧化能力,在干旱胁迫条件下枯死叶率极显著低于IRAT109,相对光合速率(旱/水)高于IRAT109,因而在干旱条件下形成较高的产量。通过转录组分析发现IRAT109水/旱处理间的差异基因数量多于IAC1246,而且二者共有的差异基因只占少部分。KEGG富集分析表明,在严重干旱胁迫期间,IRAT109的差异基因被显著富集在糖代谢和氨基酸代谢通路;而IAC1246的差异基因被显著富集在谷胱甘肽代谢、黄酮和类黄酮合成代谢、抗坏血酸代谢、类胡萝卜素代谢等抗氧化相关代谢通路。GO富集分析表明,不同时期IRAT109的差异基因都能被显著富集到水通道活性相关基因,而IAC1246在任何时期的差异基因都不能富集这一GO分类。表明在干旱胁迫期间IAC1246通过提高抗氧化能力来应对干旱胁迫,而IRAT109则通过调节水分运输来应对干旱胁迫。
  5.与光合作用相关的差异基因在两个品种中存在明显不同的调控模式。在干旱胁迫早期(Period I)绝大部分光合作用相关的差异基因在IAC1246中呈上调表达趋势,而在IRAT109中呈下降表达趋势。而且叶绿体基因在IAC1246和IRAT109中也呈现出类似于光合作用相关的差异基因的表达模式。
  6.在IRAT109中检测到的差异代谢物多于IAC1246,共有的差异代谢物仅有9个,而且相同差异代谢物在不同品种中含量变化模式不同。特别是阿魏酸(光合保护剂)和4-羟基肉桂酸的含量在IAC1246中受到干旱胁迫而被诱导上升最为明显,而在IRAT109中的含量变化不大。
[博士论文] 杜红园
植物营养学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜是我国主要的油料作物,需磷多,对缺磷敏感,最大栽培区(长江中下游)又位于我国土壤磷缺乏或严重缺乏的地区。因此,研究甘蓝型油菜磷营养高效的遗传机理,对于甘蓝型油菜磷营养的遗传改良具有重要的理论和实践意义。含SPX保守结构域的基因对体内磷稳态的调节及磷信号调控的重要性在拟南芥和水稻中均有报道,但在其它作物中鲜有研究。本研究在全基因组水平上鉴定了甘蓝型油菜中所有含SPX保守结构域的基因(BnaSPXs),分析了SPX家族各成员的序列特征和响应磷胁迫的表达谱,并将BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1作为候选基因,对其潜在的调控磷信号的功能进行了研究。同时,以缺磷特异诱导表达基因BnaC3.SPX3为对象,对植物响应低磷的转录调控机制进行研究。获得的主要结果如下:
  1、甘蓝型油菜SPX超家族基因成员的鉴定
  甘蓝型油菜基因组中共有69个含SPX保守结构域的基因(BnaSPXs),其中67个基因不均匀地分布在甘蓝型油菜的18条染色体上,且大部分基因位于染色体的臂末端,预示着它们有很高的基因重组概率。A9染色体上分布最多(11个),A4染色体上分布最少(1个)。利用甘蓝型油菜和拟南芥SPX蛋白序列构建的系统进化树显示,SPX基因分成了4个亚家族,即SPX(11个成员)、SPX-EXS(43个成员)、SPX-MFS(8个成员)、SPX-RING亚家族(7个成员)。基因结构及蛋白保守结构域分析进一步证实了系统进化树结果的可靠性。对BnaSPXs基因启动子序列中的顺式作用元件进行分析,发现SPX亚家族基因成员(除去BnaSPX4s)的上游启动子中均含有2-4个P1BS(GNATATNC)元件。
  2、甘蓝型油菜SPX基因响应低磷胁迫的表达模式
  甘蓝型油菜苗期地上部和/或根部响应磷饥饿的转录组数据中,共检测到50个BnaSPXs基因的表达。其中,SPX亚家族基因(除去BnaSPX4s外),均受到磷饥饿的诱导。进一步的qRT-PCR表明,这种诱导具有持续性和可逆性。低磷下甘蓝型油菜不同组织部位的定量表达结果显示,甘蓝型油菜多倍化产生的重复基因间有不同的表达模式,说明在长期的进化过程中重复基因间产生了功能分化。
  3、甘蓝型油菜BnaAZSPX1和BnaC3.SPX1基因响应低磷的功能
  BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1在低磷胁迫下均受到诱导表达,且均为细胞核定位蛋白,但是在低磷胁迫下有不同的表达模式。pBnaA2.SPX1∷BnaA2.SPX1和pBnaC3.SPX1∷BnaC3.SPX1拟南芥转基因材料在正常磷(1000μM)和低磷(50μMPi)条件下的表型分析显示:低磷胁迫下pBnaA2.SPX1∷ BnaA2.SPX1转基因株系地上部干重和磷含量均低于野生型,许多磷饥饿诱导表达基因均受到显著抑制,表明BnaA2.SPX1是磷信号网络中的负调控因子。然而,BnaC3.SPX1的转基因材料与野生型相比,表型无明显变化。
  4、甘蓝型油菜BnaC3.SPX3的调控模式
  本课题组前期研究结果表明,BnaC3.SPX3为缺磷特异诱导表达基因,并且启动子上游-746至-326区域存在新的响应低磷胁迫的顺式作用元件。通过对该区域序列的分析,发现其中含有4个P1BS-like序列,即P1BS-like1(CTATATAC,-337/-330)、P1BS-like2(GTTTATAC,-387/-380)、P1BS-like3(ACATATGC,-672/-665)和P1BS-like4(GGGTATGC,-708/-701),所以命名该段序列为LZ(Like Zone)序列。LZ的缺失分析表明近端的两个P1BS-like元件及其边框序列(LZ5△)具有独立响应低磷胁迫的能力。此外,该DNA序列保留了BnaC3.SPX3响应Pi饥饿诱导的快速性、持续性和可逆性特点。进一步通过GUS组织化学法研究LZ5△序列响应低磷胁迫的表达模式,发现LZ5△∷GUS转基因拟南芥的地上部、根、花器官及荚果中均有报告基因的表达。LZ5△内含的两个P1BS-like元件和边框序列对其增强子的功能是必需的和充分的。双荧光素酶检测结果表明,该DNA序列能与PHR1、PHL1、PHL2和PHL2等MYB-CC家族转录因子成员结合并受到它们的转录激活调控。
  综上所述,本研究首次从全基因水平上分析了甘蓝型油菜中SPX家族基因的进化和响应低磷胁迫的表达谱,为后期BnaSPXs基因功能的深入研究奠定了基础。两个BnaSPX1s旁系同源基因在拟南芥中的功能差异可能由启动子差异所导致,显示异源四倍体物种在进化过程中同源基因功能的分化。BnaC3.SPX3启动子的缺失分析揭示近端的P1BS-like/P1BS-like及其边框序列组成的结构具有独立响应低磷胁迫的能力,并且这种结构是P1BS元件的“助推剂”,能够协助P1BS元件高效启动缺磷响应基因的表达。
[博士论文] 唐友
农业工程;农业电气化与自动化 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:全基因组选择GS(Genomic Selection)也叫基因组预测GP(Genomic Prediction)是一种用于计算基因组育种值GEBV(Genomic Estimated Breeding Value)的方法,估算精准育种值需要检测覆盖所有全基因组水平遗传标记假设,然后对其个体进行评估。当前全基因组选择的方法非常多,如基于贝叶斯模型的方法(BayesianA、B、C、lasso等),还有基于最佳线性无偏预测BLUP(Best Linear Unbiased Prediction)模型的方法(gBLUP,rrBLUP等)。每种预测方法计算原理不同,对于表型性状预测效果有很大差别,所以预测选择适合的方法是提高最大精准值Accuracy最好的途径,其基因组育种值是作为育种家育种的重要参考。
  本文研发了一个新基因组选择方法mMAP(Mining the Maximum Accuracy ofPrediction)是将当前流行的基因组选择方法建立方法库,然后去预测运算大量不同的物种性状,采用交叉验证得到精准值,形成具有参考价值的知识库。新的物种性状根据知识库采用挖掘技术去选择最优GS方法在预测GEBV中指导育种分析。现在知识库里面有三百多种物种性状测得精准值,并不断有GS方法加入到方法库,再将预测新物种性状精准值累积到知识库中。mMAP方法具体研究实现过程及效果:
  (1)对于新物种性状预测,通过引入数据挖掘技术应用到基因组方法的选择上,将聚类分析处理知识库与多种流行的基因组预测方法相结合,目的是应用最少的基因组预测方法算出预测精准值最高。根据提供的三组知识库数据,真实预测累积数据、两组模拟知识库数据之间分别符合正态分布和随机分布,分别在92.27%、93.40%和90.2%以上找到该表型对应GS方法预测精准值的最高。
  (2)预测精准值运算采用统计学中交叉验证(Cross validation)提高验证精准值的效率。验证设计采用随机分5组,以80%已知表型数据作为训练群体,预测20%未知表型数据,然后重复100次以上验证去预测精准值基本上覆盖了所有假设,将其误差降到最低。也将交叉验证分组进行不同设置扩展实验,如3、5、10、20等,再重复100次以上其Accuracy接近稳定。
  (3)确定新表型性状选择GS方法的最佳时机,本研究设计了聚类中心最远、最近收敛方法去检验找到新预测表型最适合的GS方法。通过实验设置初始聚类分组重复100次以上使得初始知识库处理聚类核心比较稳定,然后在收敛时根据距离每组聚类核心最近位置值和最远边缘值查找,使得最新GS方法预测Accuracy将其临时组合到知识库,然后迭代收敛检验直到连续两次内没有新GS方法产生,避免了偶然性。通过真实数据检验对于新性状查找大概迭代3次左右即可找到最佳方法,迭代本身时间仅几秒钟。
  (4)每种GS方法都有独立的实现包,只需要将聚类产生的新GS方法和物种性状传到包里进行预测。而且各个包之间相对独立,通过主线程对聚类结果进行分别调用,其结果不会相互影响,经过比对结果,继续收敛。通过独立包的设计达到方法执行相对独立,保证数据安全和缩短运行时间。
  (5)采用面向对象技术实现mMAP研发,可以通过多线程实现独立包调用。通过引入操作系统底层封装技术Docker,直接调用Linux服务封装简化操作系统内核形成Docker容器,实现多线程应用。将容器封装到WEB环境,通过B/S操作访问模式,提供服务为育种家随时随地进行运算,结果会自动生成分析报告和育种值。该平台已经可以远程应用,并在2017年1月PAG(The Plant and Animal Genome)大会上进行了展示。
  (6)提供给mMAP运算的基因型数据可以是已发表公共的数据,也可以由原始测序数据转换得到。因此高通量测序数据转换基因型数据作为输入接口,整合到mMAP计算平台中构建一个完整体系,目的是可以降低原始数据存储空间、缩短转换时间以及高效服务育种业务。目前高通量测序原始数据(fastq格式)比对参考基因组序列(fasta格式),通过bowtie、samTool、GATK等工具进行数据转换、calling SNPs等操作,然后再变换成可用的基因型文件如Hapmap、Numeric Genotype等格式为后续分析服务。但是高通量测序原始数据太大,转换时间太长,整个处理过程占用大量资源。
  针对运行时间和占据空间问题,本研究设计了一个基因型数据处理管道,目的是提高效率,主要涉及算法技术和效果:HDF5数据格式替代fasta作为参考基因组,占空间小,比对速度较快;由于处理过程中大量的中间数据产生影响其效率,本研究设计一种高效双索引文件格式来存储差异基因位点数据,根据差异数量减少中间文件占用空间;由于生成SNP及基因文件都占据大量空间,引入gZIP压缩方法,能将大型基因数据文件压缩到50倍以上,而且编写方法直接调用压缩数据和还原的SNP数据,其操作与源数据效果相同。为了提高调用及转换基因型数据过程效率,对于变换基因型数据存储形式采用压缩格式,并提供很多灵活的操作接口,方便后续分析统计。整个管道采用面向对象技术研发,实现并行处理,并提供数据接口服务与mMAP整合在一起。
  通过mMAP方法预测很多物种性状,根据设置的条件可以找到最优合适的GS方法,并调用生成育种值,为育种家提供直接帮助。通过管道研究,能够完成大批高通量原始测序数据的转换,引入并行运算和相关技术可以完成基因大数据处理模式,并对遗传领域后期数据分析(如全基因组关联分析GWAS和GS)提供基础服务。
[硕士论文] 梁冬
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:大豆异黄酮是主要存在于大豆中的一种酚类次生代谢产物,因其对人类和植物具有重要的生理功能而备受关注。大豆异黄酮的代谢途径是苯丙氨酸代谢途径的一个分支,而在苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸解氨酶PAL(phenylalanine ammonia-lyase)是一个关键酶和限速酶。本课题组前期研究发现PAL基因的相对表达量与大豆异黄酮含量具有明显的协同增减趋势,并且在PAL基因家族成员时空表达模式分析中发现,PAL2-3(XM_003542493)基因是PAL基因家族中相对表达量较高的主要表达成员之一。本试验通过基因工程技术手段克隆大豆中PAL2-3基因;构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPAL2-3;根据RNAi干扰技术原理构建RNAi干扰植物表达载体pFGC5941-GmPAL2-3;将将构建好的重组载体质粒转化到根癌农杆菌EHA105中;采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法获得转基因植株,对获得的阳性转基因植株进行PAL2-3基因相对表达量分析;并对转基因植株成熟大豆籽粒进行异黄酮含量测定;分析PAL2-3基因表达量对大豆异黄酮含量的影响,来研究PAL2-3基因的功能。
  本研究主要内容包括:⑴成功构建了植物过表达载体pCAMB IA3301-GmPAl2-3和植物RNAi干扰载体pFGC5941-GmPAL2-3,并且成功的转化到了根癌农杆菌EHA105中。⑵本试验获得6株不同株系的过表达转基因大豆植株和4株不同株系的RNAi干扰转基因大豆植株。⑶在过表达植株中PAL2-3基因的表达量均高于对照植株的表达量,是对照植株表达量的5.11~11.24倍;RNAi干扰植株中PAL2-3基因的表达量均低于对照植株的表达量,是对照植株表达量的0.16~0.29倍。⑷在过表达植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(2587.63μg/g)是对照植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(1616.90μg/g)的1.6倍;RNAi干扰植株成熟大豆籽粒中总异黄酮含量(349.40μg/g)是对照的0.22倍。
[硕士论文] 闫丽
作物学;作物遗传育种 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物油脂(三酰甘油TAG)是人类日常生活中主要的能量来源。油料作物的含油量和脂肪酸组成是衡量其优质的两个指标,对于含油量高的作物品种的培育是研究工作者一直关注的问题。利用常规传统遗传育种的方法来实现大豆种子含油量的大幅提高存在客观障碍。因此,通过分子生物学的方法鉴定和调控与油脂合成相关基因的表达,解析其分子机制,从而达到提高油料作物种子的含油量的目的,是目前培育高油新品种的研究方向之一。大豆是重要的油料作物,改良其油含量和脂肪酸组成是大豆育种的重要目标之一,但是大豆栽培品种中种子含油量一般在20-22%,与种子含油量高的花生等(40-50%)相比,大豆种子含油量要低。因此,大豆种子在油脂合成上具有再提高的潜在能力。WRINKLED(WRI)是AP2/EREBP转录因子家族的一员。现有研究表明,WRI控制C流从蔗糖到油的积累中起重要作用,并且在糖酵解和脂肪酸合成途径中起到重要调控作用。本文以大豆转录因子GmWRI1a为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术通过抑制转基因受体植株中内源基因Gm WRI11a的表达,创制大豆GmWRI1a基因突变体,通过测定GmWRI1a基因突变体转基因大豆的种子含油量、分析该基因对糖酵解、脂肪酸合成途径相关基因的调控,解析该基因在调控大豆种子油脂合成中的作用,为进一步通过基因工程方法快速改良大豆品质,更好地改造植物自身的脂肪代谢过程,创造优良的油料作物种质奠定理论基础。
  本研究主要内容包括:⑴设计大豆GmWRI1a基因3个靶点为GmWRI1a-sgRNA-1、GmWRI1a-sgRNA-2、GmWRI1a-sgRNA-3。⑵构建了GmWRI1a基因敲除表达载体pVK005-04-GmWRI1asgRNA-1、pVK005-04-GmWRI1asgRNA-2、pVK005-04-GmWRI1 asgRNA-3,利用发根农杆菌介导法转化大豆,对3个质粒是否在大豆毛状根发生基因定点编辑进行验证。⑶通过大豆发根试验验证发生定点编辑的2个质粒,利用农杆菌介导子叶节法转化大豆,共获得T0代转基因植株107株,其中靶点GmWRI1a-sgRNA-1有74株,靶点GmWRI1a-sgRNA-3有33株。⑷运用除草剂抗性、PCR技术以及DNA序列分析鉴定8株GmWRI1a基因突变体转基因大豆阳性植株分别编号为310、327、287、294、350、282、109、250。⑸运用Real-time PCR技术,分析了GmWRI1a转基因突变株大豆油脂合成相关基因的表达量。结果表明,GmWRI1a基因的突变株中随着GmWRI1a基因的下调表达,可显著下调糖酵解及脂肪酸合成过程中相关基因的表达量,说明GmWRI1a基因是通过调控糖酵解及脂肪酸代谢途径相关基因来增加大豆种子油脂含量的。⑹测定了T1代GmWRI1a转基因突变株大豆种子含油量,研究结果表明,转基因突变株种子的含油量较野生型有不同程度的降低。说明GmWRI1a基因的突变株和大豆种子的总含油量呈现负相关,GmWRI1a基因可以促进大豆种子油脂的积累。
[硕士论文] 杨姗
作物学;作物栽培学与耕作学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:玉米是我国主要粮食作物,其保障粮食安全的地位毋庸置疑。由于不合理灌溉的影响,加之施肥及环境恶化等因素的干扰,耕地盐碱化给农业生产造成的损失仅次于干旱,并成为当前影响玉米生产的主要因素之一。玉米是中度感盐植物,尤其在幼苗生长时期受伤害表现最为明显。其耐盐碱性是一个受微效多基因控制的数量性状,仅利用常规育种技术改良品种有很大难度。随着分子生物学的快速发展,各类作物遗传连锁图谱的构建及相关的分子遗传学研究为改良作物耐盐碱性提供了新的机遇。结合精准表型鉴定的QTL定位及功能标记的开发可以更准确地检测和跟踪优势等位基因,极大地推动标记辅助选择在育种实践中的作用,加快育种实践的效率。本研究以(郑58×昌7-2)F2为构图群体,以SSR标记构建遗传连锁图谱。通过发芽率、相对电导率、脯氨酸含量、单株重量及苗情等5个性状对F2∶3群体及其双亲进行苗期耐盐碱性评价。使用Windows QTL Cartographer V2.5软件,采用复合区间作图法(CIM)对五个性状进行QTL定位。最后,基于本实验室耐盐QTL定位结果,结合20份自交系的耐盐性表型鉴定结果,筛选出用于鉴定的有效标记。
  本研究主要内容包括:⑴以郑58/昌7-2构建的142个玉米F2∶3家系为试材,分别用200 mmol/L NaCl溶液和100 mmol/L Na2CO3溶液进行胁迫处理,测定发芽率、相对电导率、pro含量、单株重量和苗情5个性状,并进行性状间相关性分析。结果表明:盐处理条件下,耐盐率除与发芽率不相关外,与其他性状均呈极显著相关,耐盐率与相对电导率及pro含量呈正相关,与单株重量呈负相关,pro含量与相对电导率呈显著正相关;碱处理条件下,除相对电导率与其它性状不相关外,其它性状两两相关。⑵分析F2群体142个株系的276个SSR位点的差异性,采用JoinMap4.0构建了一张拟合233个SSR位点,覆盖玉米全基因组10个连锁群的SSR标记遗传图谱,遗传图谱全长共4507.798 cM,标记间平均间距19.35 cM。⑶采用复合区间作图法在盐胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关3个、与相对电导率相关1个、与Pro含量相关3个、与耐盐率相关1个;碱胁迫条件下共定位到9个QTL,其中与发芽率相关2个、与相对电导率相关1个、与单株重量相关4个、与Pro含量相关1个、与耐碱率相关1个。⑷通过主成分分析法(PAC)对69份玉米自交系进行耐盐性分析,并从中选取耐盐和盐敏感材料各10份。基于本研究耐盐QTL定位结果,选用已构建连锁图谱中第五条染色体上的全部引物作为筛选标记,结合20份耐盐性已知的玉米自交系,通过对24个SSR位点各等位变异耐盐等级的方差分析,检测到4个用于耐盐筛选的有效SSR标记(umc1416、umc1349、umc2295和umc1686)。
[博士论文] 韦洋洋
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:棉花是重要的纤维和能源作物,也是盐碱地种植的先锋作物。然而高浓度的盐胁迫依然会对其产量和质量造成影响。近年来,土壤盐渍化越来越严重,极大的制约了棉花的产量和质量。半野生棉和野生棉是经过严苛的自然界环境筛选进化的材料,其中半野生棉(Semi-wild cotton)是陆地棉的野生类型,又称陆地棉野生种系(Gossypium hirsutum race),遗传多样性丰富,同时半野生棉与栽培品种之间具有遗传亲和性,是研究棉花抗盐机理并进行抗性改良的良好材料。
  本研究制定了室内稳定鉴定半野生棉萌发期和苗期复合盐碱抗性的方法,并初步探讨了ROS在半野生棉对复合盐碱响应中的机制。采用转录组分析方法分析了克劳茨基棉中SOS、ROS、ABA相关基因参与高浓度盐胁迫的响应机制。主要研究结果如下:
  1、确立了室内鉴定半野生棉复合盐碱抗感性的方法:通过对温室鉴定结果与课题多年在新疆盐碱地块半野生棉的鉴定结果的一致性分析,确立了合适土样;通过对土样中主要离子成分的测定,明确了新疆次生盐碱地块中的主要成分,并实现了温室重现,在进行多次验证后,确认了方法的可行性;成功的筛选到稳定抗性材料玛利加朗特棉85和稳定敏感材料阔叶棉40,抗性对照材料中16和敏感对照材料中12。
  2、苗期半野生棉材料复合盐碱胁迫响应:表型与生理生化显示以上四种材料的抗性具有生理学差异,同时发现抗氧化相关的酶在抗感材料之间的活性差异。通过Illumina HiSeqTM2500平台测序,对复合盐碱胁迫0h、3h、12h和48h的半野生棉玛利加朗特棉85、阔叶棉40与陆地棉对照材料中12和中16的叶片与根的转录组测序及生物信息学分析,发现64,737个基因在全部的样品中表达。差异基因分析发现在遭受复合盐碱胁迫后下调基因数目大于上调基因数目,GO富集分析发现,差异基因在响应氧化还原进程的条目中显著富集。
  3、活性氧相关酶类与基因在半野生棉复合盐碱胁迫响应中的机制:通过基因功能注释,发现共有265个ROS产生与清除相关基因。对4个材料的各自的共同差异基因与活性氧代谢相关的基因进行检索发现有中12(152),中16(124),阔叶棉40(144),玛利加朗特棉85(131)个活性代谢通路相关的基因在各个材料中参与ROS调控。通过SOD、POD、CAT和RBOH四个基因家族的表达谱分析,我们确定了主要参与活性氧通路的基因。
  4、野生棉克劳茨基棉盐胁迫响应机制与转录组分析:根据多个盐浓度处理后克劳茨基棉与戴维逊氏棉的表型比对,确定了克劳茨基棉的抗盐性。在对300 mMNaCl处理后的克劳茨基棉叶片进行生理生化指标测定时,发现ABA、GSSH、H2O2等含量迅速升高。进而通过Illumina HiSeqTM2500测序平台,对300 mM NaCl胁迫0h,3h,12h,48h的叶片与根的转录组测序及生物信息学分析,发现37,278条基因和797条新基因表达。差异基因分析发现根部差异基因在3个时间节点都显著富集。通过基因表达模式分析,发现叶片中的差异基因大部分下调表达。GO注释发现差异基因主要富集在响应胁迫与离子转运的分类上,KEGG注释发现差异主要富集在激素信号转导与合成通路。
  5、克劳茨基棉高盐胁迫响应通路:通过对离子转运、活性氧、激素相关基因的表达谱分析发现,SOS、ROS、ABA在棉花相应盐胁迫时起到非常重要的作用,结合前人研究,初步绘制棉花在高盐胁迫早期的响应通路。
[硕士论文] 胡超
作物遗传育种 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:油菜是我国重要的食用油料作物,其中冬油菜的主要种植区域分布在长江流域,该地区极易发生秋季和春季渍水危害,严重影响油菜产量,研究渍害缓解技术对促进油菜生产具有重要意义。外源植物激素对调控作物生长和抗逆性有明显效果,独脚金内酯是一种新型植物激素,能够有效调节植物地上分枝的以及地下根系的生产与构型,但在油菜研究中的应用还未见报道。本课题研究以中双11号为材料,进行渍水盆栽试验,油菜五叶期进行渍水处理,7天后结束渍水,以0μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L,5μmol/L四种不同的浓度的独脚金内酯(SLs)分别对渍水胁迫组(W)和正常水分组(C)进行灌根处理,研究对油菜生长,光合作用,荧光反应,地上部分叶片叶绿素含量以及抗氧化酶活性的影响。本实验
  主要研究结果如下:
  1.独脚金内酯对于油菜生长形态的影响。在油菜渍水后,随着独脚金内酯处理浓度增大,油菜生物量均有所增加,其中地上部分在独脚金内酯浓度为1μmol/L时,生物量增加最多;而地下部分在独脚金内酯浓度为1μmol/L时,对生物量的增加最为显著。独脚金内酯能提高油菜叶片相对含水量和叶面积,同时独脚金内酯能有效促进根系部分的生长,增加总根长、提高根系总面积、根系平均直径以及根尖数。
  2.独脚金内酯对油菜光合特性和荧光参数的影响。渍水油菜的光合相较于正常条件有显著的下降,但施加独脚金内酯浓度在1μmol/L时,能够有效的提高了地上部叶片的叶绿素含量(包含叶绿素a和叶绿素b)以及类胡萝卜索含量,显著提高了净光合速率(Pn)、增大叶片的气孔导度(Gs)和提高其蒸腾速率(Tr),降低地上部叶片的胞间CO2浓度(Ci);独脚金内酯增加了叶绿体荧光参数中相对电子传递传递效率(rETR)、叶片中PSⅡ最大光能转换效率(Fv/Fm)。与此同时独脚金内酯也提高了PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)、PSⅡ有效光化学量子产量(Fv'/Fm')和PSⅡ实际光能转换效率(ΦPSⅡ);独脚金内酯降低了非光化学淬灭系数(qN)。
  3.独脚金内酯对于油菜抗氧化酶系统的影响。渍水胁迫会使得植物体内产生大量的活性氧,而植物有着自己的抗氧化酶系统。实验结果表明:施加独脚金内酯浓度在1μmol/L时,使得经过渍水处理的油菜地上部叶片内超氧化物歧化酶活性稍微下降,而显著的提高了其叶片中的过氧化氢酶和过氧化物酶的活性;并且提高了地上部叶片渗透调节物质的含量,例如脯氨酸(Proline)和可溶性蛋白(Soluble protein);同时增大了地上部叶片中膜脂过氧化物质的含量,对细胞起到了很好的保护作用。
[硕士论文] 姜少芸
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:稻瘟病是一种在世界范围广泛发生的水稻病害。目前,培育和选用抗病品种以及品种合理布局是防治稻瘟病最经济有效的方法。由于稻瘟病菌生理小种繁多且极易发生变异,导致现有抗病品种在推广种植3~5年即会丧失抗性。因此,了解不同区域内稻瘟病菌无毒基因组成、明确适用于当地种植水稻品种所含抗瘟基因类型、筛选抗病品种等对水稻抗瘟品种利用和合理布局具有重要意义。
  为明确24个已知抗瘟基因在湖北省的利用价值,在宜昌和恩施地区自然病圃对24个水稻单基因系进行田间抗瘟性鉴定。综合2014~2016年三年鉴定结果,2015年的发病情况普遍高于2014和2016年。在宜昌地区单基因系品种K8、K10、K17、K18和K25对叶瘟和穗瘟的抗性较好,说明其含有的抗瘟基因Pikh、Piz5、Pish、Pi1、Pikm在宜昌地区具有推广价值,而K8和K18在恩施地区的抗性高,表明抗瘟基因Pikh和Pi1在恩施地区具有较好利用价值,含有这些抗瘟基因的水稻品种可在恩施地区布局种植。
  2014~2016年利用24个水稻单基因系对恩施地区300个稻瘟菌单孢菌株的无毒基因型进行鉴定。结果表明,来自恩施地区的稻瘟菌菌株致病力普遍较强,24个无毒基因在三年中均有出现,出现频率最高的组合数目为2个无毒基因的组合,且组合数目越少,致病力越强。其中Avr-Pikm、Avr-Pikh和Avr-Pi1出现频率最高且稳定,含有对应抗瘟基因Pikm、Pikh和Pi1的水稻品种适合在湖北省恩施地区推广应用。
  采用16个稻瘟菌标准鉴别菌株对60个湖北省主栽水稻品种进行抗瘟基因型推导,发现供试水稻品种只有科优21与Pi19的抗感反应型完全相同,确定其只含有这一个抗瘟基因,另外有35个品种能够确定推导出可能含有的抗性基因;通过对接种结果进行聚类分析,将60份水稻品种划分为12类,同一类水稻品种含有相同的一个或多个抗瘟基因。
  2014~2016年在宜昌和恩施地区稻瘟病常发病圃对湖北省主栽水稻品种的田间抗瘟性进行评价。在宜昌地区鉴定湖北省主推水稻品种314份,对叶瘟和穗瘟都表现抗(R)或中抗(MR)的品种有123个,其中C两优华占、D优202、曾抗一号、川抗993和金科优651等18个品种经过了2~3年鉴定,抗性稳定,是最为理想的抗源材料。在恩施地区鉴定水稻主栽品种143份,对叶瘟和穗瘟都表现高抗(HR)、抗病(R)或中抗(MR)的品种有41个,绵5优142、全丰2155、全优5138等22个品种在恩施病圃经2年以上的田间抗性鉴定,抗性较为稳定,可在恩施地区推广种植。
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