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[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[博士论文] 林云凯
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知的抗原作用最强的专职抗原递呈细胞,被认为是连接特异性免疫和非特异性免疫应答的桥梁,并且可决定机体特异性免疫应答的类型。DCs起源于骨髓前体细胞,经过一系列的发育分化成为不同的亚群:即单核样DCs、浆细胞样DCs(plasmacytoid DCs,pDCs)及经典DCs(conventional DCs,cD Cs)。肠道中DCs主要分布在肠道固有层(Lamina propria,LP)和肠道相关淋巴组织中,包括了派尔集合淋巴结(Peyer's patches,PPs)和肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)等,肠道DCs有许多不同的特异性亚型,其形成与肠道微环境和细胞因子有关,CD103+CD11b+DCs是小鼠小肠固有层(Small intestine lamina propria,SI-LP)中主要的DCs亚群。DCs能严密监视通过肠粘膜屏障移位的细菌和病原菌,不断摄取抗原并将其携带进入次级淋巴结,在淋巴结内激活初始T和B淋巴细胞,诱导特异性免疫反应。肠道特定DCs亚群能够分泌多种细胞因子影响初始辅助性T细胞(Thelper cells,Th cells)向Th1、Th2或Th17等分化,从而参与不同类型的免疫应答反应。肠道正常功能的维持有赖于免疫和耐受之间的精确平衡,对微生物免疫调控失常将导致肠道慢性炎症,如炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)。由此可知肠道DCs在肠道黏膜免疫稳态中扮演着至关重要的角色,然而关于肠道DCs不同亚群的特性及其调节的研究尚不深入。
  信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα,SIRPα)是一类具有抑制性的跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,选择性表达在髓系细胞和神经细胞膜表面。胞质区高度保守,具有富含酪氨酸残基的免疫抑制性基序(Immune receptor tyrosine inhibitory motif,ITIMs),多种生长因子、细胞因子能够诱导其酪氨酸磷酸化。SIRPα胞外区由三个免疫球蛋白超家族结构域(Immunoglobulin super family domain,IgSF)组成,SIRPα通过胞外区与其配体CD47相互作用,介导免疫抑制反应。许多研究表明SIRPα-CD47通路能够参与DCs的发育成熟和促进DCs的抗原递呈功能等。小鼠肠固有层SIRPα的缺失会导致CD103+CD11b+DCs亚群和肠黏膜Th17细胞数量减少,柠檬酸杆菌感染引起的Th17反应减弱。也有研究表明小鼠肠道固有层中CD11c+CD11b+DCs高表达SIRPα,其能促进鞭毛蛋白诱导的IL-17a、IFN-γ和IL-6等的产生,从而促进初始CD4+T细胞向Th17和Th1的分化。综上提示我们SIRPα可能通过调节DCs和Th17的数量和功能参与肠道免疫稳态,然而SIRPα影响肠道DCs稳态的确切机制以及对肠道免疫微环境的影响仍不清楚。
  本课题中,我们通过TALEN技术构建了SIRPα全身性敲除小鼠,通过流式检测小鼠脾脏、肠道固有层和淋巴结组织中DCs、巨噬细胞(Macropages,Mψ)和T细胞各亚群数量和比例,探究SIRPα在肠道免疫稳态中的作用。为了进一步明确SIRPα的功能,我们采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mψ上SIRPα特异性敲除小鼠,通过流式检测肠道淋巴组织中免疫细胞亚群的数量和比例,深入探讨DCs和Mψ等不同来源的SIRPα对于肠道免疫系统的固有调节作用。体外利用共培养研究体系和中和抗体干预手段,初步探讨SIRPα发挥调节肠道DCs作用的机制。为了进一步探讨SIRPα对于肠道稳态的调节作用,我们通过16SrDNA测序对SIRPα敲除小鼠肠道菌群组成和多样性进行了检测。利用DSS诱导的肠炎模型,探讨了SIRPα在炎性肠疾病中作用。通过超高效液相色谱/质谱联用技术开展了SIRPα敲除小鼠胆汁酸组分分析,初步探讨了SIRPα对于胆汁酸代谢的调节作用,确定了SIRPα在肠道免疫和代谢稳态中的重要作用,为IBD和脂质代谢相关疾病的治疗提供新策略和新思路。
  方法:
  1.采用TALEN技术构建了SIRPα全身敲除小鼠,采用Cas9/RNA基因打靶技术,使用Loxp/Loxp-Cre系统构建了DCs和Mψ上SIRPα特异性敲除小鼠动物模型;
  2.建立多色染色方案用于区分肠道DCs和Mψ,通过流式细胞仪检测小鼠脾脏、肠道固有层和肠系膜淋巴结中DCs和Mψ的数量和比例,通过胞内染色检测组织中T细胞亚群的数量和比例;
  3.体外诱导培养小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),利用共培养体系,检测Mψ对于组织DCs、Th1和Th17等的吞噬作用;
  4.抗原特异性T细胞增殖实验。体外实验:脾脏纯化的DCs与OT-Ⅱ小鼠来源的初始T细胞共培养4天,检测培养上清IL-17a浓度;体内实验:受体小鼠尾静脉注射OT-Ⅱ初始CD4+T细胞,1天后进行免疫接种,10天后分析肠道固有层Th17/Th1细胞的数量和比例;
  5.骨髓移植模型:受体小鼠接受致死性γ射线(Co60源)照射,从供体小鼠中分离骨髓细胞,通过尾静脉注射入辐照受体小鼠中;
  6.喂食2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液构建小鼠肠炎模型;
  7.腹腔注射氯膦酸盐脂质体清除小鼠体内Mψ;
  8.小鼠肠道通透性检测。通过强饲法给予小鼠FITC标记的右旋糖酐水溶液,4小时后使用荧光光度仪检测小鼠血清中FITC标记的右旋糖酐浓度;
  9.通过16S rDNA测序检测小鼠肠道菌群组成和多样性;
  10.使用半自动生化分析仪检测血清生化指标。使用ELISA试剂盒检测组织和血清IL-6,IL-1β,TNF-α,IFN-γ,IL-17a和FGF15的浓度;
  11.使用超高效液相色谱(UPLC)-质谱联用系统检测小鼠粪便、血清和组织中的胆汁酸组成和含量。
  结果:
  1.小鼠脾脏、小肠固有层和肠系膜淋巴结中Mψ均高表达SIRPα,而在DCs亚群中存在分化;
  2.SIRPα-KO小鼠脾脏CD4+cDCs特异性减少,肠道固有层和肠系膜淋巴结中CD103+CD11b+DCs数量和比例特异性减少;
  3.造血细胞来源的SIRPα参与肠道DCs亚群的调节;
  4.DCs和Mψ上SIRPα特异性缺失均会导致脾脏CD4+cDCs、肠系膜淋巴结和小肠固有层中CD103+CD11b+DCs数量的特异性减少。
  5.SIRPα依赖的CD103+CD11b+DCs影响肠道Th17/Th1细胞的产生;
  6.阻断SIRPα-CD47通路能够增强SLAMF7依赖的肠道CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1的吞噬;
  7.SIRPα-KO小鼠肠黏膜上皮菌群数量增加且抗菌功能减弱,肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈调节通路受抑制;
  8.SIRPα的缺失加重小鼠DSS诱导的肠炎症状;
  9.SIRPα-KO小鼠出现系统性胆汁酸水平升高。
  结论:
  本研究利用SIRPα全身敲除小鼠和SIRPα条件性敲除小鼠模型,系统地研究了SIRPα在肠道免疫稳态中调节作用和分子机制,本课题研究发现SIRPα的缺失能够引起肠道和淋巴结中CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1数量和比例的特异性减少;阻断SIRPα-CD47信号通路能够增强Mψ对特定DCs和T细胞亚群的吞噬作用,这一过程依赖于SLAMF7;小鼠肠道CD103+CD11b+DCs和Th17/Th1数量的减少,导致肠黏膜上皮菌群数量增加和肠上皮细胞异常激活,胆汁酸代谢负反馈通路受到抑制,进而引起系统性胆汁酸水平升高。综上所述,我们发现SIRPα依赖的CD103+CD11b+DCs在肠道免疫和代谢稳态中扮演着至关重要的角色。
[硕士论文] 陈梦佳
神经生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:嗅觉是动物重要的感官之一。哺乳动物的嗅觉系统主要由位于中枢的嗅球、嗅皮质和位于外周的嗅粘膜组成。嗅粘膜又分为嗅上皮层和固有层。嗅上皮层主要包含基底细胞,嗅受体神经元和支持细胞。其中,基底细胞位于嗅上皮的基底层,紧贴固有层,是嗅上皮的干细胞。嗅受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)是嗅觉系统的一级神经元,它位于嗅上皮基底层的上方,由基底细胞分化而来。伴随着ORNs分化成熟的过程,其胞体从上皮基底层向顶端迁移,使得不同分化程度的ORNs位于不同的细胞层面,其中未成熟ORNs的胞体靠近基底层,而成熟ORNs的胞体位于未成熟ORNs上方接近上皮顶端。嗅上皮的发育对于维持动物正常嗅觉功能至关重要。嗅神经元的发生是一个极其复杂的过程,包括嗅上皮干细胞的增殖、分化和成熟等几个阶段,每个阶段都受到严格的调控,但是人们目前对其调控机制了解十分有限。
  血红素结合蛋白Hemopexin是一种血浆糖蛋白,属于炎症相关的急性期蛋白家族。有趣的是,hemopexin在外周神经系统中也有表达,并且在神经轴突变性的过程中表达上调,提示hemopexin可能参与了神经损伤的再生过程。Hemopexin分子和基质金属蛋白酶和玻连蛋白都有一个由两个四叶β-螺旋组成的相同结构域,称为血红素结合蛋白样结构域。研究表明,后两者可通过其参与调节多种细胞的增殖和分化并能调节神经发生过程等。目前尚没有Hemo、exin参与了神经发生的相关报道。为了深入认识Hemopexin在神经系统发育中的作用,本研究运用基因敲除小鼠模型,分析了Hemopexin在嗅上皮神经发生过程中的作用及机制。
  取得的主要结果如下:
  1、对hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮形态学分析显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮变薄、上皮的细胞总数减少;嗅上皮的成熟ORNs减少,而未成熟ORNs增加,并且未成熟的ORNs结构层次产生异常。
  2、运用免疫组化等方法,进一步发现hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮增殖细胞数量无明显改变,而凋亡细胞增多;嗅上皮的干细胞HBCs无明显异常。
  3、嗅觉功能检测显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅觉识别能力仍然存在,但是区别结构相似气味的精细嗅觉功能丧失。
  综上所述,我们发现hemopexin在嗅上皮的神经发生过程中发挥了重要作用,具有促进ORNs的成熟,抑制其凋亡以及维持精细嗅觉的功能。本研究不仅助于揭示嗅上皮神经发生调控过程的新机制,有助于深入认识神经发育的机理,而且为hemopexin蛋白对嗅觉功能障碍相关疾病的潜在治疗价值提供理论依据。
[硕士论文] 王子
输血医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几部分进行论述:
  第一部分 不同储存时间点更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存期间不同时间点(储存第14天和储存第28天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  方法:
  30名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,分为更换组1(储存第14天更换添加液),更换组2(储存第28天更换添加液)和对照组,每组10例。在红细胞储存第3天、7天、14天、21天、28天和35天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测各组红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用瑞氏染色观察红细胞形态改变情况。通过检测指标探索不同时间点更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-35天,对照组上清液中Na+浓度从(114.1±6.17)mmol/L下降到(80.3±6.46)mmol/L; K+浓度从(6.97±1.38)mmol/L上升到(35.17±8.61)mmol/L;葡萄糖浓度从(28.06±2.77)mmol/L下降到(16.19±4.11)mmol/L;乳酸浓度从(3.44±0.46)mmol/L上升到(10.74±0.12)mmol/L。更换组1更换添加液后(储存21-35天),上清液中Na±浓度和葡萄糖浓度始终高于对照组(p<0.05);K+浓度和乳酸浓度始终低于对照组(p<0.05)。更换组2更换添加液后(储存第35天)上清液中Na+浓度和葡萄糖浓度高于对照组(p<0.05);K+浓度和乳酸浓度低于对照组(p<0.05)。储存第35天时,更换组2上清液中乳酸浓度低于更换组1(p<0.05);Na+浓度、K+浓度和葡萄糖浓度均无显著差异(p>0.05)。悬浮红细胞储存3-35天,更换组1、更换组2和对照组PS阳性率、红细胞棘球率和MCV均无显著差异(p>0.05)。
  结论:
  红细胞储存期间更换添加液(SAGM,pH5.1)可以改善储存环境的离子分布状态,补充葡萄糖,去除乳酸等代谢产物,恢复部分糖酵解,并且不会影响红细胞的PS阳性率、MCV和红细胞棘球率。在纠正离子失衡及恢复糖酵解方面,储存第14天更换添加液优于储存第28天更换添加液。
  第二部分 储存第14天更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存第14天更换添加液在氧化应激、溶血率、渗透脆性等更多方面对红细胞储存的影响。
  方法:
  10名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,同一袋悬浮红细胞平均分为更换组(储存第14天更换添加液)和对照组,每组10例。在红细胞储存第3天、7天、14天、21天、28天和35天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测各组红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用红细胞渗透脆性试验检测红细胞脆性;应用脂质过氧化物试剂盒、还原型谷胱甘肽试剂盒和游离血红蛋白试剂盒分别检测脂质过氧化物、还原型谷胱甘肽和游离血红蛋白并计算溶血率;应用pH计测量上清液pH值。通过检测指标探索储存第14天更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-35天,对照组上清液中Na+浓度从(115.4±3.34)mmol/L下降到(89.4±3.72)mmol/L; K+浓度从(6.62±0.85)mmol/L上升到(31.67±2.85)mmol/L;葡萄糖浓度从(28.76±0.81)mmol/L下降到(18.66±1.16)mmol/L;乳酸浓度从(3.44±0.41)mmol/L上升到(9.59±0.07)mmol/L;红细胞溶血率从(0.08±0.03)%上升到(0.20±0.08)%;pH值从7.23±0.07下降到6.94±0.07。悬浮红细胞储存3-14天,对照组上清液中LPO从(7.99±5.14)μmol/L下降到(3.43±0.74)μmol/L,储存14-35天上升到(4.98±1.38)μmol/L。更换组更换添加液后(储存21-35天),上清液中K+浓度、乳酸浓度、红细胞溶血率、LPO和pH值始终低于对照组(p<0.05):葡萄糖浓度始终高于对照组(p<0.05)。更换组与对照组Na+浓度、PS阳性率、MCV、渗透脆性和GSH均不存在显著差异(p>0.05)。
  结论:
  储存第14天更换添加液(SAGM,pH5.1)可以减轻红细胞储存损伤的离子失衡、乳酸堆积、氧化应激、溶血率增加等问题。
  第三部分 连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响
  目的:
  探索在悬浮红细胞储存期间连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  方法:
  10名献血员体检后按照献血流程采集全血,按照标准流程制备悬浮红细胞后,储存每14天更换添加液。以溶血率大于0.8%作为检测终点。在红细胞储存第3天、14天、28天、42天、56天、70天、84天进行采样检测。应用血球计数仪检测红细胞形态、大小变化情况;采用生化分析仪检测红细胞上清液Na+、K+、葡萄糖和乳酸浓度;应用流式细胞分析仪检测红细胞表面磷酯酰丝氨酸阳性率;应用红细胞渗透脆性试验检测红细胞渗透脆性;应用脂质过氧化物试剂盒和游离血红蛋白试剂盒分别检测脂质过氧化物和游离血红蛋白并计算溶血率;应用pH计测量上清液pH值。通过检测指标探索连续(每14天)更换添加液对红细胞储存的影响。
  结果:
  悬浮红细胞储存3-84天,上清液中Na+浓度从(114.1±6.17)mmol/L逐渐下降到(88.4±5.89)mmol/L(p<0.05);K+浓度从储存第3天的(6.97±1.38)mmol/L上升到储存第14天的(20.09±3.40)mmol/L,随后又下降到储存第84天的(2.99±0.45)mmol/L(p<0.05);葡萄糖浓度从储存第3天的(28.06±2.77)mmol/L下降到(25.55±1.10)mmol/L,随后又上升到储存第56天的(39.59±1.48)mmol/L,然后又下降到储存第84天的(35.91±2.69)mmol/L(p<0.05);乳酸浓度从储存第3天的(3.44±0.46)mmol/L上升到储存第14天的(8.99±0.41)mmol/L,随后又逐渐下降到储存第84天的(0.46±0.06)mmol/L(p<0.05);PS阳性率从(0.31±0.30)%上升到(3.07±1.39)%,随后又在储存第56天时下降到(0.40±0.21)%;然后又在储存第84天时上升到(2.33±1.15)%(p<0.05); MCV从(91.51±2.33)fL下降到(87.86±2.63)fL,随后又上升到(94.95±2.34)fL(p<0.05);渗透脆性从储存第3天的(4.16±0.25)NaCl g/L上升到储存第14天的(5.08±0.19)NaCl g/L,随后又下降到储存第84天的(4.05±0.19) NaClg/L(p<0.05);溶血率从(0.15±0.06)%逐渐增加到(0.97±0.24)%(p<0.05); LPO从储存第3天的(9.17±5.98)μmol/L下降到储存第56天的(2.36±0.47)μmol/L,随后又上升到(5.40±1.17)μmol/L(p<0.05);pH值从7.22±0.08下降到6.18±0.04(p<0.05)。
  结论:
  连续(每14天)更换添加液(SAGM,pH5.1),在第3次更换后会加重红细胞储存损伤,并在更换5次后溶血率超过国家标准。
[硕士论文] 郭祥迁
检测技术与自动化装置 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:睡眠分期是依据睡眠过程中的生理规律,对睡眠阶段进行划分的过程。精确的分期可以为睡眠质量评估和相关疾病诊断提供可靠的技术支持。
  早期睡眠分期工作由人工完成,主观性较强且分期效率较低。近年出现的自动睡眠分期技术,虽然在很大程度上解决了工作效率较低的问题,但也与之带来了参数数量与准确率之间出现矛盾的问题。本文以PhysioBank数据库中睡眠过程的单通道脑电信号和心电信号为研究对象,重点解决睡眠分期技术研究过程中参数过多和准确率较低的问题。主要研究内容如下:
  (1)睡眠生理信号特征提取。在时域、频域以及非线性域中提取单通道脑电信号特征,得到频带比、样本熵等14个特征参数。同时对心电信号进行预处理,生成心率变异性信号,在多分析域共提取9个特征参数。
  (2)睡眠生理信号特征选择与特征降维。采用自适应遗传算法进行特征参数选择,比使用全部特征参数,准确率提高3%。对比相关系数法以及基础遗传算法,使用自适应遗传算法筛选出的参数能够建立泛化能力更好的数学模型。对选出的特征参数进行主成分分析处理,可使得特征维数降低一半,为睡眠自动分期的实时过程提供了可能。
  (3)睡眠生理信号特征分类。提出基于遗传算法的组合分类器,优化子分类器在各分期类别上的判定权值,与基于贝叶斯投票法和单分类器的分期结果进行对比,实验结果表明两种组合分类器的分期准确率比4个单分类器的分期准确率高,而基于GA-CMC算法的组合分类器比基于贝叶斯投票法的分期准确率提高2.3%。
  研究证明,基于单通道脑电信号和心电信号所设计的GA-CMC自动睡眠分期算法,能够使用较少的特征参数,得到相对满意的分类结果,为实现睡眠过程的实时临测提供了可能,具有一定的应用价值。
[博士论文] 张新旺
生物学;遗传学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:Neuroligin(Nlg)家族蛋白是一类在神经突触的形成、发育以及功能行使中具有重要作用的细胞粘附分子,疾病家系分析揭示NLG基因突变与自闭症、精神分裂症等精神类疾病发病相关。Nlg具有进化上的保守性,研究表明果蝇Nlg1~3(DNlg1~3)缺失均会导致神经肌肉突触发育异常,但DNlg4在突触形成和发育中的作用尚不清楚。
  本研究利用制备的dnlg4完全缺失突变体,对DNlg4在神经肌肉突触的发育和功能行使中的作用及其分子机制进行了探索。证明了与DNlg1-3的突触后作用不同,DNlg4以突触前作用调控神经肌肉突触发育。DNlg4缺失会导致显著的神经肌肉突触发育障碍,表现为神经肌肉的突触bouton数量明显减少,并伴随有bouton体积增大的表型。突触超微结构分析显示,DNlg4缺失还会导致神经肌肉突触结构异常。进一步研究发现,这些形态和发育缺陷会造成突触的神经递质传递效率的下降,并进而影响果蝇幼虫运动活性。DNlg4缺失导致的这些突触发育缺陷和功能障碍可被突触前运动神经元表达的外源DNlg4所挽救,却不能被突触后肌肉细胞中表达DNlg4挽救。
  为了阐明DNlg4调控突触发育的机制,我们利用遗传杂交方法发现DNlg4与影响突触发育的骨成形素(Bone Morphogenetic Protein,BMP)信号通路的分子存在遗传学相互作用。我们进一步发现DNlg4对运动神经元的BMP信号水平有正向的调控作用。免疫染色和免疫印迹结果显示,DNlg4以转录后作用特异性地调控BMP的Ⅰ型受体Thickvein(Tkv)在突触前的蛋白水平。利用免疫共沉淀技术和Pull down实验,我们进一步证实DNlg4与Tkv在体内存在相互作用,且这种作用依赖于DNlg4N端的乙酰胆碱酯酶类似结构域。
  综上所述,我们的研究揭示了果蝇DNlg4通过稳定突触前的Tkv,调控运动神经元BMP信号水平,进而调控神经肌肉突触的生长。在这个调控过程中,DNlg4不是作为突触后分子,而是作为突触前分子行使功能。
[硕士论文] 丁海遐
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)通常是指女性在于40岁以前出现闭经,伴随着持续雌激素水平降低和促性腺激素水平的升高等内分泌紊乱。全球范围内的流行学调查显示,POF的发病率为1-2%,但有逐年增高的趋势。目前,大部分POF患者的病因是不明确的,对于无生育要求的患者,激素替代治疗可缓解她们提前出现的更年期症状。然而在那些尚未生育或仍有生育需求的患者中,由于常规的辅助生殖技术难以获得成熟高质量的卵子,因此无法发挥相应作用,这也成为POF辅助生殖治疗最为棘手的难题。
  对于大部分POF患者来说,赠卵的体外受精-胚胎移植技术是最为有效的办法,但因法律、伦理和人们思想观念的限制,难以满足POF患者的生育需求。有研究显示,大部分POF患者卵巢皮质内仍残存一些处于休眠状态的始基卵泡,但是这部分卵泡对促性腺激素无反应能力,故无法正常发育、成熟。如何保存这部分可能存在潜在生育功能的始基卵泡并激活使其生长发育,获得有效卵子成为POF患者辅助生殖治疗新的突破口。
  现阶段,生育力保存的常用方法有胚胎冷冻、卵母细胞冷冻、卵母细胞体外成熟和卵巢组织冷冻等。然而,对于POF患者来说,无法获得成熟或未成熟的卵子,更无法应用成熟的卵子在体外与精子受精形成胚胎,故胚胎冷冻、卵母细胞冷冻和卵母细胞体外成熟的方式无法成为POF患者保存生育力的方法。这使得卵巢组织冷冻技术成为POF患者保存生育力的仅存方式。卵巢组织冷冻可分为玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻两种方式。越来越多的研究显示玻璃化冷冻技术较传统的慢速冷冻更为简单、高效。
  近年来,如何激活休眠状态的始基卵泡成为POF生殖治疗的研究热点。因体内应用激活剂存在肿瘤发生的风险,故更多研究将将目光聚焦于体外激活。体外激活(invitro activation)技术是将卵巢组织从患者体内取出,进行一定的处理或使用激活剂,激活卵巢组织中处于休眠状态的卵泡继续发育,再将卵巢组织移植回患者体内,以期获得成熟卵泡并妊娠。卵巢组织体外培养的实验显示,PTEN抑制剂可使用的激活PI3K-AKT信号通路,激活始基卵泡的发育,人卵巢组织异种移植的研究同样证实了该作用。Hippo信号通路在哺乳动物体内也广泛存在,且高度保守,其主要功能为限制组织器官过度生长。日本有学者研究发现将小鼠卵巢片段化处理为小的卵巢组织块可阻断体内Hippo信号通路,促进卵泡发育。
  本研究通过对人卵巢组织进行玻璃化冷冻及复苏,评价玻璃化冷冻及复苏对卵巢组织冷冻的有效性。并对人卵巢组织进行片段化处理,检测Hippo信号通路中YAP、pYAP蛋白及CCN生长因子、BIRC凋亡抑制因子的含量变化,证实是否对人卵巢片段化处理后可阻断Hippo信号通路。将片段化处理后的卵巢组织体外加入AKT刺激物培养后进行裸鼠背阔肌移植,探究是否可体外激活卵泡发育。
  研究方法:
  本课题研究中,我们收集了本院整形科易性病患者(女变男)及妇产科非卵巢因素行卵巢切除术的患者卵巢组织,进行玻璃化冷冻,一段时间后对冷冻的卵巢组织进行解冻复苏,并利用组织HE染色的方法比较冷冻前后卵巢组织形态学改变。接着,我们对复苏后的卵巢组织进行片段化处理,利用免疫组化,比较处理前后YAP蛋白定位变化及CCN3表达量的改变,利用RNA抽提,反转录及qPCR技术比较片段化处理后不同时间点CCN及BIRC的表达水平,并运用Western blotting在蛋白水平检测YAP及CCN3的表达情况。同时,将片段化处理后的卵巢组织加入AKT刺激物进行体外培养,培养后的卵巢组织进行裸鼠背阔肌移植,检测卵泡发育情况。
  研究结果:
  1.卵巢组织玻璃化冷冻前后无明显形态学改变。
  在对玻璃化冷冻前后卵巢组织HE染色形态学比较中,冷冻前后卵巢组织内均可见卵巢间质细胞呈梭形排列,前内可见散在分布的始基卵泡,始基卵泡内卵母细胞可见细胞核清晰,呈圆形,卵母细胞周围包绕一层梭形前颗粒细胞,冷冻复苏后的卵巢组织HE染色后可见镜下形态与冷冻前新鲜卵巢组织无明显改变。
  2.片段化处理人卵巢组织可降低p-YAP蛋白含量,颗粒细胞细胞核中YAP蛋白含量增多。
  本研究将解冻复苏后的卵巢组织进行片段化处理,对处理前后卵巢组织内YAP蛋白及p-YAP蛋白含量进行western blotting检测,结果示处理后1小时卵巢内p-YAP蛋白含量较处理前明显降低,YAP蛋白无明显改变,p-YAP/YAP明显降低。同时,对片段后处理后的卵巢组织进行YAP蛋白的免疫组化检测,比较YAP蛋白定位变化,可见片段化处理后的卵巢组织内可见颗粒细胞核内YAP蛋白含量增多。
  3.片段化处理人卵巢组织片后CCN生长因子及BIRC凋亡抑制因子表达量增加。
  本研究将解冻复苏后的卵巢组织进行片段化处理,利用RNA抽提,反转录及q-PCR技术比较片段化处理后不同时间点CCN及BIRC的表达水平,结果显示片段化处理后CCN2、CCN3、BIRC1、BIRC7表达量均上升,有统计学意义。western blotting检测CCN3蛋白水平变化,提示片段化处理后CCN3蛋白水平明显增高。同时,我们还用运免疫组化的方法检测CCN3表达变化,结果提示CCN3表达量较处理前明显增高。
  4.将片段化处理后的卵巢组织运用AKT刺激物体外培养后可增加p-AKT表达量,裸鼠背阔肌移植未见明显坏死。
  本研究通过对片段化处理后的卵巢组织运用AKT刺激物体外培养,利用westernblotting检测p-AKT蛋白水平变化,结果显示运用AKT刺激物培养后的卵巢组织内p-AKT蛋白表达量明显增高。将培养后的卵巢组织移植入裸鼠背阔肌,一段时间后回收卵巢组织进行HE染色发现,可见新生血管,无明显坏死。
  研究结论:
  1.卵巢组织玻璃化冷冻可作为生育力保存的有效方法;
  2.片段化处理人卵巢组织可阻断Hippo信号通路;
  3.加入AKT刺激物进行卵巢组织体外培养可增加p-AKT表达量;
  4.人卵巢组织片段化处理联合AKT刺激物处理后裸鼠移植可以存活。
[硕士论文] 于舒
神经生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:树鼩属于攀鼩目树鼩科,是一类在外形上与松鼠相似的小型哺乳动物,它们的体重一般小于300g,分布广泛,常见于在南亚、东南亚和我国南部与西南部地区。在生理解剖、神经发育、肝炎病毒感染特性及心理应激模式等方面树鼩与灵长类,甚至人类高度相似。另外,在哺乳动物中树鼩拥有最大的脑-体重比,是理想的研究大脑功能和人类神经退行性疾病的动物模型之一。如今,树鼩作为一类具有潜在应用价值的新型模式动物,已越来越多地受到人们的关注。
  海马作为大脑边缘系统中非常重要的结构之一,在学习、空间记忆、焦虑、应激等过程中均发挥功能。目前,对啮齿类动物海马神经环路结构构成和功能信息的研究已经较为深入。但是树鼩作为新型模式生物,对其海马神经环路解析的相关研究还比较少。本研究采用形态学染色等方法首次详细解析了不同中间神经元在海马不同亚区的分布,为解析树鼩海马神经环路提供了解剖学数据。我们还通过对树鼩和小鼠内侧前额叶皮层和海马齿状回进行细胞构筑比较研究,实验结果在一定程度上证实树鼩在进化地位上更加高等。
  认识人类大脑功能的前提是解析神经网络之间的连接图谱。解决这一科学问题的关键之处在于如何追踪神经环路的结构。嗜神经病毒作为新型的示踪工具具有可跨突触传播,可以控制传播方向并且信号不会衰减等特征,近几年来被广泛地用于神经网络示踪的研究当中。嗜神经病毒示踪技术的快速发展,使其成为解析神经环路结构信息的有效手段。器官型脑组织培养是解析正常或疾病状态下人脑神经环路一个重要的环节。本研究建立了人脑皮层器官型脑组织培养技术,实现了人脑皮层组织体外培养长达五天并利用电生理记录成功检测到神经细胞活性。以期结合嗜神经病毒来解析神经环路的结构信息。
  揭示健康人与患者(比如癫痫或者阿尔茨海默症)在神经环路中差异和异常将有助于对其发病机制的理解。我们还查询了安徽医科大学第一附属医院2011-2017年颞叶胶质瘤伴癫痫病人的病理资料,并且对其病理组织进行神经病理学检查。希望结合器官型脑组织培养和电生理记录技术实现对疾病的发病机制更加深入的研究。
[硕士论文] 蒋薇
神经生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:学习记忆是脑的高级功能,建立在人类大脑中数千亿神经元的基础上。神经元之间形成突触,突触介导神经元之间的信息流动,允许化学信号或者电信号从一个神经元传到另一个神经元,是神经元执行各种功能的基础。突触的形态和功能会随着外界刺激的影响发生改变,这就是突触可塑性。突触可塑性可使两个神经元之间的联结强度发生动态的改变,进而影响神经元之间的信息传递。因此,学习记忆依赖于突触可塑性,即神经元之间突触连接强度的改变能力。
  星形胶质细胞是大脑中除了神经元之外的一类重要细胞。它对学习记忆的作用主要是通过维持脑稳态、支持神经元以及在神经元受损时,修复神经元来达成的。星形胶质细胞也通过介导突触可塑性和突触再生来调节新记忆的形成。
  雌激素对学习记忆也有重要作用。前期研究发现,雌激素可以增强学习记忆能力并且减少痴呆的风险。在女性体内如果内源性雌激素合成被抑制会导致认知损伤。因此,我们假设在大脑中增加雌激素可以增强小鼠的学习记忆能力。在大脑中,神经元和星形胶质细胞都能够产生雌激素,我们还将研究在哪种细胞中增加雌激素会增强小鼠的学习记忆能力。
  为了回答这两个问题,我们首先构建了神经元过表达雌激素合成酶——芳香化酶(aromatase,Ar)的小鼠Thy1-Ar和星形胶质细胞过表达芳香化酶小鼠hGFAP-Ar,通过western blot,我们发现Thy1-Ar和hGFAP-Ar小鼠脑中芳香化酶表达量明显升高;其次,为了研究过表达雌激素合成酶小鼠的学习记忆能力和野生型小鼠相比是杏有所增强,我们利用barns迷宫检测了小鼠的空间记忆能力,发现13-15月龄的Thy1-Ar和hGFAP-Ar小鼠找到目标洞口所用的时间和同年龄的野生型小鼠相比明显减少,这表明13-15月龄的Thy1-Ar和hGFAP-Ar学习记忆能力和野生型小鼠相比明显的加强,在雌性及雄性小鼠中,我们均发现了这种记忆增强作用;在3-5月龄时,雌性和雄性hGFAP-Ar小鼠的学习记忆能力和野生型小鼠相比增强;而在3-5月龄时,雌性和雄性Thy1-Ar小鼠的学习记忆能力和野生型小鼠相比显著增强;最后,我们还利用脑片膜片钳技术探索了雌激素增强学习记忆能力的可能机制,我们发现在雌性及雄性的hGFAP-Ar小鼠中,海马CA1区的兴奋性突触后电流和野生型小鼠相比均显著增强,结合我们的行为学数据,即雌性及雄性的hGFAP-Ar小鼠学习记忆能力均强于野生型小鼠,这提示我们星形胶质细胞产生的雌激素可能是通过增强CA1区的兴奋性突触传递能力增强学习记忆的。有趣的是,我们发现雌性Thy1-Ar小鼠海马CA1区的兴奋性突触后电流并没有改变,而Thy1-Ar雌性小鼠的学习记忆能力增强,这提示我们神经元产生的雌激素增强学习记忆的机制与星形胶质细胞不同。
  这两种模型鼠的成功建立可用于研究雌激素在调节学习和记忆中所起的作用。我们的初步研究发现脑中过表达雌激素合成酶,无论是神经元还是星形胶质细胞产生的,都能对学习记忆有加强作用,尽管它们加强学习记忆的机制可能不同。这些观察结果可能能给和雌激素缺乏相关的痴呆疾病提供治疗靶标。我们的研究也可以用于研究相关疾病,如阿尔茨海默病。
[博士论文] 樊红琨
医学神经生物学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:小电导-Ca2+-激活K+通道(small-conductance Ca2+-activated K+channels,SK,KCa2)几乎存在于所有可兴奋细胞的胞浆膜上,依赖于细胞内的Ca2+进行激活。SK通道家族由SK1、SK2、SK3以及一个在结构和功能上与SK通道相似的中电导-Ca2+-激活K+通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IK或称SK4)组成。SK1、SK2和SK3三个亚型在人类、小鼠和大鼠心肌细胞中均有表达,参与心肌细胞动作电位复极化的构成。研究显示SK1和SK2主要表达在心房,而敲除SK2通道的动物出现心房细胞复极化延长,增加房颤和房扑等快速性心律失常的易感性。因此,SK2通道可能与室上性快速性心律失常有关,可作为室上性快速性心律失常的治疗靶点,但它的调控机制目前还不明确。
  引起SK2通道开放的细胞内Ca2+信号来源有两条途径:位于细胞膜上的电压-门控Ca2+通道(voltage-gated Ca2+channels,VGCCs)及内/肌质网(endo/sarcoplasmic reticulum,ER/SR)膜上RyRs(ryanodine receptors)敏感的Ca2+释放通道。已有研究报道指出心肌细胞膜的Cav1.3L型Ca2+通道通过α-actinin与SK2通道进行耦联,实现对SK2通道的调控,这提示SK2通道可能不是直接和调控性的Ca2+通道有生理性相互作用。我们实验室前期实验证据已显示心肌细胞膜表面的SK2通道与SR RyR2受体通道有功能性耦联,但它们二者之间耦联的中间分子并不清楚。
  本研究通过质谱分析和生物信息学的方法筛选心肌组织中与JP2相互作用的蛋白质,采用心肌组织和转染HEK293细胞进行免疫共沉淀和GST pull-down实验来验证JP2与SK2通道、JP2与RyR2之间的相互作用,进一步制备不同片段GST-JP2原核表达质粒来验证JP2与SK2通道和RyR2发生相互作用的结构域,并通过功能性实验检测JP2敲减后对钙瞬变(calcium transients)的影响,以及JP2敲减后心肌钙相关蛋白的表达。
  研究方法:
  1.采用健康成年C57BL/6小鼠,体重20-25g,雌雄不拘。
  2.心肌肌质网小泡膜蛋白的分离和检测:用差速离心的方法提取成年C57BL/6小鼠心脏肌质网小泡的膜蛋白。并用Western blot方法检测膜蛋白中SK2、JP2和RyR2的蛋白,用心肌组织蛋白做阳性对照。
  3.质谱分析:心肌肌质网小泡膜蛋白裂解液中加入JP2抗体或鼠源无关的抗-IgG抗体,再用proteinG-Sepharose捕获制备免疫共沉淀复合物,进行电泳后,考马斯亮蓝染色,选择有差异的目标蛋白条带作为质谱分析样品,送北京大学医学部进行质谱分析。
  4.生物信息学:根据文献将蛋白质筛选,用geneontology网站进行分类,并在String网站上查出它们之间的相互作用。
  5.Western blot鉴定:将制备的免疫共沉淀复合物进一步用特异性SK2和RyR2抗体进行检测。
  6.构建原核表达载体:使用BamHⅠ和NotⅠ双酶切原核表达载体pGEX-4T-1,将JP2全长、氨基端片段JP2-N1(1-253)和JP2-N2(216-350)、羧基端片段JP2-C(340-696)插入,构建融合基因pGEX-4T-1-GST-JP2、pGEX-4T-1-GST-JP2-N1(aa1-253)、pGEX-4T-1-GST-JP2-N2(aa216-350)和pGEX-4T-1-GST-JP2-C(aa340-696)。并用双酶切和测序方法鉴定构建的重组质粒。
  7.GST融合蛋白的原核表达和纯化:将已鉴定的GST、GST-JP2以及GST-JP2不同片段重组质粒分别转化宿主菌E.Coli BL21,用IPTG26℃过夜诱导表达靶蛋白,并用GST.BindTM树脂层析柱纯化融合蛋白。
  8.构建pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP质粒,共转染HEK293细胞:以pCMV6-entry-SK2和pCDNA3.1-JP2为模板,制备pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP质粒,用双酶切和测序方法鉴定构建的质粒。按照LipofectamineTM2000说明书转染质粒。
  9.GST pull-down分析:将结合了GST融合蛋白的层析柱中加入心脏裂解液或HEK293细胞裂解液,过夜孵育后用谷胱甘肽elution buffer洗脱,并用SK2或RyR2抗体进行检测。
  10.Co-IP法检测体外JP2和SK2相互作用:将共转染SK2和JP质粒的HEK293细胞裂解液与抗体过夜孵育,再用proteinG-Sepharose制备免疫共沉淀复合物;再分别用抗SK2和抗JP2抗体进行检测。
  11.尾静脉注射腺病毒:给健康成年C57BL/6小鼠尾静脉注射总量为1×109PFU的携带阴性对照siRNA(Ad-NC)或JP2-siRNA(Ad-siJP2)的腺病毒。注射后7天分离成年小鼠心肌细胞。
  12Western blot的方法测定注射腺病毒成年小鼠心脏JP2蛋白表达,并检测对SK2通道蛋白表达的影响。
  13.钙瞬变的测定:将Ad-NC和Ad-siJP2组成年小鼠心肌细胞悬液进行梯度复钙,并加入终浓度为2μM的Fura-2/AM,用1HZ场刺激诱发钙瞬变,采用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统测量钙瞬变,数据采用美国IonOptix公司的IonWizard6.6软件进行分析。
  14.Western blot的方法测定RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2钙处理相关蛋白的表达。
  15.统计学分析:所有数据以均数±标准误表示,用SPSS11.0统计学软件进行分析。以配对t检验或单因素方差分析(one-way AN OVA)进行统计学处理。统计分析以P<0.05为有显著性差异。
  实验结果:
  1.Western blot检测显示肌质网小泡膜蛋白中有SK2、JP2和RyR2三种蛋白的表达。
  2.在心肌肌质网小泡膜蛋白中加入JP2抗体(免疫共沉淀实验组)或鼠源无关的抗-IgG抗体(阴性对照组)制备质谱分析样品,电泳后考马斯亮蓝染色,观察对照组和实验组的蛋白质泳带,选出13条差异目标条带。质谱分析后得到35013个与JP2可能有相互作用的蛋白质,最终筛选出90个相关的蛋白质,其中包括SK2和RyR2蛋白。通过信息分析学进一步对蛋白质进行分类,并测定它们之间的相互作用。
  3.String网站预测结果显示JP2和RyR2两者的直系同源蛋白可以在其他物种中共表达,可以预测它们之间可能存在相互作用;由于目前只能同源模建出小鼠SK2的CaM区(序列为655-785),不能预测SK2和JP2之间是否有相互作用;但通过Western blot的方法用特异性SK2和RyR2抗体检测到肌质网小泡裂解液中JP2可以沉淀SK2和RyR2蛋白。
  4.GST-JP2融合蛋白可以pull-down心肌组织裂解液中的SK2,提示GST-JP2与心肌中SK2有相互作用,并且这种相互作用主要发生在JP2氨基末端的MORN区,尤其是GST-JP2-N1(aa1-253)片段作用明显,而GST-JP2的羧基末端GST-JP2-C片段(aa340-696)可以和心肌组织裂解液中的RyR2结合;体外实验结果显示GST-JP2的MORN1区1-253片段可以和HEK293细胞裂解液中的SK2蛋白结合。
  5.将HEK293细胞共转染SK2和JP2质粒,用特异性JP2或SK2抗体孵育细胞蛋白裂解液进行Co-IP实验,结果显示SK2可以共沉淀JP2,JP2可以和SK2结合,提示体外JP2和SK2之间可能有相互作用。
  6.成年小鼠尾静脉注射阴性对照siRNA或JP2-siRNA的腺病毒,Western blot结果显示,与空白对照组(Ctrl-NT)和阴性对照组(Ad-NC)相比,Ad-siJP2组JP2表达减少到了47%和48%,而SK2通道蛋白表达无明显变化。
  7.成年小鼠心肌细胞JP2敲减后,用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统测量钙瞬变,与Ad-NC相比,Ad-siJP2组钙瞬变的幅度显著减少,钙瞬变到达峰值50%的时间却显著增加,而细胞内静息Ca2+水平和钙瞬变衰减50%的时间没有显著变化。使用Caffine测量RyR2依赖性肌质网Ca2+储存水平,与阴性对照组相比,钙瞬变的幅度亦显著减少。因此,敲减成年小鼠心肌JP2的表达,会减少心肌肌质网Ca2+的释放。
  8.用Western blot的方法检测成年小鼠心肌钙处理相关蛋白的表达,与阴性对照组相比,Ad-siJP2组心肌组织RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2的表达无显著变化。
  实验结论:
  小鼠心肌组织JP2与SK2、JP2和RyR2蛋白有相互作用,JP2分别通过羧基末端连接RyR2,而通过氨基末端的MORN结构域连接SK2,从而实现三者的功能联系。
[硕士论文] 刘雷美
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:TMCO1(Transmembrane and Coiled-Coil Domains1)是一个功能极为保守的蛋白,是内质网上的钙离子通道,其功能是感受内质网内的钙离子浓度并且主动地调节内质网的钙稳态。TMCO1基因突变可引发一种常染色体隐性遗传病——脑颅面胸畸形(Cerebro-Facio-Thoracic dysplasia,CFT dysplasia)。患者多是因近亲结婚所致,通常表现为颅面骨及胸骨发育异常,并伴有严重的认知障碍。受累部位主要集中在颅面骨、脊椎骨以及肋骨三处骨骼,该病也因此被命名为脑颅面胸畸形综合征。TMCO1基因缺失的患者多表现出颅骨早闭,但也有闭合不全的病例。
  此研究是在实验室前期研究的基础上进行的延伸和拓展,我们之前的小动物CT成像结果显示,TMCO1基因敲除小鼠颅面骨异常是由于颅骨缝闭合不全导致的。与其他颅骨闭合不全的相关病症相比,TMCO1基因缺失导致小鼠人字缝、矢状缝以及冠状缝的全面闭合不全且颅骨变薄。但TMCO1基因缺陷小鼠的骨骼异常是由于发育过程中的成骨不全还是破骨太强所致并不清楚。本研究以小鼠为研究模型,通过骨组织切片HE染色,免疫组化等实验,检测不同年龄小鼠后腿股骨骨小梁数量,成骨细胞和破骨细胞的数量;通过分离不同基因型的新生小鼠颅骨成骨细胞并进行体外诱导培养,利用CCK8试剂盒检测细胞增殖活性差异;茜红素染色检测成骨细胞诱导形成钙结节的能力;RT-qPCR检测成骨特异性基因(ALP、RUNX2、Osteocalcin、BSP、Typeα1、Typeα2、Hprt、BMP4)的表达差异;利用钙影像技术检测不同基因型的成骨细胞内质网钙过载情况。经过周密的实验设计和一系列的实验验证,得出以下结论:
  TMCO1基因缺失小鼠出生率低且生长速度慢于同窝野生型小鼠;CCK8试剂盒检测细胞增殖活性显示:从TMCO1基因缺失新生小鼠的颅骨分离的成骨细胞增殖速率变慢;对成骨细胞在相同条件下进行体外诱导培养发现,TMCO1基因缺失小鼠颅骨成骨细胞形成钙化结节的能力显著减弱;同时,骨组织切片HE染色也发现TM O1基因缺失小鼠的后腿股骨骨小梁数量明显少于野生型小鼠。以上结果初步说明TMCO1基因缺失导致了小鼠成骨障碍。对成骨细胞内质网(ER)钙离子浓度进行检测,发现TMCO1基因缺失小鼠的成骨细胞出现ER钙过载。由此,TMCO1基因缺陷小鼠骨骼发育异常可能是由于ER钙离子过载所致。
[博士论文] 张宁
麻醉学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究异丙酚是否诱导了体外培养的胎鼠海马神经元的凋亡,右美托咪定预处理对异丙酚诱导的神经元凋亡的影响,以及右美托咪定参与神经保护作用的可能机制,具体研究了以下问题:
  1.检测异丙酚处理对海马神经元活性的影响和右美托咪定预处理是否能够降低海马神经元凋亡。
  2.通过检测Akt(Serine/threonine kinases)、p-Akt、Bad(Bcl-2/Bcl-XL-associated death promoter)、p-Bad蛋白水平变化,探讨右美托咪定对降低异丙酚诱导的神经元凋亡的可能机制。
  3.通过LY294002抑制剂处理后,检测Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平,探讨PI3K/Akt信号通路是否参与了右美托咪定对异丙酚诱导神经元凋亡的保护作用。
  方法:
  1.培养和鉴定胎鼠海马神经元
  (1)根据专业人员建议,选取怀孕16-18d Wistar大鼠,为了保证无菌,胎鼠大脑在超净工作台中取出,在解剖显微镜下观察处理,为保证纯度脑膜和血管等杂质尽要可能去除,操作过程在冰上进行可以神经元的存活率。用解剖剪将胎鼠海马组织剪成小碎块。
  (2)加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化,中间摇动1-2次可以消化的更充分,过滤除去未消化好的组织块得到单细胞悬液,重复消化一次。
  (3)混合两次消化得到的细胞悬液并计数,然后铺到6孔板(先用赖氨酸包被),培养液用含10%胎牛血清及2%B27的DMEM/F12培养基。培养4个小时更换为96%Neurobal Medium+2%B27+100U/mL青霉素+100μg/mL1链霉素+2mmol/mL L-谷氨酰胺培养基。
  (4)培养至第7天进行海马神经元鉴定,本研究采用神经元特异核蛋白(Neuron specific nucleoprotein,NeuN)抗体进行免疫细胞化学鉴定。
  2.试验分组
  随机分为7个组:
  (1)对照组
  (2)右美处理组(100μM右美预处理)
  (3)100μM右美+异丙酚(100μM右美预处理30min后加入100μM异丙酚处理3h)
  (4)10μM右美+异丙酚(10μM右美预处理30min后加入100μM异丙酚处理3h)
  (5)1μM右美+异丙酚(1μM右美预处理30min后加入100μM异丙酚处理3h)
  (6)0.1μM右美+异丙酚(0.1μM右美预处理30min后加入100μM异丙酚处理3h)
  (7)异丙酚组(100μM异丙酚处理3h)
  3.海马神经元细胞活性检测:不同浓度右美托咪定和异丙酚处理后的海马神经元,加入MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide),之后加入DMSO(Dimethyl Sulphoxide)溶解结晶,酶标仪检测细胞活性的变化。
  4.Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平检测:不同浓度右美托咪定和异丙酚处理后的海马神经元,获取细胞裂解物,测定蛋白浓度,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后Western blot方法检测各蛋白水平变化。
  5.LY294002抑制剂处理后,检测不同实验组和对照组Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平变化。
  结果:
  1.神经元单细胞悬液进行台盼蓝染色发现,活细胞比率在90%以上。利用NeuN进行免疫细胞化学研究发现,海马神经元培养7天后神经元内可以观察到大量的棕色颗粒存在,说明成功获得了目的细胞,且90%以上为神经元,可以进行后续实验。
  2.通过MTT检测海马神经细胞活性发现,100μM异丙酚处理3h能够明显降低神经元的细胞活性(与对照组比较p<0.05),而100μM右美托咪定预处理则可以提高细胞活性,起到显著的保护作用(与100μM异丙酚处理组比较p<0.05),而低浓度的右美托咪定预处理(10μM、1μM和01μM)则对细胞活性没有明显影响。
  3.Western blot方法检测Akt、p-Akt、Bad、p-Bad和Bcl-xL蛋白表达变化,结果显示异丙酚处理能够明显降低p-Akt和p-Bad的表达水平,增加了Bad的表达,从而导致Bcl-xL/Bad的比率升高。100μM/L右美托咪定预处理可以使异丙酚的这种效果逆转,升高p-Akt和p-Bad的表达水平,而10μM、1μM和01μM右美托咪定则对蛋白表达没有明显影响,说明PI3K/Akt途径可能参与了右美托咪定对神经元的保护作用。
  4.抑制剂LY294002处理后,p-Akt表达水平降低、Bad表达水平升高、Bcl-xL/Bad降低,说明LY294002对100μM/L右美托咪定的保护作用具有抑制作用。
  结论:
  1.成功培养获得了胎鼠海马神经元,存活率在90%以上。100μM/L异丙酚预处理能够降低胎鼠海马神经元的细胞活性,而100μM/L右美托咪定可以起到保护作用。
  2.100μM/L异丙酚通过降低p-Akt和p-Bad的表达水平,增加Bad的表达诱导了海马神经元凋亡,100μM/L右美托咪定可以逆转异丙酚诱导的神经元凋亡,起到保护作用,但10μM、1μM和01μM右美托咪定则没有明显的保护作用,说明右美托咪定的神经保护是有剂量依赖性的。
  3.100μM/L右美托咪定的保护作用可以被LY294002抑制,说明PI3K/Akt信号通路参与了右美托咪定介导的保护作用。
[硕士论文] 张雨婷
生物物理 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:应激(stress),即压力,在香烟渴求的维持及复吸的诱发方面起着十分关键的作用。与此同时,应激通过损害内源性的催产素(Oxytocin,OT)系统,从而削弱社会情感连结,进一步导致烟草滥用这一不明智的决策行为。OT调节应激诱发尼古丁渴求的潜在神经机制至关重要,然而迄今为止,这仍然是一个相当困难和未被证实的问题。
  本研究采用鼻喷OT和心理社会心算应激任务,探索OT在禁烟两小时男性中对应激诱发香烟渴求的影响及其潜在神经机制。
  实验一(N=25)首先验证蒙特利尔心算应激成像任务(the Montreal Imaging Stress Task,MIST)诱发应激和渴求的有效性。实验二(N=22)探究OT是否降低了应激诱发的香烟渴求。实验三(N=35)对禁烟两小时的男性烟民鼻喷24单位(IU)的外源性OT或生理盐水鼻腔喷雾剂,30 min后开始MIST任务,使其暴露于心理社会压力之下,同时在MIST任务前后也扫描了静息态,利用功能性磁共振成像来确定OT对应激诱发香烟渴求调控相关的脑区,从而探究OT对应激诱发尼古丁渴求的潜在神经机制。在实验的前测与后测中,除了采集被试主观的压力和渴求评价外,还测量了情绪和皮质醇水平以及吸烟渴求量表得分。
  结果发现,MIST范式可以成功诱发出应激和渴求,且渴求的增加随应激的增加而增加。OT降低了应激诱发的渴求增加,同时减轻了负性情绪和焦虑等戒断症状。OT对应激实验前后渴求增加的抑制作用显著增强了静息态双侧扣带回和辅助运动区的低频振幅(amplitude of low frequency fluctuation,ALFF),且右侧扣带回和右侧下额叶皮层三角区的功能连接(functional connection,FC)显著增强。
  研究结果表明,对于禁烟两小时的男烟民而言,仅一剂24单位(IU)的鼻喷OT对应激诱发的香烟渴求有抑制作用。这可能与右侧下额叶皮层三角区对右侧扣带回负性情绪异常激活的抑制作用增强有关,大脑执行控制能力的提高缓解了香烟渴求和负性情绪等戒断症状,且负性情绪的降低和应激诱发的吸烟渴求之间存在显著的正相关。
  本研究首次探究了神经肽催产素OT对于应激诱发香烟渴求的生理和心理影响,对未来吸烟成瘾的治疗找到更加有效的治疗靶点和方案提供了理论和初步临床依据。
[硕士论文] 杜丰
神经生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:一、通过电生理验证多脑区甘氨酸受体分布
  甘氨酸是神经系统中最为重要的抑制性神经递质之一,对神经系统功能的稳定有着重要的调节作用。甘氨酸受体在脊髓和脑干大量分布,但在高级脑区也有少量分布。现代科研人员通过同位素标记,原位杂交等方法确认了甘氨酸受体分布的脑区。但是对于甘氨酸受体具体是分布在突触后,突触前,还是突触外,并没有一个系统的回答。在本研究中,重点探索了与甘氨酸受体联系密切的脑区,杏仁核,PAG,Pnc,脑干等。研究发现,在杏仁核中,甘氨酸受体在突触前,突触外,突触后均有分布。杏仁核的甘氨酸受体的EC50要比脑干中甘氨酸受体的EC50大。甘氨酸对杏仁核的自发性抑制性突触后电流有影响。在PAG和Pnc中,甘氨酸受体在突触前和突触后均有分布。
  二、蓝光照射对发育中小鼠学习记忆能力的影响
  每当人们提到晒太阳时,都会想到温暖舒适之类的词汇。心情郁闷时,晒一晒太阳,立刻感觉就不一样了。科学研究表明晒太阳能够影响认知行为,降低抑郁症状,促进骨骼发育,预防佝偻病。那么阳光对发育过程中的学习记忆能力有无影响呢?在这个课题研究中,因为蓝光所携带的能量较强。我们所采用的光照不是自然光,而是蓝光。当然紫外线的能量更强,但是紫外会损伤皮肤。通过实验发现蓝光对幼年小鼠的学习记忆能力有提升。蓝光对成年小鼠的学习记忆能力没有影响。电生理实验表明,发育中接受蓝光光照的小鼠海马mEPSC的幅度发生变化。并且突触囊泡的大小和释放量都显著增加。
[博士论文] 刘丽娜
生物学;遗传学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:大脑能够接收感觉神经系统获得的信息,并将得到的信息进行处理和整合后输出,以此来生存或躲避危险。大脑是通过无数个功能模块完成该过程的。无论是外周神经系统还是中枢神经系统,每个功能模块包含多个发挥类似功能的神经束或神经微环路,这些神经束重复堆叠形成成层成束的结构。这样的排列方式有助于保证外界刺激的空间和时间信息能够被高保真地传递到中枢神经系统中,并有利于信息的整合。然而,如何在狭小而紧密的空间内确保不同的神经元成束排列并形成正确的突触联系的分子机制还不清楚。
  Neurexin是一类细胞黏附分子,能与Neurolgin结合参与突触形成和突触传递的过程。在本研究论文中,我们以果蝇视觉系统为研究模型,运用遗传学、分子生物学和生物化学、细胞生物学以及发育生物学等方法解析了细胞黏附分子Neurexin限制L4神经元轴突在单个神经束中的分子机制。首先,我们发现果蝇L4神经元缺失Drosophila Neurexin(DNrx)会导致其轴突末端异常投射到邻近神经束中;接着鉴定了DNrx可以通过其胞内端与Ephrin胞内端相互作用,而缺失DNrx会导致Ephrin表达水平的下降且呈弥散分布。而在L4神经元中敲减Ephrin足以导致其轴突异常投射到邻近神经束中。我们又利用细胞实验证实DNrx可以通过与Ephrin结合促进Ephrin在细胞膜上的聚集,进而调控L4神经元的成束排列;最后,我们揭示了在L4神经元下游的Tm2神经元中敲减Drosophlia Neuroligin4(DNlg4)会导致L4神经元轴突异常投射到邻近神经束中。
  本研究不仅揭示了Eph/Ephrin信号通路在神经元成束排列过程中的作用,而且将轴突导向和突触形成两个连续发生的过程紧密联系起来,提出了Neurexin在轴突导向过程中的新作用。
[博士论文] 袁良帅
内科学(心血管疾病) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  研究棕榈酸对于人主动脉内皮细胞功能及血管生成的影响;阐明HIPPO信号通路在血管内皮细胞及其血管生成中的作用;探讨HIPPO信号通路与STING-IRF3信号通路在棕榈酸诱导下的相互间作用与影响;研究线粒体损伤及mtDNA在血管内皮细胞中的作用,阐明在血管内皮细胞中,棕榈酸刺激下线粒体损伤对于STING-IRF3信号通路及血管生成的影响。
  研究方法:
  1.细胞培养及转染:使用5%血清的内皮细胞专用培养基(ECM)于5%CO2,37℃细胞专用孵箱中培养人主动脉内皮细胞。细胞基因沉默采用lipofectamine2000配合siRNA进行,采用1X Opti-MEM培养基转染6小时后更换条件培养基,转染过程按照生产商说明书进行;过表达基因采用lipofectamine3000及P3000转染试剂在1X Opti-MEM中进行,操作过程参照生产商说明书。
  2.棕榈酸(PA)的配置及对内皮细胞的处理:采用白蛋白包被法,将用乙醇溶解好的PA按比例滴入到20%不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白溶液配制成0-5mM的PA储存液冷冻于-20℃中保存。在使用PA刺激内皮细胞时使用ECM培养基按10倍比例稀释PA存储液至工作液浓度0-0.5mM后处理人主动脉内皮细胞至不同时间点,并按实验需求进行后续必要处置。
  3.蛋白提取及Western blot实验:细胞处理完毕后使用Western及IP专用细胞裂解液严格按照说明书提取细胞蛋白,调节蛋白浓度并于95℃变性后于-20℃或-80℃保存,新鲜的蛋白提取液或于4℃复温的蛋白提取液使用SDS-PAGE凝胶进行电泳分离后转移至PVDF膜,封闭后4℃过夜孵育一抗,采用辣根过氧化物酶二抗配合ECL化学发光液及化学发光仪曝光并显影目的蛋白条带,条带的分析采用Image J软件。
  4.免疫荧光实验:细胞预先接种至铺置10mm细胞爬片的6孔板中,处理完毕后采用免疫荧光专用固定液固定后使用TritonⅩ100打孔,采用10%山羊血清或1%BSA封闭后孵育一抗,采用荧光二抗及DAPI孵育后使用激光共聚焦荧光显微镜或EVOS倒置荧光显微镜观察拍照。
  5.BrdU荧光增殖实验:培养基中按10ug/ml的浓度于处理结束前6小时加入BrdU试剂,基本过程同免疫荧光实验,TritonⅩ100打孔后,使用2mol/L的HCL溶液进行染色质固定及PH8.3的0.1mol/L的硼酸钠中和后继续封闭、孵育一抗、二抗、DAPI及激光共聚焦荧光显微镜显影拍照过程。
  6.BrdU流式增殖实验:细胞接种至6孔板中,培养基中按10ug/ml的浓度于处理结束前6小时加入BrdU试剂,处理完毕后使用0.125%胰酶消化悬浮细胞,保持细胞悬浮状态下进行4%多聚甲醛固定、TritonⅩ100打孔、染色质固定、封闭及孵育1抗过程,使用流式细胞仪检测样品,结果分析采用Flowjo10.0流式软件或kaluza1.5a专用流式分析软件进行。
  7.划痕/迁移实验:内皮细胞于6孔板使用条件培养基培养至100%融合后使用200ul黄色移液器枪头制造划痕,并于不同时间点观察并记录划痕宽度,采用(最初划痕面积-时间点面积)/最初划痕面积的比率评价细胞迁移效果,采用EVOS倒置荧光显微镜拍照,结果分析采用Image J软件。
  研究结果:
  1.棕榈酸能抑制血管内皮细胞增殖、迁移及体外基质的血管新生:
  (1)BrdU增殖实验表明,加入PA处理后,人主动脉内皮细胞的增殖程度明显受到抑制,并且这种抑制随着PA浓度的升高变得更加明显。
  (2)划痕/迁移实验表明,PA可以明显抑制人主动脉内皮细胞的迁移,而且呈现明显的浓度梯度性
  (3)体外管形成实验表明,PA的存在的可以明显抑制人主动脉内皮细胞形成新的血管,随着PA的浓度升高,人主动脉内皮细胞形成新的、更多的血管的能力被明显的削弱。
  2.PA可以明显激活MST并且影响YAP的功能及细胞定位:
  (1)通过Western blot可以看出,加入PA后MST磷酸化明显增加,并且MST总蛋白含量较对照组有所升高,而YAP的磷酸化同样较对照组明显增加。
  (2)通过细胞免疫荧光实验结果显示,PA的存在明显阻止YAP的核转位,加入PA后绝大多数的YAP无法进入细胞核而滞留在细胞浆中,说明PA的存在抑制了YAP的功能。
  (3)BrdU增殖实验表明,过表达YAP或人工突变YAP S127磷酸化位点致使YAP不能被正常磷酸化后,明显刺激了内皮细胞增殖及抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力。
  (4)体外管形成实验表明,过表达YAP或人工突变YAP S127磷酸化位点可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。
  3.MST1参与了PA对于内皮细胞功能和血管生成的调节:
  (1)Western blot实验中可见,加入PA后增加了YAP的磷酸化水平,而当下调/沉默MST1基因表达时,PA对于YAP的磷酸化出现明显的减弱,表明PA正是通过MST1磷酸化了YAP。
  (2)细胞免疫荧光实验可见,PA在对照组增加了YAP在细胞质中的滞留,阻止了YAP进入细胞核,而当下调/沉默MST1基因表达后,更多的YAP得以进入细胞核中,PA的阻止效果被明显削弱。
  (3)BrdU增殖实验表明,下调/沉默MST1基因表达可以明显刺激内皮细胞增殖并明显加强了内皮细胞抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力。
  (4)体外管形成实验表明,下调/沉默MST1基因表达可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。
  4.PA导致了线粒体的损伤并且这种损伤激活了cGAS-STING-IRF3通路:
  (1)线粒体膜电位检测说明,PA引起了线粒体膜电位的去极化,导致了线粒体膜的不稳定及破坏,并且这种破坏在PA加入的早期便开始发生。
  (2)细胞免疫荧光实验及实时定量PCR实验表明,加入PA后线粒体结构发生变化,在胞浆中可见更多的双链DNA的存在,说明线粒体损伤后出现了更多的损伤的mtDNA。
  (3)Western blot实验表明,PA早期导致了线粒体的损伤,并且激活了cGAS-STING-IRF3通路及影响了HIPPO通路,而这种作用呈现一定的时间先后性及顺序性。
  (4)Western blot实验及细胞免疫荧光实验可见,使用CCCP制造线粒体损伤后,cGAS-STING-IRF3依旧被激活,蛋白表达水平明显变化,而加入CCCP后明显增加了IRF3的核移位及导致STING在核周大量聚集,说明线粒体损伤的确激活了cGAS-STING-IRF3通路。
  5.cGAS-STING-IRF3通路参与了PA对于HIPPO通路的调节:
  (1)Western blot实验表明:加入PA后可以激活cGAS-STING-IRF3通路及影响HIPPO通路,而无论下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节时,PA对于HIPPO通路的影响均明显被削弱,说明cGAS-STING-IRF3通路参与了PA对于HIPPO的影响和调节。
  (2)细胞免疫荧光实验进一步表明,当下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节时,PA对于HIPPO通路核心蛋白YAP的核转位的阻止受到了明显的削弱,进一步证明cGAS-STING-IRF3通路参与了PA对于HIPPO的影响和调节。
  6.PA激活了IRF3并增加了IRF3与MST1启动子序列中结合从而促进MST1表达:
  (1)PA的刺激可以增加MST1基因表达水平,而当下调/沉默STING-IRF3后,MST1的基因水平较对照组出现明显减少。
  (2)通过分析MST1启动子基因序列发现,其上有多个工RF3结合位点。
  (3)免疫染色质沉淀实验表明:PA及CCCP的刺激诱导并增加了IRF3与MST1启动子序列的结合。
  7.cGAS-STING-IRF3通路参与到了PA对于内皮细胞功能及血管生成的调节当中:
  (1)BrdU增殖实验表明,下调/沉默cGAS-STING-IRF3通路中任一环节基因表达可以明显刺激内皮细胞增殖并明显加强了内皮细胞抵御PA刺激伤害的能力,增加了内皮细胞在PA中存活的能力
  (2)体外管形成实验表明,cGAS-STING-IRF3通路中任一环节基因表达可以促进内皮细胞的血管生成能力,并且即使在有PA的刺激下,内皮细胞较之对照组仍形成了更多的新生血管。
  研究结论:
  (1)棕榈酸能够明显抑制内皮细胞功能,增加其凋亡,抑制其体外基质的血管新生。
  (2)棕榈酸可以影响HIPPO通路功能状态及其关键蛋白的表达水平。
  (3)HIPPO信号通路参与到了棕榈酸对血管内皮细胞的抑制当中。
  (4)棕榈酸可以导致线粒体损伤并能激活cGAS-STING-IRF3通路
  (5)cGAS-STING-IRF3通路参与到了棕榈酸对HIPPO通路的调节当中。
  (6)cGAS-STING-IRF3通路参与到了棕榈酸对血管内皮细胞的抑制当中。
[硕士论文] 刘丽娜
运动人体科学 北京体育大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  以青藏高原为核心的世界“第三极地区”(面积约500万平方公里,平均海拔超过4000米),是全球独一无二的地质、地理、资源、生态耦合系统单元,随着一带一路政策的实施,对高原人群相关的生理与医学问题的研究和探讨有待于进一步深入。本研究首次对世居高原的藏族和汉族男大学生的心脏结构、功能的种族性差异性进行研究,以期发现导致生理性差异的主、客观影响因素,为高原适应性研究提供新的思路和线索。
  研究方法:
  本研究选取西藏大学在读男性大学生,严格按照纳入、排除标准,随机选取30名出生且生活在海拔3500米左右的藏族和汉族男性大学生作为受试对象。受试者身高、体重无明显差异,必须不曾罹患心、脑、肺疾病;没有先天性心脏病、高血压、冠心病以及可能引起心脏功能及结构改变的疾病;所有受试者均签署知情同意书。受试者由同一位医生测试,经过彩色多普勒超声诊断仪对受试者的左心房、左心室、右心房、右心室的内径以及室间隔厚度,并对主动脉根径和内径、肺动脉内径进行测量;对受试者左心室射血分数(EF)、左心室舒张末期容积(EDV)、主动脉流速、肺动脉流速、肺动脉加速时间、二尖瓣E峰、二尖瓣A峰、三尖瓣E峰、三尖瓣A峰、等参数值进行观察,收集数据。
  研究结果:
  世居高原的藏族男性大学生主动脉内径(p<0.05)、主动脉根径(p<0.01)均显著窄于汉族,但其主动脉瓣口流速(p<0.05)与肺动脉瓣口流速(p<0.01)均显著快于汉族,且有关左心功能的指标,藏族与汉族男性大学生并无显著性差异(p>0.05)。
  研究结论:
  汉族男大学生较藏族男大学生在心室、心房内径及室壁厚度差异较小,考虑与长期环境相适应的结果;世居高原的藏族之所以对高原环境具有较好的适应能力,可能与藏族人群左、右心室收缩能力较强有关;世居高原的藏族之所以对高原环境具有较好的适应能力,可能是左、右心室收缩能力较强,而左心室和右心室的舒张能力可能会随汉族人群习服而继续遗传给汉族后代,而心室的收缩能力可能并不那么容易通过遗传获得,可能需要较为长久的高原生活时间,需要世世代代的传承。
[硕士论文] 李娜
生理学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  胰岛主要由分泌胰高血糖素的α细胞,分泌胰岛素的β细胞,分泌生长抑素的δ细胞,分泌饥饿激素的ε细胞以及分泌胰多肽的PP细胞构成。其中胰岛β细胞作为体内分泌胰岛素的唯一细胞类型,在血糖调节中起着至关重要的作用,β细胞的功能异常通常会导致糖尿病等代谢性疾病,因此β细胞一直是研究的热点。随着研究的不断深入,人们发现,在胰岛中不同的细胞类型之间存在相互的调节作用。胰岛δ细胞通过旁分泌生长抑素的方式对胰岛α细胞和β细胞的活性进行调控。由药物或遗传因素导致的δ细胞中生长抑素的异常分泌,可导致β细胞的内分泌功能失调,并进而引发糖代谢紊乱和相关代谢性疾病。
  尽管胰岛δ细胞的研究已经取得了一定的进展,但对于其功能尤其是在血糖稳态调控中的作用,目前仍存在较大争议。已有研究表明,尽管生长抑素基因敲除小鼠的进食后胰岛素和胰高血糖素分泌水平均有显著增高,但这些小鼠依然具有和正常小鼠相似的体重、胰岛形态、胰岛素和胰高血糖素含量、静息血糖水平和胰岛素敏感度。因此,这些研究结果提示胰岛δ细胞可能并不参与静息状态下血糖调控。为了对这一问题进行深入研究并进一步解析δ细胞在胰岛环路以及血糖稳态中的作用,本实验利用Cre-LoxP重组酶系统,构建了可在分泌生长抑素的细胞中特异性表达白喉毒素A片段的小鼠。由于白喉毒素A片段能够抑制蛋白质的合成进而杀死细胞,因此小鼠体内δ细胞可被特异性敲除。对该δ细胞特异性敲除小鼠的生理表型进行了研究,并采用连续切片技术和免疫荧光的方法,通过胰腺组织的免疫荧光共染,实时定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等实验方法进一步研究了δ细胞在血糖稳态调节中的作用。
  方法:
  本实验选用的实验鼠为C57BL/6J小鼠,分别为胚胎期12.5天(E12.5)、15.5天(E15.5)和18.5天(E18.5)的胚胎鼠,新生1天的小鼠(P1),以及出生后1周(1week)和8周(8week)小鼠,以及SSTCre(+/+)和R26DTA(+/-)两种工具鼠,两者杂交获得SSTCre(+/-)和S STCre(+/-);R26DTA(+/-)两种实验鼠。另外还选用wistar大鼠乳鼠。取各时间点小鼠的胰腺,运用连续切片技术和免疫荧光的方法,通过胰腺组织的免疫荧光共染,包括生长抑素和胰岛素的共染以及生长抑素与胰高血糖素的共染,直观显示胰岛δ细胞在小鼠不同发育阶段的形成及分布情况。通过免疫荧光和激光共聚焦显微技术以及Q-PCR的方法验证SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)鼠胰岛δ细胞的特异性敲除情况。通过生长抑素和胰岛素的共染以及生长抑素与胰高血糖素的共染,直观显示δ,α和β细胞在SSTCre(+/-)和SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)这两种小鼠以及各时间点小鼠中的数目和分布情况。通过Q-PCR的方法检测小鼠中胰高血糖素,胰岛素,胰多肽和饥饿激素的mRNA水平。采用ELISA实验分别检测小鼠血浆和胰腺中胰岛素和胰高血糖素的含量。
  结果:
  通过系统研究胰岛δ细胞的发育发现,E15.5时δ细胞开始分化出现;E18.5天和P1的小鼠胰岛初步形成,但尚不规则;1周小鼠胰岛基本规则成型;4周和8周小鼠胰岛形状稳定规则;δ细胞分布于胰岛的外周。通过免疫荧光实验和Q-PCR确证了SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰岛内的δ细胞敲除情况。δ细胞特异性敲除小鼠表现出严重的低血糖症状,其体重与血糖水平均明显低于SSTCre(+/-)对照组小鼠,并于出生后24小时内死亡,通过给其皮下注射葡萄糖可以在一定范围内延长SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的平均寿命。ELISA的实验结果显示,SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠血浆中的胰岛素水平明显高于SSTCre(+/-)小鼠,并且SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠胰腺内的胰岛素和胰高血糖素含量均高于SSTCre(+/-)小鼠。免疫荧光实验结果表明,虽然SSTCre(+/-);R26DTA(+/-)小鼠的胰岛细胞总数目相较于S STCre(+/-)小鼠并无明显差别,但是δ细胞的特异性敲除导致小鼠胰岛内α细胞和β细胞的比例明显上升。
  结论:
  本实验的结果直观的显示了小鼠胰岛δ细胞的产生和分布情况,胰岛δ细胞的发生及其与胰岛内其他内分泌细胞之间的相互作用与胰岛发育过程密切相关。胰岛δ细胞可能通过旁分泌的方式对胰岛的形态发生和发育起到重要的调控作用。研究发现,胰岛δ细胞的特异性敲除,导致小鼠胰岛内分泌细胞的比例变化,并进而导致胰岛素和胰高血糖素的分泌增多,引发新生鼠血糖过低致死。该研究结果从细胞整体水平揭示了δ细胞对胰岛内分泌细胞的发生发展过程,以及对血糖稳态,尤其是对静息状态下的血糖稳态,均起到关键的调控作用。
[博士论文] 徐许峰
细胞生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:学习记忆的巩固过程是将获取的短时记忆转变为长时记忆的渐变过程。近年来的研究发现,基因和蛋白信号通路的激活表达等过程都参与了记忆的巩固过程。记忆获得后的基因转录表达和蛋白合成对记忆的巩固过程起到十分重要的作用。然而,目前已经发现的miRNA有成千上万种之多,这么多的miRNA是否都在学习记忆过程中发挥作用?不同的miRNA在学习记忆中发挥相同还是不同的作用?哪些miRNA参与海马脑区的学习记忆过程?这一问题目前尚不清楚。
  目的:
  探究在CFC(场景性恐惧记忆)记忆巩固过程中发生内在表达变化miRNA;通过特异性阻断或过表达这些miRNA,在动物整体水平探究缺失或过表达特异的miRNA后对学习记忆巩固过程的影响,明确这些miRNA在学习记忆过程中的功能,并探究其分子调控机制,确定其参与学习记忆巩固过程所调控的靶基因或信号通路,为今后以特异性miRNA为靶点改善神经退行性疾病所造成的记忆缺陷提供理论依据。
  方法:
  1. 探究在CFC训练后海马脑区发生表达变化的miRNA
  1.1 通过基因芯片分析CFC训练后海马脑区发生变化的miRNA
  取8周大小的C57/BL6雄性小鼠,进行CFC训练,在CFC训练后1小时取海马脑区,以单独给予足底电击刺激后1小时的海马脑区为其对照,在杭州联川生物有限公司进行基因芯片分析,对芯片结果中信号强度大于500的miRNA进行分析,找到在CFC训练后发生显著变化的miRNA。
  1.2 RT-PCR验证上述被筛选出来的miRNA在CFC训练后1小时的变化
  我们将上述基因芯片筛选出来的所有miRNA进行RT-PCR的验证,发现在CFC训练1小时之后miR-181a,miR-126,miR-222,miR-143,miR-151a等miRNA水平上调,而miR-125,miR-690二者的水平下调。
  1.3 海马脑区特异性阻断上述miRNA后检测其对小鼠CFC学习记忆的影响
  我们采用不同的antagomirs来特异性阻断相应的miRNA。我们在给小鼠海马脑区分别注射miR-143和miR-181a的antagomirs之后,进行CFC训练及测试,结果发现海马脑区miR-143被阻断后对场景性恐惧记忆的获得和巩固过程均无影响;而阻断miR-181a后小鼠场景性恐惧记忆的获得并未受到影响,而巩固过程则受到明显损伤,这个实验说明miR-181a参与小鼠CFC的巩固过程,而miR-143则可能不参与。接下来,为了验证其他有变化的miRNA在海马依赖性学习记忆中的功能,我们会继续将不同miRNA的antagomirs注射进小鼠海马脑区,进行CFC训练和测试,观察其是否对小鼠的学习记忆功能产生影响。
  1.4 海马脑区特异性过表达上述miRNA后对CFC学习记忆的影响
  我们将采用慢病毒注射的方式在海马脑区来特异性过表达不同的miRNA,在注射过表达慢病毒四周后进行CFC训练和测试,观察过表达miR-181a或其他miRNA能否对小鼠场景性恐惧记忆产生影响。
  2. 探究miR-181a及其他miRNA参与CFC记忆巩固过程的调控机制
  2.1 Luciferase reporter assay验证miR-181a对PRKAA1和REDD1的调控
  通过前期实验发现,miR-181a参与海马脑区CFC记忆的巩固过程。miRNA在细胞中通常是作为一种转录抑制因子而存在,那么miR-181a究竟是通过调控何种靶基因来参与海马脑区CFC记忆的巩固过程的呢?我们首先通过不同的软件(Targetscan,miR-22,miRDB,microcosm)预测在细胞中可能受到miR-181a调控的靶基因,然后将每个软件预测出的结果通过KEGG分析这些受miR-181a调控的靶基因所在的信号通路,最后将这四个软件的KEGG分析结果取交集,缩小筛选范围。通过这种方法,我们发现mTOR信号通路中的PRKAA1和REDD1这两个蛋白可能是受到miR-181a调控的靶基因。为了验证我们的预测是否准确,我们将这几个基因与miR-181a结合的3'UTR区域连接到特殊的质粒上,并将其种子序列进行了突变处理作为对照,然后分组进行Luciferase reporter assay实验,验证PRKAA1和REDD1在细胞中是否受到miR-181a的直接调控。
  2.2 CFC训练后miR-181a对PRKAA1和REDD1蛋白变化的调控
  我们拟在CFC训练之后0小时,1小时,2小时,4小时,8小时分别取材,检测这两个蛋白的表达水平。接下来,我们想通过在小鼠海马脑区注射antagomirs来特异性阻断海马脑区的miR-181a,然后再给予小鼠CFC训练刺激,最后取出小鼠海马脑区检测在阻断miR-181a后,CFC训练刺激能否依然降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平。通过上述实验,我们将判断在CFC记忆过程中,miR-181a能否调控PRKAA1和REDD1这两个靶蛋白。
  2.3 miR-181a参与CFC记忆的巩固过程依赖其靶基因PRKAA1和REDD1
  为了更深入的研究miR-181a能否调控靶基因PRKAA1和REDD1参与海马CFC记忆的巩固过程,我们将在行为学层次探究miR-181a参与海马CFC记忆的巩固是否依赖于PRKAA1和REDD1这两个靶基因。
  3. 探究miR-181a对mTOR信号通路的调控
  我们首先拟在CFC之后不同时间点检测mTOR蛋白的活性变化。接下来我们首先要探究海马脑区miR-181a在CFC训练后能否调控mTOR蛋白的活性。我们在小鼠海马脑区注射miR-181a的antagomirs来阻断miR-181a,然后对这些小鼠进行CFC训练,训练结束后4小时取出小鼠海马脑区,检测mTOR蛋白活性的变化,观察阻断miR-181a之后能否阻断CFC训练引起的mTOR蛋白活性升高,以此来观察在CFC记忆巩固过程中miR-181a能否调控mTOR蛋白的活性变化。
  结果:
  1. CFC训练之后1小时海马脑区miR-181a的表达升高
  我们在CFC训练后1小时和6小时取小鼠海马脑区,通过RT-PCR验证发现,在CFC训练后1小时,miR-181a表达显著升高,而单独给予环境暴露或足底电击刺激并不能提高miR-181a的表达水平。
  2. miR-181a参与调控小鼠CFC记忆的巩固过程
  我们将小鼠海马脑区miR-181a阻断后,进行CFC训练和测试后发现,阻断小鼠海马脑区miR-181a并不影响小鼠CFC训练和短时记忆,但损伤了小鼠CFC的长时记忆。相反,过表达miR-181a后,在低电流刺激下,小鼠CFC记忆的巩固过程显著增强。随后,我们发现,阻断小鼠海马脑区miR-181a并不影响小鼠的运动能力及焦虑样行为。
  3. miR-181a调控的靶基因筛选
  我们首先采用Targetscan,miR-22,miRDB,microcosm这四种预测软件预测miR-181a可能调控的靶基因。随后采用KEGG分析方法,将每一种软件预测出的众多靶基因都用KEGG分析其所在的信号通路。最后将四种软件的KEGG分析结果取交集。我们发现所有预测出的信号通路中都包含mTOR信号通路。在mTOR信号通路中,PRKAA1和REDD1这两个分子都被预测到可能受miR-181a的调控。我们通过luciferase reporter assay实验验证发现,PRKAA1和REDD1在细胞中受到miR-181a的调控,是miR-181a的靶基因。
  4. PRKAA1和REDD1在CFC训练之后的表达下调受到miR-181a的调控
  我们取na(i)ve以及CFC训练后0小时,1小时,2小时,4小时和8小时小鼠的海马脑区,检测其中PRKAA1、REDD1和mTOR活性的变化情况。实验结果表明,在CFC训练后4小时,PRKAA1和REDD1的蛋白水平显著下调,而mTOR活性水平显著升高。当阻断小鼠海马脑区的miR-181a后,小鼠海马脑区的PRKAA1和REDD1蛋白水平显著提升,而CFC训练刺激能够显著降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平;当阻断miR-181a后再进行CFC训练刺激后小鼠海马脑区的PRKAA1和REDD1蛋白水平则不再下调,而mTOR活性也不再升高。这个实验说明,在CFC训练后,小鼠海马脑区的miR-181a能够调控mTOR信号通路的蛋白变化。
  实验结论:
  1. 通过本课题的研究,我们发现miR-181a参与了小鼠海马脑区的CFC记忆的巩固过程。
  2. 通过软件预测和luciferase reporter assay实验验证发现miR-181a能够调控mTOR信号通路中的两个上游分子PRKAA1和REDD1。
  3. 我们发现PRKAA1和REDD1能够参与小鼠海马脑区CFC记忆的巩固过程。
  4. 我们确定了在小鼠海马脑区CFC训练过程中,上调的miR-181a能够抑制靶蛋白PRKAA1和REDD1的表达,继而激活mTOR蛋白,最终参与CFC记忆的巩固过程。
  5. 我们的实验为进一步了解miRNA在学习记忆中的功能提供了理论基础,为日后以miRNA为基础治疗临床疾病提供了理论指导。
[博士论文] 高绍兵
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:视觉是我们获取外部信息的最主要方式。理解生物视觉系统的信息处理机制能够帮助我们更好地理解大脑的工作原理。视觉自适应性是视觉系统的最重要特性之一,视觉自适应性使得我们能够在复杂的动态环境下,保持对外部世界的可靠感知;其中的视觉颜色恒常性则让我们能够稳定地感知外部世界的真实颜色。本文以计算视觉理论为基础,通过模拟生物视觉系统的信息处理机制和外部刺激(如自然图像)的统计特性,以及场景中的光源、物体和视觉系统三者之间的交互作用,来发展有效的计算机视觉方法,为视觉颜色恒常和自适应性提供可行的理论计算框架和假设。
  本文第一部分工作研究单光源条件下的视觉颜色恒常性(第二章)。其中的第一个贡献是,我们通过模拟初级视觉皮层中的双拮抗神经元机制,发现双拮抗神经元对一幅色偏图像的响应有效地包含了场景光源颜色的信息。基于此发现,我们提出双拮抗神经元通过编码场景中的光源颜色来帮助视觉系统实现颜色恒常性。
  本文关于单光源下视觉颜色恒常性的第二个贡献是,通过对大量的自然图像进行统计分析发现,通过局部图像块估计的反射率之和与标准无色偏图像的反射率之和的比值具有统计不变性(statistical invariance)。基于此统计性约束和图像的物理成像模型,我们提出三通道估计误差不变性(Achromatic-Estimation-Invariance,achroEI)的假设,并将其用于从一幅色偏图像中快速地估计出场景的光源颜色。
  本文第二部分(第三章)工作研究多光源条件下的视觉颜色恒常性。该工作的主要贡献是,提出了一个基于视觉机制的多光源颜色恒常性模型。我们假设自底向上(bottom-up)的视觉信息处理机制提供一个粗糙的,但快速的光源颜色图估计传导到高级视觉区域(比如V4),而自顶向下的机制(top-down),比如光源先验则进一步对经过自底向上处理所传导过来的视觉信号进行约束,获得更精确的光源颜色估计。
  本文的第三部分(第四章)工作研究不同相机(或视觉)颜色响应函数下的视觉颜色恒常性问题。我们发现,现有的基于学习的颜色恒常性模型的泛化能力非常有限,无法直接应用于多相机下的颜色恒常性。本文首次提出,在建立颜色恒常性模型的时候同时考虑相机的颜色响应函数和场景光源颜色的影响,我们的模型能够更准确地恢复出场景的真实颜色。
  本文的第四部分(第五章)工作研究视觉自适应性问题。我们通过模拟自然图像中的非线性统计规律(homogeneity和heterogeneity)建立模型,发现大脑中存在着一个由经典感受野和非经典感受野组成的动态神经元网络,它是大脑处理信息的最基本单元(texton),能够自适应地根据视觉输入的模式,比如,视觉信号在空间和时域上的统计结构变化,调整自身的状态,以应对自然场景中的复杂信息变化。我们发现神经元网络状态的变化,比如,模型的期望和由神经元网络结构决定的似然函数,能够很好地预测神经电生理实验中所观察到的各种神经元自适应现象。
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