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[硕士论文] 杨倩
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本课题从蕲春蕲艾(Artemisia argyi)根茎部分离纯化得到一株内生真菌命名为HCH285,之后进行菌种鉴定、bostrycin方法学构建,同时对该HCH285内生菌代谢产物和bostrycin进行安全性和活性分析,主要结果如下:
  1.HCH285菌种鉴定。利用微生物学与分子生物学两种方法对HCH285内生真菌进行鉴定。微生物形态学观察发现菌落呈圆形,生长初期为白色绒状毛且生长蓬松,后期逐渐成红色且菌落背面的红色产物也清晰可见。HCH285菌丝体为无色有隔菌丝。它产单个、球形或椭圆形、黑色光滑的分生孢子。此外通过分子生物学技术对其ITS序列测定确定该菌株属于黑孢霉属球黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)。
  2.HCH285内生菌产bostrycin分离制备方法建立。利用多种化学试剂对HCH285内生菌代谢产物提取,确定乙酸乙酯为最佳萃取试剂,以半制备液相进行化合物分离,优化卷线孢菌素bostrycin的HPLC制备方法,使用高效分析型液相检测分离纯度,其分离制备方法为:柱温∶30℃,进样体积∶700μL,流速∶3mL/min,流动相比例:甲醇∶0.3%甲酸=50∶50(v/v),检测时间∶30min,紫外检测∶02nm;采用400MHz核磁共振波谱仪进行结构鉴定确定为卷线孢菌素bostrycin。
  3.Bostrycin活性分析。Bostrycin抗氧化活性分析证明,对三种自由基抗性顺序由大到小为O2->DPPH->OH-。它的抗菌活性表明有较好的抗菌作用,对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌较好。CCK-8法体外抗癌活性研究表明对U251,B10F16癌细胞的半致死浓度分别为4.30μM和6.05μM。
  4.Bostrycin及HCH285菌代谢色素的安全性分析。引入秀丽隐杆线虫(C.elegans)为生测材料,以食品级红曲红色素为对照,研究对C.elegans各生理指标的影响。试验表明HCH285菌产色素对C.elegans的急性与慢性毒性、摄食与运动能力、生长发育状态、卵块孵化率,均没有明显抑制作用且与食品级红曲红色素作用效果一致,综合各指标显示500μg/mL内为安全剂量。以相同方法和指标,分析bostrycin对C.elegans作用,确定剂量在10μg/mL内无毒副作用。
[硕士论文] 程仕强
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着健康观念变化和医学模式转变,中医药越来越显示出其独特的优势和不可替代的作用。红景天作为中医药应用历史悠久,被人们称为“雪域人参”。红景天苷是红景天根部的主要活性成分,具有多种药理功能,其在抵抗炎症和脂肪代谢中发挥重要作用,但其中机制尚不明确。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,可通过极化发挥抗炎或促炎的作用,同时巨噬细胞内的脂肪代谢与巨噬细胞的功能有着紧密的联系。已有研究证明,脂肪量和肥胖相关基因(FTO)能够抑制促炎细胞因子表达。为了更好了解巨噬细胞的功能和探索红景天苷的潜在药用功能,本研究探讨了红景天苷对巨噬细胞极化以及巨噬细胞内脂肪代谢重要调节分子的影响。
  本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究模型,用红景天苷(100μM)预处理1h后,以LPS(1μg/mL)或IL-4(20ng/mL)诱导巨噬细胞分别向M1与M2方向极化,通过RT-qPCR方法检测M1型极化标志基因iNOS、IL-6、IL-1β和M2型极化的标志基因ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平。结果显示iNOS、IL-6、IL-1βmRNA相对表达水平较LPS单独处理组显著下调,而ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平与IL-4单独处理组相比发生上调,说明红景天苷能够抑制巨噬细胞M1型极化和促进巨噬细胞M2型极化。通过Western blot方法检测Akt蛋白S473位点磷酸化水平,红景天苷能够抑制LPS诱导Akt S473位点的磷酸化水平,红景天苷可以通过影响巨噬细胞的Akt信号通路来调控巨噬细胞极化。使用红景天苷预处理后检测Poly(I:C)(5μg/mL)刺激巨噬细胞诱导的炎症关键基因iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,结果表明:iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著降低,说明红景天苷可能对病毒感染引起的炎症也具有保护作用。在巨噬细胞中超表达FTO,红景天苷预处理后,加入LPS刺激,检测促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平。结果显示IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平显著降低,说明超表达FTO能够抑制LPS引起的炎症因子的表达进而影响巨噬细胞的抗炎作用。为了更进一步研究红景天苷对巨噬细胞脂质代谢的影响,红景天苷预处理细胞,再加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO的mRNA表达水平。结果显示,FTO的mRNA表达水平降低,红景天苷对巨噬细胞炎症中的FTO有调控作用。使用红景天苷预处理,加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO/SREBP1c/CIDEc信号通路中脂肪合成的重要调节因子SREBP1c和促进脂滴合成的关键蛋白CIDEc的mRNA表达水平。结果显示,红景天苷能够抑制脂肪积累过程中关键基因SREBP1c和CIDEc的mRNA水平的表达,从而可能降低巨噬细胞中的脂质积累。
  总之,我们结果表明红景天苷可以调控巨噬细胞极化以及影响巨噬细胞内脂质代谢相关重要调节分子的表达,从而调控机体的炎症反应。
[博士论文] 聂荣祖
食品科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其A型连接的二聚体(A型EGCG二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGCG二聚体具备较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先,我们通过Thioflavin T(ThT)荧光、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS)荧光、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果,并探究了A型EGCG二聚体发挥抑制作用的关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上,以Aβ40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS、核磁共振、分子对接等研究手段探索EGCG和A型EGCG二聚体与Aβ40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:
  1.EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成抑制作用的比较研究
  ThT荧光实验结果表明,牛胰岛素蛋白在pH2.0的含20%乙酸溶液中孵育8h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用,且抑制作用随着多酚浓度增大而增强。相较于EGCG单体,A型EGCG二聚体效果更好,当其浓度达到0.35mM时,可完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验结果相符。加入0.70mM的A型EGCG二聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样纤维状结构,但有部分无定型聚集体形成。此外,采用动态光散射检测发现A型EGCG二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在,同时生成了粒径约为295nm的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG二聚体可较好地保护牛胰岛素蛋白的原始构象,阻止蛋白二级结构的改变及内部疏水性氨基酸的暴露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期,在牛胰岛素蛋白孵育过程的不同时期加入0.70mM的A型EGCG二聚体,从结果中可以看出,在0h和2h时加入0.70mMA型EGCG二聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程,并阻止原纤维的形成,促进无定型聚集体的形成,这表明A型EGCG二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结合,还可与成核寡聚体结合,并破坏其原有结构,从而达到使其丧失继续形成原纤维的能力。然而,在4h时加入A型EGCG二聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤维的形成。因此,以上研究结果证实,牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。
  2.EGCG和A型EGCG二聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究
  ThT荧光和ANS荧光检测结果表明A型EGCG二聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露,且A型EGCG二聚体的解聚效果强于EGCG单体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实A型EGCG二聚体具有更强的解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法分别分析成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化,可以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为10kDa到250kDa的聚集体,且A型EGCG二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入EGCG时的3.68倍,这表明A型EGCG二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好的解聚效果,还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。
  3.EGCG和A型EGCG二聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒性的抑制作用及机制
  选用PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。MTT实验结果表明EGCG和A型EGCG二聚体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞膜完整性,降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量Ca2+、活性氧(ROS)和一氧化氮(N0)浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性,抑制细胞内凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G)等凋亡相关蛋白的过量表达。因此,根据以上结果,我们推测清除细胞内过量的活性氧,并提高抗氧化防御酶活性是A型EGCG二聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性损伤的分子机制。
  4.以Aβ40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG二聚体较强的淀粉样聚集抑制作用机理
  ThT荧光实验结果表明A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更显著的抑制Aβ40淀粉样纤维形成的能力。30μM的A型EGCG二聚体可完全抑制Aβ40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基的暴露和Aβ40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30μMA型EGCG二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止Aβ40淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和MTT法的检测结果均证实A型EGCG二聚体可较好地抑制Aβ40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后,我们采用荧光淬灭、ESI-MS、核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与Aβ40多肽之间的相互作用机制,结果表明EGCG与A型EGCG二聚体均可与Aβ40多肽主要通过疏水相互作用结合形成非共价复合物。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可与更多具有强烈聚集倾向的氨基酸残基结合,并与Aβ40多肽之间形成更多的非共价相互作用。最后,构效关系的研究结果表明多酚化学结构中的没食子酰基基团重要性强于羟基。
[硕士论文] 陈鹤炯
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:银杏黄酮是银杏叶中的主要活性成分。大量研究表明,占银杏叶中黄酮化合物比例较少的苷元型黄酮比其糖苷衍生物更具生物活性。目前银杏黄酮水解方法较大程度上限制了水解工艺的工业化,因此寻找新型催化剂也是银杏黄酮水解研究的一个新出路。本文对比了HZSM-5、Hβ和HY三种分子筛水解银杏黄酮的效果,筛选出合适的催化剂优化得到适宜的工艺条件。另外,本文使用HZSM-5分子筛为催化剂对银杏黄酮的水解过程进行动力学分析,为HZSM-5分子筛水解银杏黄酮的工业化推广提供理论支持;最后讨论溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法在银杏黄酮苷元纯化上的应用。
  1.通过正交实验得到HZSM-5分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为140℃,反应时间为6h,银杏叶提取物(GBE)浓度为1.0mg·mL-1,催化剂用量为1.25g,溶剂为纯甲醇;Hβ分子筛催化水解银杏黄酮的最佳工艺条件为:反应温度为150℃,反应时间为8h,GBE浓度为0.8mg·mL-1,催化剂用量为0.50g,溶剂为95%的甲醇水溶液;通过多次实验认为HY分子筛不适合用于银杏黄酮的水解中。
  2.使用HZSM-5分子筛为催化剂,分析了银杏黄酮的水解过程,发现三种糖苷的水解过程均较好的符合一级反应动力学方程,r2基本全部大于0.95,并得到了三种糖苷的水解活化能。
  3.本文选择溶剂萃取法和碱提取酸沉淀法对黄酮苷元进行提纯。对比了石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等五种有机溶剂的纯化效果,结果乙酸乙酯对黄酮苷元的纯化效果最好。通过单因素实验分析了碱提取酸沉淀法的纯化效果,得出实验范围内的最佳工艺条件为提取时使用氢氧化钠溶液调节pH为9,沉淀时使用盐酸调节pH为2,使黄酮苷元含量从17.13%上升到68.83%,苷元回收率为62.93%。
[硕士论文] 付三
中药学 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:背景:灯盏花素是传统中药灯盏细辛黄酮类有效部位,收载于2015年版《中国药典》一部,其主要成分为灯盏乙素,含量高于90%,由其制作的中成药制剂广泛应用于临床治疗心脑血管疾病,疗效显著,国内外市场十分畅销。目前药典收录的灯盏花素提取纯化工艺采用了大量酸碱处理,会对生态环境造成严重污染。因此对灯盏花素提取纯化工艺进行改革研究,控制其产业化制备对生态环境造成的污染具有重要意义。此外,灯盏乙素能通过调节小胶质细胞的活化发挥抗炎作用,但其作用机制未阐明。因此探讨灯盏乙素抑制小胶质细胞活化的作用机制,可为脑缺血再灌注后损伤治疗策略提供理论依据。
  目的:改革灯盏花素提取纯化工艺,减少酸碱用量,减轻环境污染;探讨其抑制小胶质细胞活化的机制,为其在脑血管方面疾病的治疗作用提供理论基础。
  方法:取灯盏细辛粗粉,按照2015版《中国药典》所示方法,乙醇回流提取,提取液浓缩至1g/mL的含药量。用2mol/L NaOH调节浓缩药液pH至7.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;用5%HCl调节上清液pH至4.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;将上清液稀释至0.42g/mL的含药量,通过D101大孔树脂柱,2BV去离子水洗脱除杂,继续用3BV40%乙醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液回收乙醇并浓缩至3g/mL的含药量,用5%HCl调pH至2.5,静置,离心。沉淀用适量无水乙醇、去离子水、丙酮反复洗涤,干燥、粉碎后得到粗品。粗品经适量乙醇重结晶,丙酮洗涤,烘干,即得到灯盏花素提取物。使用液相质谱联用仪对所得样品分析鉴定。
  将灯盏乙素作用于LPS诱导活化的BV-2细胞,采用CCK-8法检测灯盏乙素对BV-2细胞存活率的影响。灯盏乙素(10-40μg/mL)预处理BV-2细胞1h,然后加入LPS(1μg/mL)诱导细胞活化。分别采用ELISA法和Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放量的影响。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测灯盏乙素对LPS诱导BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS及COX-2mRNA表达的影响。采用原位免疫荧光染色法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB核转移的影响。采用Western blot技术检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。
  结果:所得灯盏花素提取物经液质联用仪(HPLC-MS)分析,分别鉴定为:灯盏乙素,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,野黄芩素。其中灯盏乙素含量为94.28%,其转移率为15.6%。
  CCK-8结果表明灯盏乙素(10-40μg/mL)对正常或者LPS诱导的BV-2细胞活力无明显抑制作用。ELISA、NO试剂盒及实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS组与对照组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著升高;灯盏乙素(10-40μg/mL)组与LPS组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著降低。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,LPS组可观察到NF-κB由细胞质向细胞核的转移,灯盏乙素组与LPS组相比,NF-κB由细胞质向细胞核的转移能明显被抑制。Western blot结果显示:LPS组与对照组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、PI3K、AKT、p38、JNK及ERK蛋白的磷酸化水平显著升高,总蛋白水平无明显变化,IκB总蛋白水平显著下降;灯盏乙素组与LPS组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、AKT、p38、JNK蛋白的磷酸化水平及Ikkβ总蛋白水平显著下降,IκB总蛋白水平显著升高,p65、Ikkα、p38、JNK、ERK、PI3K总蛋白水平及PI3K、ERK蛋白的磷酸化水平无明显变化。
  结论:本研究在《中国药典》收载灯盏花素制备工艺的基础上,对其进行了提取纯化工艺改革研究,取得可靠的技术参数,为其产业化制备工艺改革避免大量酸碱使用提供了实验依据,对于保护生态环境具有重要意义。此外其抑制神经炎症作用机制研究表明,灯盏乙素能通过抑制NF-κB通路的激活,抑制AKT,p38,JNK蛋白的磷酸化来调控相关mRNA的表达,抑制炎症因子的释放,从而抑制小胶质细胞的激活,起到神经保护作用。
[硕士论文] 赵文龙
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:我国是世界上银杏叶的最大产地,银杏资源十分丰富。银杏叶中的银杏黄酮具有抗衰老、防止血管堵塞、降血压等功效,因此被广泛利用到药品、保健品等领域。目前市场产品主要是银杏黄酮含量为24%的银杏叶提取物,市场竞争激烈;为了提高产品的附加值,满足高端市场的需求,重要措施之一是通过优化提取精制工艺,增大提取物中银杏黄酮的含量。本文从原料银杏叶出发,研究提取精制银杏黄酮的方法,主要研究内容如下:
  1)本文建立了分光光度法和高效液相色谱法两种方法来测定提取物中银杏黄酮的含量。通过单因素实验对银杏黄酮提取过程的影响因素进行分析,考察了热回流提取法、超声辅助提取及水析过程对其提取率的影响,并通过正交实验得到了银杏黄酮提取过程最优的工艺参数为温度70℃、乙醇浓度70%、料液比为1∶15、提取时间30min、水析比为1∶5,此时提取率为95.3%,水析之后,银杏黄酮含量为4.5%,两个过程的总收率为92.7%。
  2)本文分别对AB-8大孔吸附树脂和聚酰胺树脂精制银杏黄酮过程进行了研究,采用静态实验考察了树脂的吸附特性,绘制了吸附动力学曲线及吸附等温线并进行了拟合;采用树脂的梯度洗脱实验确定了精制过程的工艺参数,并考察了上样浓度、上样流速的影响,绘制了渗透曲线和解吸曲线。AB-8大孔吸附树脂精制银杏黄酮的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂柱,先用浓度为20%的乙醇洗脱后再用80%的乙醇洗脱,即可得到含量为35.1%的银杏黄酮提取物,其收率为82.7%;聚酰胺树脂的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于聚酰胺树脂柱,先用10%的乙醇洗脱后再用60%的乙醇洗脱,即可得到含量为56.8%的银杏黄酮提取物,其收率为79.7%。
  3)本文对大孔吸附树脂与聚酰胺树脂联用纯化银杏黄酮进行了研究,考察了树脂联用顺序对产品的影响,使用正交实验确定了最佳工艺参数,并对树脂的重复使用稳定性进行了研究。树脂联用纯化银杏黄酮的最佳工艺参数为:使用乙醇水溶液作为洗脱液,先经AB-8树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为15%,第二次洗脱浓度为70%;后经聚酰胺树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为10%,第二次洗脱浓度为60%,即可得到含量为73.6%的银杏黄酮提取物,收率为64.0%。
[硕士论文] 赵树琪
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用机制,为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
  方法:
  1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天,每天记录小鼠活动状态,记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天,每天记录小鼠体重,记录小鼠生长曲线,最后一次给药1h后,处死小鼠,分离脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织,称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
  2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给药7天,造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清,ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血,流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏,磨碎后过滤、种板,ConA诱导脾细胞转化,MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布,了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞,用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天,诱导分化为树突状细胞。收集细胞,流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
  3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞,Eckol(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)处理细胞48h,加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后,MTT法检测细胞存活率。选取Eckol(5、10、20μg/ml)三个浓度组,Eckol处理细胞48h后,50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h,流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
  结果:
  1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中,Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量,升高脾指数,且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示,Eckol处理组中,肉瘤组织微血管减少,坏死增加,核固缩明显,癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示,Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
  2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示,Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高,提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡,促进Th1介导的细胞免疫;此外,Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能,促进脾淋巴细胞转化,调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示,Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润,且影响树突状细胞表型,促进髓源性树突状细胞成熟。提示,Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
  3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示,5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用,但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比,细胞存活率下降。细胞周期检测发现,与Reg3A单独作用相比,Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示,Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现,Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平,而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示,Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
  结论:
  1、Eckol具有显著抗肿瘤效应,其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
  2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖,提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
[硕士论文] 杨文军
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着核能技术的不断探索与开发,电离辐射的应用已经广泛深入到生活中的各个方面。这也不可避免的引起公众对电离辐射对身体健康的潜在不利影响的关注。增殖分化旺盛的细胞对电离辐射的敏感程度比较高,比如男性生殖细胞,其作为电离辐射的敏感细胞之一,较容易受到电离辐射引起的损伤,从而对男性的生育能力造成影响。因此迫切需要探索相关可以增强机体抗电离辐射能力的药物来保护工作环境长期处于电离辐射人群的生殖健康。
  姜黄素是一种从姜黄的根茎中分离出来的酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等生物学作用。研究证实氧化应激在电离辐射诱导的生殖系统损伤中发挥了关键作用,但是姜黄素是否能在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用尚未报道。本课题主要探究了姜黄素在电离辐射致男性生殖系统损伤中的防护作用以及可能的作用机制。
  本课题使用BALB/c雄性小鼠作为动物模型,探究姜黄素对电离辐射损伤男性生殖系统的保护作用。实验结果表明不同剂量的单次电离辐射导致了小鼠的生殖系统损伤。与未辐射的正常小鼠相比,经电离辐射处理后的小鼠睾丸重量以及附睾尾部精子的浓度出现显著降低,HE染色显示电离辐射破坏小鼠睾丸组织正常的生理结构;用TUNEL法检测睾丸组织内的凋亡情况,结果发现电离辐射显著增加了睾丸组织内的凋亡。同样在细胞水平上检测了电离辐射对小鼠精母细胞的影响。结果表明电离辐射处理后细胞的活力出现显著下降,细胞凋亡率明显升高。4Gy的单次辐射剂量破坏了精母细胞正常的线粒体膜电位。辐射后小鼠睾丸以及精母细胞内caspase-3的蛋白水平均升高。接着探究是否姜黄素能够减弱电离辐射对生殖系统造成的损伤。口服姜黄素可显著提高辐射后小鼠睾丸附睾尾部精子浓度,降低睾丸组织内生精细胞的凋亡情况。细胞实验同样发现姜黄素预处理可以显著降低电离辐射引起的细胞活力下降以及细胞凋亡,改善线粒体膜电位。上述实验结果表明姜黄素对电离辐射后的生殖系统具有保护作用。4Gy的单次电离辐射破坏了小鼠以及精母细胞的氧化应激系统之间的平衡。电离辐射处理后,小鼠睾丸内SOD、Total GSH表达水平出现显著降低,MDA和ROS水平显著上升。姜黄素预处理可以明显增加SOD、Total GSH的活性,降低MDA和ROS水平。
  在明确姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用的基础上,进一步探索其发挥保护作用的具体机制。Nrf-2/HO-1信号通路是机体内重要的抗氧化通路,前面的实验结果表明姜黄素预处理可以显著改善小鼠以及细胞内的氧化应激状态。基于这个实验结果,设想Nrf-2/HO-1信号通路参与姜黄素在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤的保护过程。实验结果显示姜黄素预处理可以显著增加精母细胞以及小鼠睾丸组织内Nrf2的蛋白水平,促进Nrf2蛋白从胞浆向胞核内的转移。在精母细胞内对Nrf2基因进行干扰后显著降低了姜黄素对精母细胞的保护作用。
  总而言之,本研究首次报道了姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用。其发挥保护作用的机制可能与通过调控Nrf-2/HO-1抗氧化信号通路维持机体氧化应激状态平衡有关。姜黄素作为祖国传统中草药,其具有副作用小,原料易获取等优点,有可能开发成为一种新的抗辐射损伤防护剂。
[博士论文] 邹玉明
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性、自身免疫性疾病,以滑膜过度增殖和炎症细胞浸润为特点,导致关节的慢性炎症以及继发软骨和骨的侵蚀。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)是炎性滑膜的重要组成部分,是类风湿关节炎发病过程中相关病理损伤的关键参与者。
  传统的改变病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),如甲氨蝶呤,病人的长期使用会产生耐药性,在一部分病人的应用过程中逐渐失去效果。近年来生物制剂的大力发展和应用极大革新了RA的治疗,临床上常常将生物制剂与DMARDs联合应用于RA患者,更好的控制和缓解了病情。尽管生物制剂改善了对传统DMARDs不敏感病人的治疗,但是生物制剂价格昂贵、需要胃肠外给药、增加感染和癌症的风险是其缺点。因此继续发展和筛选治疗RA的临床新药物具有重要意义。
  苦参碱是从一类传统中草药苦参等植物中提取出的生物活性碱,它有一系列的药理学活性,如有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗病毒、抗纤维化、抗寄生虫、心血管保护、抗骨质疏松等。但是目前为止,苦参碱还没有发展为应用于临床的药物,这与其给药剂量大,药物活性低有关。在苦参碱结构基础上研发的苦参碱衍生物MASM[(6aS,10S,11aR,11bR,11cS)210-Methylamino-dodecahydro-3a,7a-diaza-benzo(de)anthracene-8-thione]表现出比苦参碱更好的药理学活性。已有文献报道苦参碱衍生物MASM具有抗炎、免疫调节、抗肝纤维化、放射保护等作用,但是还没有研究评估其对RA的治疗是否具有治疗作用。本研究从行膝关节置换的RA病人身上获取炎性滑膜组织,体外分离培养获取人源性原代RA-FLSs,在体外建立RA细胞模型,以及建立胶原诱导的小鼠关节炎模型,通过体外和体内实验评估苦参碱衍生物MASM对RA治疗的潜在药用价值。
  方法:
  1.胶原酶消化法体外分离培养出入源性原代RA-FLSs,并在传代培养的第三代对细胞进行流式鉴定;
  2.用CCK8实验探究苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs体外增殖的影响;
  3.实时荧光定量RCR实验探究苦参碱衍生物MASM对IL-1β激活的RA-FLSs炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达的影响;
  4.AnnexinⅤ-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测MASM对RA-FLSs细胞凋亡的影响;
  5.用苦参碱衍生物MASM预处理后,IL-1β激活RA-FLSs细胞48小时后:JC-1染色,流式细胞仪检测RA-FLSs细胞线粒体膜电位的下降;提取蛋白(cytochrome c提取胞浆蛋白检测),Western blot检测凋亡的线粒体通路相关蛋白Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved caspase9、pro-caspase3、cleaved caspase3、Cleaved PARP;Caspase3活性试剂盒检测RA-FLSs细胞中capsase3活性;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光及westemblot检测RA-FLSs自噬相关标记物p62、Beclin-1、LC3的表达变化;
  7.利用自噬抑制剂CQ抑制自噬后,观察苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡诱导作用的影响;
  8.苦参碱衍生物MASM预处理后,继续用IL-1β激活RA-FLSs,蛋白收样后Western blot检测磷酸化Akt及总Akt蛋白表达水平;
  9.MAPKs和NF-κB信号通路与RA发病密切相关。用苦参碱衍生物MASM预处理RA-FLSs后,IL-1β短时间处理激活RA-FLSs中MAPKs和NF-κB信号通路。总蛋白抽提后,Western blot检测MAPKs信号通路中的磷酸化Erk1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38以及相应总蛋白的表达水平;核蛋白抽提试剂盒分离胞浆蛋白和核蛋白,分别检测核蛋白中NF-κB/p65入核水平以及胞浆蛋白中IκBα的表达变化;将DBA/1小鼠分为正常组、阳性CIA对照组、低剂量(苦参碱衍生物MASM10mg/kg组)和高剂量组(苦参碱衍生物MASM30mg/kg组)。
  10.用Ⅱ型胶原诱导小鼠建立RA动物模型——胶原诱导的关节炎模型。实验组灌胃给药,对照组给生理盐水1次/天;关节炎炎症指数评分对关节红肿的临床表现进行评分,诱导28天后每两天统计一次;
  11.收集小鼠组织样本,固定、脱钙、切片后HE染色观察小鼠足踝部关节组织病理改变,并对滑膜炎症进行评分;
  12.收集小鼠组织样本,固定后行Micro-CT扫描,三维重建后观察小鼠足爪部整体骨损伤并进行评分;
  13.眼眶取血,室温凝固后离心收集血清,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;
  14.切片样本进行TNF-α免疫组化染色,观察各组间关节局部TNF-α表达水平。
  结果:
  1.胶原酶消化培养法从可以从滑膜组织中培养出RA-FLSs,经过细胞换液和传代可以获得细胞成分较为均一、形态类似成纤维细胞的细胞成分。经CD90标定后流式鉴定,CD90阳性细胞>90%,表明获取细胞大部分为RA-FLSs,可以用于后续实验;
  2.CCK8实验表明苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs的增殖,且体现出剂量和时间依赖性;
  3.IL-1β可以激活RA-FLSs,诱导其炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-13)的表达明显升高,苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs上述炎症因子和MMPs的表达,且随着给药浓度的升高,抑制作用增强;
  4.MASM预处理1小时后,IL-1β继续刺激RA-FLSs48小时,流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC/PI双染,结果显示5~20μM苦参碱衍生物MASM可以明显诱导RA-FLSs细胞凋亡,呈剂量依赖性;
  5.Jc-1染色后流式检测RA-FLSs线粒体膜电位的下降,随着MASM浓度的增加,线粒体膜电位的下降呈递增趋势;Western-blot检测凋亡的线粒体途径相关蛋白,结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降、促凋亡蛋白Bax的表达升高、胞浆内细胞色素c蛋白水平升高、下游的cleaved caspase9表达升高,pro-caspase3表达下降而cleaved caspase3表达升高,凋亡标志物Cleaved PARP的表达升高,且所有蛋白的表达水平均与苦参碱衍生物MASM的给药剂量相关;可以明显提高caspase3的活性,且呈剂量依赖性,与蛋白表达结果相符;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光结果显示苦参碱衍生物MASM可诱导RA-FLSs中LC3的点状聚集;Western blot检测自噬相关蛋白标志物p62、Beclin-1、LC3的结果显示,5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以导致p62的表达下降,而Beclin-1、LC3B-Ⅱ的表达升高;
  7.用CQ阻断细胞自噬后,苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡促进作用得到进一步加强;
  8.Western blot检测相应处理后RA-FLSs细胞内磷酸化Akt和Akt总蛋白表达结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理可以抑制Akt的磷酸化,但是对Akt总蛋白的表达影响不大;
  9.Western blot检测MAPKs和NF-κB信号通路蛋白结果显示,IL-1β2ng/ml处理30分钟可以激活RA-FLSs,明显诱导Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,5~20μM苦参碱衍生物MASM可以抑制Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,且在20μM时抑制作用最明显,但对Erk1/2、JNK和p38总蛋白的表达影响不大;IL-1β2ng/ml处理RA-FLSs30mins可以明显减小胞浆中IκBα的表达水平,诱导NF-κB/p65入核,而5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以剂量依赖性扭转这一趋势。
  结论:
  苦参碱衍生物MASM可以抑制RA发病过程中的关键细胞RA-FLSs炎症因子以及MMPs的表达,抑制RA-FLSs细胞增殖,通过线粒体途径促进RA-FLSs凋亡,并且可以明显上调RA-FLSs中细胞自噬的水平。此外,通过自噬抑制剂CQ抑制RA-FLSs中的细胞自噬,可以进一步增强苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs凋亡诱导作用。此外,苦参碱衍生物MASM可以明显抑制RA-FLSs中与RA发病密切相关的MAPKs以及NF-κB信号通路的信号转导。在体内实验部分发现,苦参碱衍生物MASM可以缓解CIA小鼠动物模型中的关节局部和全身的炎症水平以及关节的组织破坏。综上所述,苦参碱衍生物MASM是治疗RA的潜在药物,具有进一步研发的价值。联合应用苦参碱衍生物MASM以及自噬抑制剂CQ或HCQ,有可能进一步增强其对RA的治疗效果,但仍需进一步研究进行评估。
[硕士论文] 于宗民
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  基于甘草酸与HMGB1的对接研究结果,及HMGB1与抑郁行为发生的研究进展,本课题选择与蛋白HMGB1相互作用的核心骨架甘草次酸(甘草酸的苷元部分)为先导结构进行优化修饰并考察衍生物的抗抑郁活性。在保留甘草次酸五环三萜母核结构,主要药效基团11位羰基及30位羧基的前提下,重点对甘草次酸A环展开结构修饰。借鉴已有报道中关于三萜酸A环与杂环稠合可提高抗炎活性的研究,尝试将不同杂环结构与甘草次酸A环稠合进而考察这些衍生物的抗抑郁活性。期望A环特定稠合杂环结构及侧链结构的引入能够增强目标化合物与HMGB1的相互作用,同时通过调节目标化合物的脂水分配系数,改善其透过血脑屏障的能力进而更利于其发挥抗抑郁活性,为寻找新型抗抑郁先导化合物提供新的证据。
  方法与结果:
  1、甘草次酸衍生物的设计与合成。通过酯化、氧化、亲核取代、环合及水解反应在甘草次酸A环引入吡唑环、取代吡唑环、吲哚环、取代吲哚环及异噁唑环,得到16个甘草次酸衍生物。以甘草酸、甘草次酸及甘珀酸为阳性对照,在RAW264.7细胞上通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测目标化合物抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放的能力,同时检测了目标化合物对NO释放能力的影响。结果表明,N-苯基取代吡唑稠合类衍生物在30μM和10μM浓度条件下表现出较好的抗炎活性。根据这一结果,进一步选择“N-苯基取代吡唑”作为优选结构进行修饰,通过在苯基上引入不同性质的取代基,共合成得到了21个全新结构的N-苯基取代吡唑A环稠合甘草次酸衍生物。所有关键中间体及目标化合物结构均经核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确证。
  2、甘草次酸衍生物的体外活性研究。将合成得到的衍生物及阳性对照药共计39个化合物在RAW264.7细胞和BV2细胞上进行抗炎活性测试。采用流式细胞技术检测目标化合物抑制RAW264.7细胞释放炎性因子TNF-α、IL-6的能力。结果表明,在30μM和10μM浓度条件下,GA-21T、GA-25T、GA-51T等20个N-苯基取代吡唑稠合类衍生物表现出较强抗炎活性,其中衍生物GA-21T、GA-51T在10μM浓度以下仍能表现出一定的抗炎活性。进一步将抗炎活性较好的20个衍生物在BV2细胞上通过ELISA检测其抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。结果表明,衍生物GA-25T在BV2细胞上表现出较好的抗炎活性,特别是在10μM浓度条件下,其抗炎效果和氟西汀相当。综合两种细胞的筛选结果,最终确定衍生物GA-21T、GA-25T、GA-51T为优选化合物(三个优选化合物与HMGB1的结合实验正在进行中)。
  3、优选化合物的体内抗抑郁活性评价。采用LPS造模后脑内直接给药以及rHMGB1造模后腹腔给药两种方式来评价优选化合物的体内抗抑郁活性。LPS造模后脑内直接给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善LPS诱导的抑郁样行为。rHMGB1造模后腹腔给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善rHMGB1诱导的抑郁样行为。进一步体内实验研究正在进行中。
  4、优选化合物的计算机模拟分子对接研究。通过计算机模拟分子对接技术将优选化合物GA-21T与HMGB1进行模拟对接研究。从分子对接角度阐述优选化合物与HMGB1的结合模式,结果表明优选化合物GA-21T与HMGB1之间有氢键作用,且与甘草酸和甘草次酸的结合模式相似。进一步对接研究正在进行中。
  结论:
  综上所述,本研究以甘草次酸为先导化合物,通过对其A环进行杂环稠合修饰及引入侧链结构,共合成得到了36个甘草次酸衍生物。体外抗炎活性测试表明部分目标化合物具有显著抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。进一步体内抗抑郁活性评价显示,优选化合物GA-21T可以明显改善LPS及rHMGB1诱导的抑郁样行为。本论文的研究内容具有重要的参考价值,研究结果为寻找新型基于活性天然产物HMGB1抑制剂型抗抑郁先导化合物提供了新的证据。进一步体内抗抑郁活性验证及优选化合物与HMGB1结合活性测试实验正在进行中。
[硕士论文] 楼棪
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨转移是乳腺癌患者肿瘤发展的终末期。多达70%的BC患者在尸体解剖时可见骨转移灶。骨转移病灶主要是溶骨性的,因为BC细胞可以调节骨肿瘤微环境。乳腺癌细胞分泌的细胞因子可以进一步促进破骨细胞分化成熟,促进破骨活动,破骨细胞活动增强可释放更多的因子刺激乳腺癌细胞,进一步促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,进一步促进转移病灶的发展。形成一个“恶性循环”。目前治疗BC骨转移的策略主要集中在打破这种“恶性溶骨循环”。绝大多数乳腺癌产生溶骨性骨转移。该过程的特征在于过度活化的破骨细胞形成和随后的骨破坏。BC细胞在定植于骨之后,甚至之前,可形成一个复杂的多基因程序性“恶性溶骨循环”,重塑骨微环境,促进癌症发展。IL-6,PTHRP(甲状旁腺激素相关蛋白)和TNFα(肿瘤坏死因子α)等BC细胞分泌的细胞因子可刺激成骨细胞,上调RANKL/OPG(骨保护素)比例,从而进一步刺激髓系破骨细胞前体细胞的分化。同时其他细胞因子如IL-11(白细胞介素11)和OPN(骨桥蛋白)也能直接促进其向破骨细胞分化。活化的破骨细胞降解骨基质,并释放主要储存在骨基质中的TGFβ(转化生长因子β),BMPs(骨形态发生蛋白)和IGFs(胰岛素样生长因子),反过来,促进BC进展。
  有研究已经证明了乳腺癌细胞系中PAF及其受体PTAFR的表达。在肿瘤微环境中,PAF由浸润的炎症细胞和肿瘤细胞本身分泌和积累,形成自分泌循环。PTAFR是G蛋白偶联受体(GPCR)。PAF/PTAFR信号通路激活导致复杂的细胞反应,包括细胞运动的增加,IL-6(白细胞介素6)和MMP(基质金属蛋白酶)表达的上调以及NF-κB信号的激活。迁移能力的增加是癌细胞形成转移性病变的重要特征,包括骨转移。已发表的文献和我们的结果都揭示了PAF处理后乳腺癌细胞的迁移能力增加。
  在本实验中,我们首先通过生物信息学分析提供了PAF/PTAFR信号通路在调节BC骨转移和破骨细胞生成中起重要作用的线索。
  在目前的研究中,我们证明PAF可以促进BC细胞迁移并诱导BMMs分化。海风藤酮可以减弱这两个过程,并且表现出很小的细胞毒性,可以被认为是BC骨转移的潜在治疗剂。与“恶性溶骨循环”相比,PAF能够通过两种平行方式促进BMMs分化为破骨细胞。一方面,PAF能刺激BC细胞上调IL-6,IL-11,MMPs和NF-κB等下游信号,进一步激活破骨细胞生成。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。另一方面,PAF也可以直接激活BMMs分化成破骨细胞。在目前的研究中,我们证明了海风藤酮可以抑制BC诱导或PAF直接刺激破骨细胞生成。海风藤酮处理后破骨细胞分化标记的表达均下调。这个过程主要是由于NF-κB激活的抑制。
  总之,海风藤酮可能是一种有效的策略,通过阻断PAF/PTAFR信号通路,减弱乳腺癌形成的溶骨性骨转移。
[硕士论文] 吴然
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:中药复方化学成分的分析和鉴定有助于揭示复方的药效物质基础,从而进一步阐明其多成分、多靶点、多途径的作用特点。但由于复方中体外化学成分结构的多样性,体内活性成分复杂的基质效应以及代谢产物的微量性等特点,如何全面、高效地分析和鉴定中药复方的体内外化学成分是中医药现代化研究的关键问题。
  芪精升白颗粒(Qi-Jing-Sheng-Bai granule,QJSB)是治疗放化疗之后白细胞减少症的中药升白剂,该方由黄芪、鹿角胶、西洋参、淫羊藿、当归、黄精、墨旱莲、枸杞子、补骨脂、鸡血藤十味药材按照6∶1∶2∶3∶2∶2∶3∶2∶2∶6的比例配伍而成,临床效果显著。由于芪精升白颗粒体内外主要化学成分研究不明确,限制了其作用机制的科学阐释,更阻碍了芪精升白颗粒的产业化与国际化。
  本课题以芪精升白颗粒为研究对象,综合运用各种指导理论及先进技术,从芪精升白颗粒体外成分、入血原型成分及其代谢产物等多个方面阐明其潜在的活性物质。具体研究内容如下:
  采用超高效液相串联高分辨质谱的数据采集技术结合UNIFI数据处理平台对芪精升白颗粒的体外化学成分进行鉴定。首先,建立芪精升白颗粒的in-house数据库平台:通过对十味组方药材化学成分进行文献调研,共检索出1501个化合物,并对各化合物的结构式、分子量、分子式等具体信息汇总;其次,对已知化学成分进行表征:利用UNIFI软件对in-house数据库与复方提取液的质谱数据进行匹配分析,通过总结不同结构类型化合物的质谱裂解规律结合对比标准品和参考文献的方法,共从芪精升白颗粒中鉴定出138个化学成分,其中包括6对同分异构体;最后,对未知化学成分进行解析:基于已知成分的裂解规律,利用中性丢失检索和特征碎片检索等数据挖掘技术对未知化学成分分析,共从复方中鉴定5个环黄芪醇型皂苷类化合物。综上所述,利用以上分析策略共从芪精升白颗粒复方提取液中鉴定出143个成分,包括5个未知化学成分,以上化合物按照结构可分为黄酮类(56个)、皂苷类(51个)、香豆素类(5个)、木脂素类(3个)、酚酸类(6个)、生物碱类(3个)、氨基酸类(2个),并将化合物归属到单味药材与相应色谱峰中。
  在体外化学成分研究的基础上,以血清药物化学为指导理论,对芪精升白颗粒入血原型成分及其代谢产物进行详细分析。通过多元统计分析软件对给药大鼠血清和空白大鼠血清进行差异性分析,两组的差异变量即为原型入血成分和代谢产物。首先,鉴定原型入血成分:通过扣除空白大鼠血清中基质峰,给药大鼠血清与芪精升白颗粒提取液的共有色谱峰即为原型入血成分,结合体外化学成分in-house数据库以及标准品对比的方法,在给药大鼠血清中共鉴定出24个原型入血成分,包括黄酮类(13个)、酚酸类(2个)、皂苷类(6个)、香豆素类(1个)、氨基酸类(2个)化合物。其次,建立芪精升白颗粒代谢产物数据库:利用软件MetaboLynx对入血原型成分在体内的代谢反应进行预测,共得到382个潜在代谢成分,从而建立芪精升白颗粒代谢产物库;最后,鉴定代谢产物:通过扣除芪精升白颗粒提取液中的共有色谱峰,给药大鼠血清与空白血清中的差异性色谱峰即为代谢产物,结合代谢产物数据库与中性碎片丢失检索以及提取离子流等数据挖掘技术,在给药大鼠血清中共鉴定18个代谢产物,包括异黄酮类(6个),异戊烯基黄酮类(6个),酚酸类(2个),二氢黄酮类(2个),皂苷类(2个)化合物,主要涉及的体内生化反应为水解反应、氧化反应、羟基化反应、葡萄糖醛酸化反应和磺酸化反应等。
  综上所述,本课题对芪精升白颗粒体内外化学成分进行全面系统的分析,从而为其质量控制以及作用机制研究提供科学的数据支持。此外,本研究所建立的整体分析策略为其他中药复方等复杂系统的成分分析提供了借鉴意义。
[硕士论文] 苏继源
内科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景及目的:
  动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)被看作是导致急性心脑血管事件发生发展最主要的病因,其核心病理表现为富含脂质的斑块,目前尚缺乏可快速稳定和消退斑块的措施。根据中医理论,AS属于痰瘀互结的范畴,脉络被腹中之痰浊所阻塞后,日久营血瘀滞,就此形成痰浊瘀血相凝之结块。本课题组前期实验证实:“痰瘀同治”方药(下文简称复方中药)可有效抑制AS的进展,但机制与他汀不同。已知胆汁酸肠肝循环是体内胆固醇代谢的关键环节,重吸收的胆汁酸是机体生成胆固醇的重要前体,故经肠道重吸收入血的胆汁酸也可被视为“腑中之痰浊”。我们前期研究发现:复方中药干预AS模型小鼠后,可显著抑制胆汁酸的重吸收,加速其自粪便排出,同时保持末端回肠粘膜结构完整。故此,本研究目的在于探究“痰瘀同治”方药祛除腹中痰浊抑制AS发生和发展的新机制,为传统中医药防治心脑血管疾病提供新策略和新方法。
  研究方法:
  1、人结肠腺癌Caco-2单层细胞模型建立及评价:于Transwell细胞小室内接种Caco-2细胞,培养至21天,此过程中通过不同时间点连续监测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化来明确单层细胞构建成功,将细胞随机分为空白对照组、胆汁酸刺激组及复方中药预干预+胆汁酸刺激组。
  2、复方中药对Caco-2细胞胆汁酸吸收的影响:1)复方中药对胆汁酸跨膜转运作用的研究:通过柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)定量分析各组Caco-2单层细胞模型对胆汁酸的跨膜转运情况;2)复方中药对胆汁酸吸收作用机制的研究:基于上述细胞模型,各组给予不同处理后,通过qRT-PCR和Western Blot定量分析细胞内胆汁酸吸收相关基因mRNA及蛋白的表达水平。
  3、复方中药对Caco-2单层细胞模型屏障功能及细胞氧化应激水平的影响:1)复方中药对Caco-2细胞屏障功能保护作用的研究:在上述Caco-2细胞模型中,各组给予不同处理后,评估各组荧光染料渗透率和TEER的变化,分析上述干预对Caco-2单层细胞渗透性的影响;随后通过qRT-PCR和Western Blot分析细胞间紧密连接相关基因mRNA及蛋白表达水平的变化;2)复方中药对细胞氧化应激水平影响的研究:通过荧光探针法和流式细胞术定量分析上述Caco-2单层细胞模型中ROS的生成以及凋亡的差异。
  研究结果:
  1、Caco-2单层细胞模型的建立及评价:Transwell小室内培养Caco-2细胞9天时TEER值已达到(510.93±44.54)Ω·cm2,当细胞培养至19天和21天时,TEER值显著高于500Ω·cm2的模型建立标准。Caco-2细胞培养至8天时,单层细胞顶端(apical side,AP)ALP活性与底端(basolateral side,BL)相比显著升高(P<0.05),当细胞培养至19天与21天时,Transwell小室两侧ALP活性的比值进一步扩大,达到2.68∶1、3.44∶1。
  2、复方中药抑制胆汁酸吸收的作用机制研究:1)与相应的胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可以显著降低胆酸(cholic acid,CA)、甘氨胆酸(glycocholic acid,GCA)以及牛磺胆酸(taurocholic acid,TCA)在Transwell细胞小室下室中的浓度(P<0.05),但对DCA无显著作用(P>0.05);2)究其机制而言,复方中药预处理可对抗CA、GCA以及TCA三者导致的Caco-2细胞顶端钠依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter,ASBT)、有机溶质转运体β(organic solute transporter,OSTβ)mRNA及蛋白表达水平的升高(P<0.05),但对回肠胆汁酸结合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)的mRNA表达无显著影响(P>0.05);复方中药预处理对脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)刺激所引起的ASBT和OSTβmRNA及蛋白表达水平的改变无显著影响(P>0.05),但可对抗IBABP mRNA表达水平的下降(P<0.05);复方中药预处理可对抗GCA以及TCA所导致的OSTαmRNA表达水平的升高(P<0.01),但对CA、DCA无显著影响(P>0.05),提示:复方中药可有效抑制Caco-2细胞对胆汁酸的吸收,但对于不同胆汁酸其抑制作用和机制有所差异。
  3、复方中药对肠道上皮细胞屏障功能保护作用的研究:1)与单纯胆汁酸刺激组相比,复方中药预处理可显著抑制CA、DCA以及GCA导致的细胞渗透性增加(P<0.05)以及TEER值的降低(P<0.05),上述保护作用伴随紧密连接蛋白中咬合蛋白(occludin,Ocln)和闭锁小带蛋白2(zonula occluden2,ZO2)mRNA及蛋白表达水平的显著上调(P<0.05),但对TCA刺激所导致的改变无显著影响(P>0.05);2)在闭合蛋白1(claudin1,Cldn1)mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA和DCA的病理作用无显著影响(P>0.05);在ZO1mRNA的调控方面,复方中药预处理可显著改善DCA、GCA和TCA导致的表达降低(P<0.01),但对CA无显著影响(P>0.05);3)复方中药预处理可显著降低CA、DCA和GCA刺激所诱导的细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增高(P<0.05)以及细胞凋亡(P<0.01),但对TCA无显著影响(P>0.05)。提示:复方中药可提供一定的肠道黏膜的保护作用,其对抗不同胆汁酸的保护作用以及机制有所差异。
  研究结论:
  本研究在前期动物在体实验的基础上进一步探讨复方中药抑制胆汁酸吸收及改善肠道上皮细胞屏障功能作用的机制,揭示了:1)复方中药可以有效抑制肠道上皮细胞对胆汁酸的吸收,该作用可能主要是通过下调ASBT和OSTβ基因mRNA及蛋白的表达来实现,其是复方中药抑制胆汁酸吸收的潜在作用靶点;2)复方中药能够显著对抗胆汁酸所引起的肠道屏障功能失调,上述保护作用可能主要是通过调节紧密连接蛋白Ocln和ZO2的表达以及抑制细胞内氧化应激水平和凋亡来实现。综上所述,复方中药可通过抑制胆汁酸在肠道的重吸收及维持肠道上皮细胞屏障功能,即祛除“腑中之痰浊”,从而发挥其降脂抗AS的作用。
[硕士论文] 江昌
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  癌症严重影响人类的身心健康,其发生发展是多因素长期作用的结果。而慢性炎症则是其中的重要因素之一。1863年,Rudolf Virchow发现肿瘤组织中存在一定量白细胞,由此将炎症与肿瘤联系起来,并提出炎症是肿瘤发生的原因。胃癌(GC)是全球第四常见的恶性肿瘤,同时GC引起的肿瘤性死亡在全世界肿瘤性死亡排第二。中国胃癌患者基数大,因此对于胃癌的治疗任重道远。胃癌与慢性胃炎关系密切,因此,是否可以通过应用免疫调节药物,调节胃癌炎性微环境是工作的重点。人参皂苷Rg3是人参的提取物之一,具有抗肿瘤活性。目前关于人参皂苷Rg3的抗肿瘤机制研究,大多数集中于其促肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖及阻滞细胞周期等作用上,有文献报道,人参皂苷Rg3可调节树突状细胞(DC)活性,在此基础上,考虑人参皂苷Rg3具有免疫调节的潜能。有文献报道,人参皂苷Rg3干预肿瘤细胞后,上清中IFN-γ表达升高,IL-4表达下降,而IFN-γ、IL-4与巨噬细胞的极化密切相关,同时,前期工作已经发现人参皂苷Rg3可以抑制肿瘤新生血管形成,已有大量研究表明肿瘤组织中的血管形成与TME中的TAM密切相关,故提出假说,人参皂苷Rg3可能通过调节巨噬细胞极化从而发挥其抗肿瘤功效。以巨噬细胞作为研究对象,通过TAM与胃癌细胞株MFC共培养体外模拟胃癌炎性微环境,观察人参皂苷Rg3对巨噬细胞极化的影响;利用胃癌腹腔转移瘤小鼠模型,探究人参皂苷Rg3能否通过其免疫调节作用改变胃癌炎性微环境,达到抑制肿瘤发展的目的。
  目的:
  1、确定人参皂苷Rg3对MFC细胞活力的直接影响。
  2、观察人参皂苷Rg3能否诱导巨噬细胞向M1极化。
  3、动物试验观察人参皂苷Rg3在体内抗肿瘤活性及对肿瘤组织中巨噬细胞极化的影响。
  方法:
  1、CCK-8实验:培养MFC细胞,接种96孔板,用以下浓度人参皂苷Rg3干预MFC细胞:25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。分别于干预24、48h后用CCK8试剂检测细胞活性。
  2、用条件培养液体外模拟胃癌微环境:用0μg/ml、25μg/m、50μg/ml、100μg/ml的人参皂苷Rg3溶液处理MFC细胞,48h后弃上清,更换为无血清DMEM细胞培养液,24h后收集各孔上清培养液并加入预先培养好的小鼠巨噬细胞RAW264.7中,再分别收集RAW264.7细胞和上清,细胞提取RNA和蛋白,RNA用于RT-PCR实验,检测RAW264.7细胞中iNOS、IL-12、IL-10的表达量;用Western blot法检测iNOS、IL-12、Arg-1蛋白的表达水平。
  3、建立615小鼠腹腔转移瘤模型:选择合适的腹腔灌注细胞数后,予以荷瘤,设立control组(空白组)、Rg3组、5Fu组、Rg3+5Fu组(联合组),在腹腔转移瘤模型建立成功后,给与相应药物干预,观察小鼠生存时间,取小鼠眼眶血、腹腔积液做后续ELISA实验,取腹腔肿瘤标本做免疫组化。
  结果:
  1、人参皂苷Rg3干预MFC细胞后,细胞活力降低,Rg3浓度越高,细胞活力越低。
  2、RT-PCR实验表明,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,MFC CM(未用药物干预的条件培养基)处理组同IL-4处理组iNOS、IL-12、IL-10表达量相仿;其余组RAW264.7细胞的iNOS、IL-12表达量随着人参皂苷Rg3浓度的增加也逐步增加;而IL-10的表达随着人参皂苷Rg3浓度的增加逐渐降低。Western blot实验提示,不同浓度人参皂苷Rg3作用MFC细胞所得条件培养液处理RAW264.7细胞后,随着人参皂苷Rg3浓度的增加,所得到的条件培养液处理RAW264.7细胞后,其iNOS和IL12的表达呈上升趋势,而Arg1表达则呈下降趋势。
  3、Rg3组与control组相比较,两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,而Rg3组CD11c阳性比例明显增高、CD206的阳性比例明显降低;将联合组同5Fu组进行对比,可见两组肿瘤组织中CD68阳性比例接近,联合组CD11c阳性比例明显增高、而CD206的阳性比例明显降低;将5-Fu同control组对比,二者CD68、CD11c、CD206阳性比例均相仿。提示人参皂苷可诱导TME巨噬细胞向M1型巨噬细胞发生极化,抑制巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞。Rg3可延长小鼠生存时间,但其效果不如5Fu,联合治疗具有协同作用,可进一步延长小鼠生存时间。
  结论:
  人参皂苷Rg3在体外可抑制MFC细胞增殖,且具有剂量依赖性,体内具有抗肿瘤活性。细胞实验及动物实验均提示其机制可能与Rg3诱导巨噬细胞向M1极化,改善胃癌炎性微环境相关。
[博士论文] 李娇
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:海洋无脊椎动物在特殊的海洋环境中经过长期的进化,形成了复杂的代谢体系,能产生独特的化学物质,不仅可以用于动物自身防御,还为人类疾病治疗提供大量用于临床或临床前研究的候选药物。在对海洋无脊椎动物研究的过程中,越来越多的研究发现有些次生代谢产物的真正来源是这些动物的共附生微生物,因此学者的目光转移到了海洋微生物上,近年来,海洋来源微生物尤其是海洋真菌的研究得到了快速发展。海洋真菌的次级代谢产物结构多样新颖,也是活性物质的重要来源,不仅可为新药研发提供先导化合物,还可通过微生物发酵解决先导药物的来源问题。
  基于以上前提,以及作为课题组从海洋无脊椎动物及其共附生微生物中寻找先导化合物工作的延续,本文对采自中国西沙海域的四种无脊椎动物隋氏蒂壳海绵Theonella swinhoei、冷柳珊瑚属珊瑚Iciligorgia sp.、豆荚软珊瑚属珊瑚Lobophytum sp.、短足软珊瑚属珊瑚Cladiella sp.进行了以活性为导向的化学成分研究;运用化学和活性相结合的手段对分离自海洋无脊椎动物的15株真菌进行了筛选,得到2株有研究价值真菌菌株Aspergillus ochraceopetaliformis、Stemphylium lycopersici,并对这2株真菌进行了化学成分研究;最后,结合参考文献本文对分离得到的部分化合物进行了酶抑制、调节免疫T细胞增殖、调节破骨细胞分化、抗肿瘤干细胞样细胞、抗真菌的活性筛选,部分化合物显示出良好的生物活性。
  运用正、反相硅胶柱色谱层析、葡聚糖凝胶柱层析、高效液相等多种色谱分离纯化方法,从以上6种样品的提取物中共分离得到105个化合物;依靠核磁共振、质谱、计算ECD等多种结构鉴定手段,并结合文献检索,鉴定了这些化合物的结构,分离得到的化合物类型包括甾体类、二萜类、倍半萜类、聚酮类、醌类、肽类、其他类。其中新化合物31个,包括6个4-亚甲基甾体化合物(h1~h4、h6~h7),4个9,10-开环甾体(f19、f20、f26、f27),1个9,11-开环甾体(f38),12个eunicellin型二萜(f1~f5、f8~f14),6个西松烷型二萜(d1~d6),1个蒽醌类化合物(s1),1个酰胺类化合物(s10)。
  从隋氏蒂壳海绵Theonella swinhoei中分离得到12个化合物,其中6个甾体化合物h1、h2、h3、h4、h6、h7为新化合物,二萜化合物h11为首次从海绵中分离得到,化合物h12为首次从该属海绵中分离得到。
  从冷柳珊瑚属珊瑚Iciligorgia sp.中分离得到49个化合物,其中12个eunicellin型二萜(f1~f5、f8~f14)、4个9,10-开环甾体化合物(f19、f20、f26、f27)和1个9,11-开环甾体化合物(f38)为新化合物,eunicellin型二萜化合物f15为新天然产物。经检索,本文是对冷柳珊瑚属Iciligorgia sp.化学成分的首次报道。
  从豆荚软珊瑚属珊瑚Lobophytum sp.中分离得到9个化合物。其中6个西松烷型二萜(d1~d6)为新化合物,二萜二聚体化合物d8和倍半萜化合物d9为首次从该属珊瑚分离得到。
  从短足软珊瑚属珊瑚Cladiella sp.中分离得到8个化合物,均为已知倍半萜类化合物,其中化合物b1、b4、b5、b6、b7为首次从该属珊瑚中发现,化合物b3之前都是从陆地中发现的,本文为首次从海洋生物中发现。
  从苔海绵共附生曲霉属真菌Aspergillus ochraceopetaliformis中分离得到17个化合物。所得化合物类型涉及聚酮、倍半萜、萘醌、肽类等,均为已知化合物,结构类型多样,说明这种真菌的代谢途径的多样性。
  从蕾二歧灯芯柳珊瑚的共附生真菌Stemphylium lycopersici中分离得到10个化合物:macrosporin2-O-α-D-glucopyranoside(s1),macrosporin(s2),dihydroaltersolanol B(s3),alterporriol U(s4),2-phenylethyl-α-D-glucopyranoside(s5),(S)-2-hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl)propanoic acid(s6),latifolicinin C(s7),methyl4-hydroxybenzoate(s8),methyl4-hydroxybenzoate(s9),methyl(E)-4-(5-hydroxy-3-methylpent-2-enamido)butanoate(s10)。其中新化合物2个,包括1个蒽醌类化合物(s1)和1个链状酰胺类化合物(s10),苯烷基糖化合物s5为该属真菌首次分离得到。
  对化合物h1~h4和h7有针对性地进行了(h)p300酶抑制活性测试,化合物h1对与多种疾病相关的组蛋白乙酰转移酶(h)p300显示出中等的抑制活性,IC50值为8.84μM。为该类化合物进行(h)p300构效关系研究提供了依据。
  采用刀豆蛋白激活的小鼠脾脏原代CD4+T细胞模型测试了30个冷柳珊瑚中分离得到的甾体化合物f19~f45、f47~f49对CD4+T细胞增殖的调节作用,结果显示,13个化合物f19~f21、f23~f25、f26、f28、f30、f31~f34在给药第五天和第七天都显著抑制CD4+T细胞的增殖;六个化合物f35~f37、f43、f44、f48在给药七天对CD4+T细胞显示出抑制作用;化合物f38给药第七天起促进作用,化合物f45给药第五天起促进作用但第七天作用消失。CD4+T细胞是免疫系统中一种重要的免疫细胞,免疫系统与艾滋病、炎症、排异反应、肿瘤等多种疾病的发生发展相关,因此这些活性化合物可以作为潜在的免疫调节剂进行深入研究。
  从冷柳珊瑚中发现的甾体化合物与骨质疏松替代疗法的雌激素结构类似,而且骨代谢疾病的发生与免疫系统也息息相关,因此本文对这些甾体化合物进行了破骨细胞分化活性的筛选。采用TRAP染色的方法,测试了22个甾体类化合物f20~f22、f24~28、f35~37、f39~f45、f47~f49对原代小鼠骨髓单核巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化的影响。测试结果显示,4个化合物f37、f39、f47、f48显示出抑制BMMs向破骨细胞分化的活性,8个受试化合物f24~f26、f40、f42~f45显示出促进破骨细胞分化的活性。破骨细胞与骨质疏松、骨硬化等骨代谢疾病密切相关,对破骨细胞分化有调节作用的化合物可以作为骨代谢疾病治疗的潜在活性物质进行研究。
  另外,本文采用CCK-8方法,对16个9,10-开环甾体化合物f19~f34、5个二萜化合物d7、d8、d9、t11、t12,3个肽类化合物t13、t16、t17,1个内酯化合物t6,进行了肝癌Huh7干细胞样细胞的生长抑制活性测试。结果显示,化合物f19、f20、f21、f22、f24、f25、f27、f28、f31、f33、f34、t11的IC50值在21.5~62.7μM,其他受试化合物对肝癌Huh7干细胞样细胞无生长抑制活性。
  最后,本文采用抗真菌实验,对37个化合物t3~t6、t9~t14、t16、t17、f19、f22、f24~f26、f28、f32~f34、f36~f39、f43、f47、b1、b2、d7~d9进行了抗真菌活性评价,结果显示,化合物对白假丝酵母菌(Candida albicans)和近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)均无抑菌作用(MIC80>64μg/ml)。
  本研究共分离得到105个化合物,其中新化合物31个,扩充了对应结构类型的种类和数量,为课题组寻找活性先导化合物提供了物质基础。本研究对分离得到的部分化合物运用活性模型进行了活性评价,筛选出1个p300抑制剂h1,21个对CD4+T细胞增殖有调节作用的化合物,12个调节破骨细胞分化的活性化合物,12个肝癌Huh7干细胞样细胞生长抑制剂。为化合物的生物活性研究和结构优化提供了科学依据,丰富了中国海洋天然产物的研究资料。
[硕士论文] 石伟林
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份,前期研究报道,EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用,但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制,为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。
  方法:
  1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响
  用不同浓度的EGCG(5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性,确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间,依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,进行划痕和Transwell实验,进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。
  2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平,同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化,分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。
  3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移
  首先,利用免疫组化技术,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平,确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后,构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体,筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系,检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后,EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞,采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。
  4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的
  利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法,在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后,与对照组比较,分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变,同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达,证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化,进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。
  5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响
  EGCG处理乳腺癌细胞后,通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外,采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用含EGCG培养基培养,检测细胞因子的变化,分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。
  结果:
  1.细胞活性检测结果显示,当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时,乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p<0.05),因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明,EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p<0.01)。
  2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用,伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调,此外,我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调,由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。
  3.免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低,说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后,E-cadherin的表达下调,Vimentin的表达上调,说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后,我们发现EGCG的抑制作用减弱,证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。
  4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p<0.05),这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后,检测SCUBE2的甲基化变化,结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p<0.05),由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。
  5.ELISA结果显示,EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后,再用EGCG处理,我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著,因此,我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。
  结论:
  EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控,SCUBE2进而通过调节迁移相关基因(E-cadherin和Vimentin)的表达,最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外,EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。
[博士论文] 贾丹
中药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:中药是中华民族的瑰宝,其中的天然活性成分及代谢产物是新药创制的重要来源。然而,天然活性成分结构中通常含有多个活性中心,往往作用于多个靶点,通过许多物理或功能上紧密相联的分子或通路网络而不是某个孤立蛋白发挥作用,具有多活性中心、多靶点协同作用发挥药效的特点,不适于单靶点药物药效机制研究模式。因此,中药活性成分多靶点协同作用的药效机制研究已成为中药现代化道路上的一个重大“瓶颈”。本研究采用新型靶标鉴定技术联合多组学分析策略:第一:筛选出大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分——千层纸素A,探究其抗肿瘤作用靶点及药效机制;第二:鉴定中药一类新药丹参素钠注射剂活性成分丹参素钠的结合靶标蛋白,探究其心血管保护药效机制。
  1.全二维HepG2细胞膜色谱筛选大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分
  细胞膜色谱(CMC)是一种表征药物与膜受体间相互作用的生物亲和色谱技术,广泛用于中药等复杂体系中活性成分的筛选。在本研究中,建立了一种在线全二维HepG2细胞膜色谱/富集柱/高效液相色谱/飞行时间质谱模型,快速筛选大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的活性成分,并利用MATLAB软件编写的一个程序,有效地消除了血清中基质效应的干扰。从黄芩水提液中筛选到黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素A、黄芩新素及半枝莲种素6种活性成分,同时从黄芩水提液和含药血清中筛选到汉黄芩素、千层纸素A及黄芩新素3种活性成分。细胞增殖实验表明从体内含药血清中筛选到汉黄芩素及千层纸素A能够显著抑制HepG2细胞的增殖且呈现浓度依赖性,其IC50值分别为69.83及16.66μM,并且促进肿瘤细胞的调亡,可作为抗肝癌前体药物。本研究首次鉴定出黄芩大鼠含药血清中的体内抗肝癌活性成分汉黄芩素、千层纸素A及黄芩新素,所建立的HepG2细胞膜色谱模型及基质干扰消除策略在体内活性成分筛选中具有独特的优势,同样适用于其他生物样品、生物色谱模型及中药体内活性成分研究。
  2.千层纸素A以转酮醇酶为靶点通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53通路发挥抗肝癌作用
  在前一章研究基础上,针对抗肿瘤活性最强的活性成分千层纸素A,进一步全面探究其体内外抗肝癌活性、作用靶点及潜在药效机制。细胞增殖、凋亡和周期实验结果表明,千层纸素A可显著抑制HepG2细胞增殖、诱导凋亡并且使细胞分裂阻滞在G2/M期;裸鼠异种移植模型表明千层纸素A能够抑制体内肿瘤生长。通过药物亲和反应靶标稳定分析(DARTS),发现千层纸素A特异性结合非氧化磷酸戊糖途径关键酶(Nonoxidative PPP)——转酮醇酶(TKT),KD值为11.2μM,其相互作用通过分子对接、酶活性测定、蛋白表达及TKT干扰后抗肿瘤效应变化进一步证实。此外,靶向代谢物相对定量分析表明千层纸素A抑制TKT催化活性导致核糖-5-磷酸(R5P,肿瘤细胞中核糖核苷酸合成的关键原料)产量下降,进而诱导肿瘤细胞凋亡。HepG2细胞转录组测序结果表明千层纸素A影响缺氧诱导因子。1(HIF-1)信号通路、鞘糖脂生物合成及氨基酸代谢等与非氧化磷酸戊糖途径密切相关的通路,且p53凋亡途径被显著激活,与TKT干扰后的HepG2细胞RT-PCR array分析结果一致。本研究表明,千层纸素A是一种新型TKT抑制剂,通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53信号通路发挥抗肝癌作用。千层纸素A可作为新型TKT或非氧化磷酸戊糖途径抑制剂研发的前体药物。
  3.丹参素钠通过线粒体途径保护HUVEC细胞抗叔丁基过氧化氢诱导的氧化损伤
  丹参素钠是中药丹参中主要水溶性活性成分丹参素的羧酸盐,丹参素钠注射剂已获CFDA批准进入临床Ⅰ期试验,用于冠心病及稳定性心绞痛的治疗。在本研究中,探讨丹参素钠保护人脐静脉内皮细胞(HUVEC)抗叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的氧化损伤药效机制。结果表明,丹参素钠预给药可显著改善t-BHP氧化损伤诱导的HUVEC生长抑制和凋亡。基于超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)的细胞代谢组学分析表明,t-BHP氧化损伤主要上调了色氨酸代谢和苯丙氨酸代谢中的13个代谢产物,与线粒体功能和氧化应激密切相关,50μM丹参素钠预给药可显著逆转这些代谢变化。分子生物学实验表明,丹参素钠预处理可改善t-BHP氧化损伤诱导的乳酸脱氢酶(LDH)、细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和线粒体膜电位(MMP)的升高,并可调节JAK2/STAT3和PI3K/Akt/GSK-3β及线粒体抗氧化途径关键抗氧化酶的表达。结果表明,丹参素钠可能通过线粒体抗氧化通路保护HUVEC抗t-BHP诱导的氧化损伤。
  4.基于蛋白质组芯片及血清代谢组学分析的丹参素钠心梗保护药效机制研究
  丹参素在临床上广泛用于心血管疾病的治疗,但是目前其直接结合靶标蛋白仍不清楚,心脏保护药效机制仍需深入研究。本研究拟考察丹参素钠(SAAS)注射剂对心梗大鼠心肌保护作用,探究其结合靶标蛋白及潜在药效机制。通过左冠状动脉前降支结扎术构建大鼠心肌梗死(MI)模型,探究SAAS对心梗大鼠保护作用。结果表明,SAAS能显著提高MI大鼠心脏功能,降低血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的含量,减轻心梗损伤。采用蛋白质组芯片技术,发现370个蛋白与SAAS特异性结合,这些蛋白显著富集于代谢通路。通过超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)系统,对心梗大鼠血清进行代谢组学分析。从大鼠血清中共鉴定到26种潜在生物标志物,包括各种甘油磷脂(GPLs)和一系列脂肪酸。代谢通路富集分析发现,心梗大鼠磷脂分解代谢、鞘脂代谢和亚油酸代谢增加,色氨酸代谢减弱,甘油磷脂代谢和原代胆汁酸生物合成受损,而SAAS可显著逆转这些代谢变化。因此,SAAS可能通过逆转心梗损伤引起的多种代谢变化发挥心梗保护作用。本研究不仅有助于揭示SAAS的心血管保护药效机制,为其临床应用提供科学依据;此外,由蛋白质组芯片鉴定到的与SAAS特异性结合的370种蛋白可作为其进一步发展的宝贵资源。
  5.基于大鼠心肌蛋白质组学及转录组学分析的丹参素钠心梗保护药效机制研究
  前期研究证实了丹参素钠对左冠状动脉前降支结扎诱导的大鼠心肌梗死(MI)的保护作用,其潜在机制与逆转MI损伤引起多种代谢变化有关。本研究通过对丹参素钠(SAAS)治疗的心肌梗死大鼠心肌组织进行蛋白质组学和转录组学分析,进一步探究丹参素钠心血管保护药效机制。结果表明,在假手术组、心梗模型组、SAAS治疗组之间差异表达的基因和蛋白质是一些重要的转录因子、辅因子、结构分子和受体,主要参与细胞过程、生物过程中的细胞结合、细胞成分和分子功能等生命过程。功能富集分析表明,SAAS主要参与调控肌动蛋白细胞骨架、吞噬、黏着、紧密连接、细胞凋亡、MAPK通路及Wnt信号通路等。SAAS可能通过转录、翻译尤其是代谢调控等多层次生命活动发挥心脏保护作用。本研究不仅为心肌梗死发病机制提供了新的视角,而且从转录和翻译水平阐释了SAAS的心脏保护药效机制,为其临床应用提供科学依据。
  综上所述,本研究主要通过药物亲和反应靶标稳定分析、蛋白质组芯片等新型靶标鉴定技术联合转录组学、蛋白质组学及代谢组学等多组学分析,探究大鼠灌胃黄芩水提液后含药血清中的体内抗肝癌活性成分千层纸素A及心血管保护中药一类新药丹参素钠的作用靶标蛋白及药效机制。研究发现,千层纸素A以TKT为靶点,通过抑制非氧化磷酸戊糖途径和激活p53信号通路干扰DNA合成发挥抗肝癌作用,千层纸素A可作为新型TKT抑制剂;丹参素钠通过调控代谢及线粒体抗氧化通路保护HUVEC抗t-BHP诱导的氧化损伤,通过改善大鼠心梗损伤诱导的代谢变化及调控肌动蛋白细胞骨架、吞噬、黏着、紧密连接、细胞凋亡、MAPK通路和Wnt信号通路等,从转录、翻译尤其是代谢等多层次生命活动发挥心脏保护作用,为丹参素钠临床应用提供科学依据。本研究提出的新型靶标鉴定技术联合多组学分析策略,同样适用于其它中药中活性成分药效机制研究。
[硕士论文] 张娴
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃肠功能障碍对危重症患者的预后起着至关重要的作用。前期基础研究表明大黄,作为一种中药,能够有效保护胃肠道屏障功能,阻止肠道细菌移位,促进肠蠕动,但至今临床研究较少。本研究的目的在于探讨中药大黄对危重症患者胃肠功能障碍的疗效。
  方法:
  根据纳入及排除标准对2015年6月至2017年5月期间进入重症监护室(intensive care unit,ICU)的患者进行筛选,最终共有368位患者进入本次回顾性队列研究。再根据暴露因素(即胃肠功能障碍患者是否接受大黄治疗)将患者分为大黄组和常规治疗组。大黄组接受常规药物治疗+生大黄粉治疗,常规治疗组仅接受常规药物治疗。常规药物治疗方法包括促胃肠动力、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜、抗感染、抗炎、保肝、维持循环稳定、维持水电解质平衡等。收集患者进入ICU24小时内及治疗7天后的临床资料,比较两组治疗效果。采用倾向性评分匹配法(propensity score matching,PSM)控制两组间的混杂偏倚。
  结果:
  根据是否使用大黄治疗,入选患者被分为大黄组(219例,59.51%)和常规治疗组(149例,40.49%)。
  基线特征:纳入时与常规治疗组相比,大黄组患者腹胀程度、急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)级别较高(重度腹胀:43.84%vs4.70%;AGIⅢ:43.84%vs4.70%,P<0.05),序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment score,SOFA)评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分较低(SOFA评分:4.84±3.09vs6.44±3.45;APACHEⅡ评分:12.88±6.14vs14.98±5.77,P<0.05),甘油灌肠剂、米雅、促胃肠动力药使用比例较少(甘油灌肠剂:54.79%vs77.18%;米雅:35.16%vs48.32%;促胃肠动力药:17.35%vs32.21%,P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。为控制两组间的混杂偏倚,采用倾向性评分匹配法,以大黄组为基准组进行匹配,最终68对匹配成功,共136例病例,匹配后两组患者基线特征无统计学差异。
  主要研究结果:匹配前大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为59.82%、39.60%,匹配后大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为77.94%、30.88%,大黄组喂养耐受率均较常规治疗组高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  次要研究结果:匹配前后大黄组患者AGI分级改善率、肠鸣音改善率均较常规治疗组高(匹配前:AGI分级改善:75.34%vs29.53%,肠鸣音改善:90.41%vs72.48%;匹配后:AGI分级改善:76.47%vs33.82%,肠鸣音改善:91.18%vs64.71%,P<0.05),SOFA评分、APACHEⅡ评分、住ICU天数、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、内毒素均较常规治疗组低(匹配前:SOFA评分:4.23±3.57vs5.84±3.69,APACHEⅡ评分:11.92±6.55vs14.11±6.30,住ICU天数:12.00(9.00,18.00)vs14.00(9.50,21.00),CRP:23.21(9.00,52.97)vs47.08(24.00,92.86),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.11);匹配后:SOFA评分:4.54±3.61vs5.63±3.79,APACHEⅡ评分:12.56±6.03vs13.74±6.00,住ICU天数:12.00(9.00,18.50)vs13.00(9.50,20.50),CRP:25.39(12.03,67.71)vs53.48(28.19,100.25),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.10),P<0.05),差异有统计学意义。28天死亡率在匹配前后两组患者间差异无统计学意义(匹配前:22.37%vs22.15%;匹配后:30.88%vs23.53%,P>0.05)。两组患者均未发现严重不良反应。
  结论:
  中药大黄能够有效提高危重症患者肠内营养耐受性,缓解胃肠功能障碍,且无严重不良反应,为临床实践中应用大黄治疗胃肠功能障碍提供了循证医学证据。
[博士论文] 吴成
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:经导管动脉化疗栓塞术(TACE)是原发性肝癌的主要治疗方法之一,由于术中栓塞剂阻塞及化疗药物等作用,可造成肝脏局部缺血缺氧,致缺血区中性粒细胞、单核细胞、肝脏库弗氏细胞等大量聚集引起炎症反应,多种炎性因子大量生成分泌。炎性因子与肝癌的发生、发展密切相关。其中IL-8、TNF-α与肝癌的进展、血管生成和转移密切相关。TACE术后局部为缺氧环境,可上调缺氧诱导因子(HIF)-1α表达,进一步可通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)升高而促进肿瘤血管生长,进而促进肿瘤复发、转移,VEGF和HIF-1α是缺氧环境中调控血管生成的关键因子,VEGF的高表达可以促进肿瘤生长、增加转移机率。抑制VEGF表达水平是降低肝癌TACE术后复发转移率的重要手段,进而可阻止肿瘤新生血管的形成。在缺氧环境下,VEGF除受HIF-1α调控外,炎性因子亦可以促进VEGF表达。众多研究表明,中药医已经成为恶性肿瘤治疗策略中的重要组成部分,配合TACE术具有良性调节作用,不仅可减轻栓塞综合征,而且可以在降低肝癌复发、转移方面发挥作用。清热解毒法是中医治疗原发性肝癌的主要治疗方法之一,清热解毒中药在肝癌发展的不同阶段均有一定疗效。熊胆粉作为清热解毒类中药,具有抗炎、抗肿瘤的作用。现研究发现,熊胆粉在减少炎性因子分泌、调节肿瘤微环境、抑制肝星状细胞活化、促进T细胞增殖、诱导肝肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖及血管生成等方面均有作用。熊胆粉是否可能下调TACE术后缺氧环境炎性因子分泌,是否可以下调VEGF表达,是否可以抑制缺氧条件下的血管生成,目前尚无相关报道。
  目的:
  探讨熊胆粉对原发性肝癌TACE术后炎性因子及栓塞综合征的影响,并进一步探讨熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞炎性因子及血管生成的影响,为熊胆粉配合TACE术进一步提高TACE术的疗效提供实验依据。
  方法:
  1、熊胆粉对原发性肝癌患者TACE术后血清炎性因子及栓塞综合征的影响
  将符合纳入标准的107例原发性肝癌患者随机分为熊胆粉组(服用熊胆粉胶囊)及对照组(服用安慰剂),均于TACE术前1天开始用药,疗程6天,分别于术前、术后第3天及术后第5天检测并记录患者血清炎性因子、肝功水平及记录临床症状情况。
  2、熊胆粉对CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响
  体外采用CoCl2造成人肝癌细胞SMMC-7721缺氧模型,MTT检测不同浓度熊胆粉在缺氧条件下对肝癌细胞增殖的影响,然后用对SMMC-7721肝癌细胞无明显毒性的低、中、高浓度的熊胆粉干预,RT-PCR方法检测缺氧条件下熊胆粉对肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGF表达,同时用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清中IL-8水平、Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,探讨熊胆粉在缺氧条件下对IL-8、HIF-1α、VEGF表达的影响。
  3、熊胆粉对IL-8诱导的血管生成的影响
  在体外实验中,我们用铺基质胶方法将100ng/mL IL-8与内皮细胞注入高浓度的基质胶内,并加入不同浓度的熊胆粉培养,在荧光显微镜下观察血管结节数量、血管长度及面积并拍照,图片采用Image J软件进行处理并统计其血管生成情况。
  在体内实验中,将裸鼠分3组,分别为空白组(裸鼠皮下接种基质胶与内皮细胞)、IL-8组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞与IL-8混合液)、IL-8+熊胆粉组(裸鼠皮下接种基质胶、内皮细胞、IL-8与0.4mg/mL熊胆粉混合液),将混有IL-8、EA.hy926细胞、熊胆粉的基质胶按分组设计方案接种于裸鼠体内。10天后,将裸鼠皮下基质胶团块剥离,一部分置于EP管中,加入Lysis细胞裂解液并在组织研磨机中研磨,通过BCA法检测蛋白浓度,将所有样品调整至相同蛋白浓度后,将所获得的组织悬液通过贝博血红蛋白检测试剂盒进行血红蛋白浓度的检测;另一部分用于HE染色观察血管生成情况,免疫组化检测CD31、VEGF表达以评估血管生成情况。
  结果:
  1、临床研究发现,原发性肝癌患者TACE术后炎性因子IL-6、CRP、IL-8表达明显上调(P<0.05),术后第5天时熊胆粉组IL-8、TNF-α水平明显低于对照组(P<0.01,P<0.05),提示熊胆粉可以抑制TACE术后炎性因子IL-8、TNF-α表达水平;
  2、原发性肝癌患者TACE术后肝功TBIL、DBIL、ALT、AST水平升高,熊胆粉组AST/ALT比值、AST水平显著低于对照组(P<0.01,P<0.05);熊胆粉组患者的发热持续时间明显短于对照组(P<0.05),提示熊胆粉可以改善TACE术后肝功能损伤,减轻发热症状,减轻栓塞综合征。
  3、RT-PCR方法检测肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,结果发现,CoCl2能显著诱导SMMC-7721细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA表达,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),而熊胆粉能够明显抑制CoCl2诱导的SMMC-7721肝癌细胞中IL-8、HIF-1α、VEGFmRNA的表达。进一步采用ELISA法检测肝癌细胞培养基上清液中IL-8水平,结果与mRNA结果一致。Western blot法检测肝癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达,结果也显示熊胆粉可抑制HIF-1α、VEGF蛋白表达,以上均提示熊胆粉具有抑制缺氧条件下IL-8、HIF-1α、VEGF表达的作用。
  4、熊胆粉体外对IL-8诱导的血管生成的影响,结果显示:混有IL-8及内皮细胞的基质胶内血管结节数量、血管长度及面积方面均明显高于空白对照组(P<0.05),提示IL-8能刺激血管的生成;加入不同浓度的熊胆粉干预后,血管结节数量、血管长度及面积三个指标均较IL-8组下降,其中0.2、0.4mg/mL两组与IL-8组差异显著(P<0.05),提示熊胆粉能有效抑制IL-8促血管生成的效应,并且呈一定的剂量依赖性。
  5、熊胆粉对体内血管生成的影响的实验中,HE染色观察发现基质胶团块血管生成在IL-8刺激下明显增加,而熊胆粉能有效抑制该效应;免疫组化检测体内基质胶内CD31、VEGF表达的结果发现,IL-8组CD31、VEGF表达明显高于对照组,而熊胆粉+IL-8组则CD31、VEGF表达均较IL-8组明显减少,检测体内基质胶内血红蛋白浓度发现,在IL-8诱导下,IL-8组基质胶内血管较空白对照组丰富,血红蛋白浓度明显高于空白对照组,差异显著(P<0.05),而熊胆粉+IL-8组则血管不明显,血红蛋白浓度明显低于IL-8组,差异有统计学意义(P<0.05),以上均提示熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成。
  结论:
  1、熊胆粉可以抑制TACE术后IL-8、TNF-α表达水平;降低术后AST水平,减轻TACE术后栓塞综合征;
  2、熊胆粉能够抑制缺氧诱导的肝癌细胞VEGF、IL-8水平升高;
  3、熊胆粉可以抑制IL-8诱导的血管生成;
  4、熊胆粉可能能够抑制原发性肝癌TACE术后缺氧诱导的血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α/IL-8/VEGF相关。
[硕士论文] 薛贤
内科学(肾病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是发病率最高的单基因遗传性肾病,多在成年以后起病,主要累及肾脏,患者会逐步出现肾功能下降,50%的患者会在60岁左右进入终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD),目前是ESRD的第四位病因。该病目前尚无特异性治疗药物。中国传统的中草药雷公藤具有抗炎、抑制免疫、抗肿瘤等药理作用,其在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、血液系统肿瘤及实体肿瘤均有不少应用。ADPKD是一种类肿瘤性疾病,其囊肿细胞无限增殖,2007年首次有研究者将雷公藤提取物雷公藤内酯应用于PKD小鼠模型,证实其可对PKD小鼠的囊肿生长起到抑制作用,后续有研究者将雷公藤内酯应用于不同生长阶段的小鼠,均发现雷公藤内酯对囊肿生长有抑制作用。2014年一项小样本的临床研究证实了雷公藤多苷应用于合并蛋白尿的ADPKD患者的有效性和安全性,从而提示雷公藤多苷可能是潜在的一种ADPKD治疗药物。因此,本研究试图将雷公藤多苷用于治疗ADPKD患者,以探索其治疗ADPKD的有效性和安全性。
  方法:收集2014年7月至2017年11月符合入组条件的ADPKD患者共58例,其中满足2年随访时间截点的患者共41例,随机分配至雷公藤多苷组和安慰剂组,雷公藤多苷组20例,安慰剂组21例。雷公藤多苷组给予患者雷公藤多苷1mg/Kg/d口服,分三次饭后服用;安慰剂组给予同等剂量的安慰剂,相同的给药方法。采集病史,每6个月行相关实验室指标的检查(血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血脂、尿蛋白、尿肌酐及尿蛋白肌酐比),利用磁共振成像技术(MRI)行双侧肾脏平扫,并利用手动测量分割法完成肾脏体积的测算。通过比较两组之间主要疗效指标肾脏总体积(total kidney volume,TKV)、次要疗效指标估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的变化来评估雷公藤多苷治疗ADPKD的疗效,通过两组之间血常规、肝功能、血脂等指标的变化及不良事件的发生来评估雷公藤多苷治疗ADPKD的安全性。
  结果:20例雷公藤多苷组患者中,剔除病例3人,脱落病例2人,21例安慰剂组患者中,剔除病例1人,脱落病例4人,故全分析集(full analysis set,FAS)和符合方案集(per protocol set,PPS)分别为37人和31人,安全分析集(safety set,SS)与FAS人数相同,为37人。在FAS中比较两组患者基线,两组患者在年龄、身高、体重、性别构成、是否合并有高血压病史、是否服用ACEI/ARB类药物、有无多囊肾病家族史,在肝功能、肾功能、血白细胞、血中性粒细胞比例、血红蛋白、血脂、尿蛋白谱均无统计学差异。雷公藤多苷组的基线血小板明显高于安慰剂组[(232.41±29.89)×109/L vs(204.40±45.49)×109/L,P=0.037],基线TKV明显高于安慰剂组(1876.83±763.44ml vs1296.18±589.97ml,P=0.016),htTKV也明显高于安慰剂组(1127.52±475.29ml/mvs759.14±342.80ml/m,P=0.013)。用t检验比较两组TKV及eGFR的首末变化率,两组之间无统计学差异。进一步用协方差分析校正基线血小板、基线TKV以及基线htTKV不一致给TKV变化率及eGFR变化率的影响,以基线血小板和基线TKV为协变量时,在PPS中发现基线血小板对于TKV变化率有影响,基线血小板水平与TKV增长呈负相关,但并未发现两组之间的TKV变化率存在差异;以基线血小板和基线htTKV为协变量时,在FAS即发现了血小板对于TKV变化率的影响,但未发现组间存在差异,在PPS则进一步证实了血小板越低,TKV增长越快,同时发现了雷公藤多苷组和安慰剂组存在差异,雷公藤多苷组的校正TKV变化率明显高低于安慰剂组(13.22±3.08%vs22.47±2.97%,P=0.049),此过程未发现基线TKV、基线htTKV对于TKV变化率有影响。FAS及PPS中基线血小板、基线TKV以及基线htTKV对于eGFR变化率无显著影响,校正基线差异后,两组之间的eGFR变化率无统计学差异。雷公藤多苷组发生的主要不良事件有感染、白细胞减少、月经紊乱等,与安慰剂组无统计学差异,血常规、肝功能、血脂等的首末变化值在两组之间无统计学差异。
  结论:雷公藤多苷有潜在的抑制ADPKD患者囊肿进展的作用,对肾功能无显著影响,用于ADPKD患者的治疗安全性良好。血小板减少可能与ADPKD患者囊肿体积增大相关,但有待于大样本研究证实。
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